【佳學基因檢測】基因檢測米勒管異常和高雄激素血癥的發(fā)病原因以阻斷遺傳
在一項旨在發(fā)找發(fā)病原因、阻斷遺傳的基因檢測研究中，生殖科基因檢測項目分析了4名患有Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser綜合征和高雄激素血癥的染色體型為46，XX的青春期女孩。基因檢測揭示患者體內的WNT4基因的分子分析揭示其具有一種新的基因突變（p.A233T）。功能研究顯示，類固醇生成酶的部分抑制（HSD3B2的正常抑制）與OVCAR3細胞系中CYP17A1酶的異常再表達形成對比。第四個新的WNT4突變證實了這種信號分子參與了卵巢中的米勒發(fā)育和雄激素生物合成抑制?；蚪獯a還發(fā)現，該突變體部分缺乏抑制卵巢類固醇生成酶的能力，17α-羥化酶表達異常。
查詢《生殖器官發(fā)育異?；驒z測》數據庫，記錄中存在三名攜帶 WNT4 基因雜合突變的少女。所有這些都顯示人類生殖科這一疾病與 Wnt4 敲除小鼠驚人相似的表型表現：苗勒管發(fā)育不全或與高雄激素血癥的臨床和/或生物學證據相關的發(fā)育不全。對基因檢測突變體的體外研究表明，這些蛋白質無法抑制 3β-羥基類固醇脫氫酶 2 (HSD3B2) 和 17α-羥化酶 (CYP17A1) 的表達，從而誘導雄激素過量產生，或穩(wěn)定 β-連環(huán)蛋白，導致子宮發(fā)育不全。
生殖科致病基因鑒定基因解碼基因檢測賊近開展了一項合作研究，該研究分析了 WNT4 基因是如何參與女性生殖道和性腺發(fā)育的。苗勒管發(fā)育不全基因檢測報告了四名青春期女孩的 WNT4 基因分析結果，這些女孩因存在原發(fā)性閉經和與正常 XX 核型和苗勒管缺陷相關的雄激素過多癥而轉診至兒科內分泌和婦科診所。在這四個女孩中，女性生殖障礙基因檢測項目組發(fā)現了一種新的 WNT4 突變，然后通過體外系統(tǒng)對類固醇生成酶抑制和 β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化進行了表征。體外實驗出人意料地揭示了這種新的 WNT4 突變體僅特異性地去抑制一些類固醇生成酶，這與之前鑒定的基因突變所產生的有效去抑制形成對比。
該項研究邀請機構審查委員會的參與并批準了這項研究，四名患者均提供了知情同意書。她們呈現與苗勒管異常和雄激素過多癥相關的正常 46,XX 核型?；颊?1 為 15 歲，患有子宮發(fā)育不全和嚴重的痤瘡。血漿睪酮 (pl-T) 和 DHEA 水平升高：分別為 2.4 nmol/L（正常 0.3-2 nmol/L）和 10.2 μmol/L（正常 1.3-6.8 μmol/L）。基礎 LH 水平高（12.2 UI/L；正常 1.5-6 UI/L），對 LHRH 測試的反應增加（LH 峰值 19 UI/L）。患者 2 為20 歲，超重（身高 165 厘米，體重 85 公斤）和多毛癥。 Pl-T (3.4 nmol/L) 和 DHEA (14.7 μmol/L) 升高。 LHRH 測試顯示高度升高，峰值為 75 UI/L。超聲檢查顯示子宮發(fā)育不全?；颊?3 為23 歲，患有與多毛癥和痤瘡相關的子宮發(fā)育不全，并且激素水平相同：高 pl-T（3.5 nmol/L）、雄烯二酮（14.1 nmol/L；正常 1.7-6.9）和 DHEA（9.15 μmol/ L)。患者 4年齡為17 歲，患有嚴重的痤瘡和面部和背部多毛癥?；A LH 水平增加（10.1 UI/L）。雄激素升高（pl-T：3.6 nmol/L；雄烯二酮：11.4 nmol/L；DHEA：7.0 μmol/L）。超聲檢查顯示子宮發(fā)育不全、左側異位卵巢、罕見卵泡和盆腔左側腎臟。
在從外周血白細胞中提取 DNA 并對 WNT4 基因的四個外顯子進行聚合酶鏈式反應 (PCR) 擴增后，生殖科基因檢測組進行了直接測序。 DNA 的基因檢測分析揭示了患者 1 中的新 WNT4 基因突變?；驒z測結果在 ORF 的 697 位發(fā)現了雜合的鳥嘌呤到腺嘌呤取代（c.697G> A），導致 WNT4 蛋白序列中的 p.A233T 取代.
WNT4 通過 WNT/β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定途徑專門參與兩性生殖道發(fā)育和雌性胚胎中性腺組織的分化。為了確定 WNT4 突變參與觀察到的子宮發(fā)育不全，女性生殖障礙基因檢測組轉染突變型、野生型 (WT) 或兩者的組合后量化了 OVCAR3 細胞核中的 β-連環(huán)蛋白。當突變體 p.A233T WNT4 在 OVCAR3 細胞中過表達時，β-連環(huán)蛋白的量顯著減少（P=0.0171）。在單獨用突變體 WNT4 或與等摩爾量的 WT 蛋白組合轉染的細胞中，來自這些細胞的核裂解物中的 β-連環(huán)蛋白的量減少。這表明信號通路減弱，因為經典 WNT 信號級聯(lián)的激活導致 β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定。實際上，雌性 Wnt4-null 小鼠不能發(fā)育苗勒管，而沃爾夫管是穩(wěn)定的。 WNT4 轉導機制通過 β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化發(fā)揮作用，其參與苗勒管的發(fā)育。 β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定化的體外研究證實了這種突變與人類苗勒管發(fā)育不全有關。在基因解碼過程中，WNT4 突變體不能穩(wěn)定 β-連環(huán)蛋白的表達，并且至少需要 3 倍過量的 WT 構建體來克服突變體效應。與其他報道的突變一樣，這表明 WNT4 p.A233T 突變體具有顯性負效應。
為了研究突變的功能意義，生殖科基因檢測研究組在人卵巢腺癌細胞系 NIH:OVCAR3 (ATCC HTB-161) 中表達了 WT 和突變體 WNT4 cDNA，并分析了 WNT4 變體對類固醇生成酶表達和活性的影響，如先前報道的那樣。 mRNA 水平分析（實時定量 PCR 和逆轉錄 PCR 定性 mRNA 測定）顯示 WT 對 CYP17A1 mRNA 有良好的抑制作用，但 p.A233T 突變的 WNT4 單獨或與 WT 組合沒有抑制作用。當分析 HSD3B2 時，觀察到這種 WT 對 mRNA 表達的抑制。令人驚訝的是，p.A233T WNT4 突變體能夠正確抑制 HSD3B2 mRNA 的表達。
然后通過測量轉染 WNT4 并以 100 nmol/L 孕烯醇酮作為前體后卵巢細胞培養(yǎng)基中分泌的類固醇的量來評估這些酶的活性。 WT WNT4 降低了 17-羥基孕酮 (17OHP)、DHEA 和雄烯二酮的含量。正如預期的那樣，突變體 p.A233T WNT4 未能減少 DHEA 的產生，而它仍然能夠減少 17OHP 和雄烯二酮的產生。為了證實對 mRNA 類固醇生成酶的部分抑制，生殖科基因檢測通過測量轉染 WT 或突變體 WNT4 和 100 nmol/L DHEA（測試 HSD3B2）或孕酮（測試CYP17A1）作為前體。該突變體能夠減少DHEA產生的雄烯二酮，而它失去了減少黃體酮產生17OHP的能力。
在 Wnt4 缺陷的雌性小鼠中，參與睪酮生物合成的兩種關鍵酶 3β-羥基類固醇脫氫酶和 CYP17A1 的過表達強烈支持卵巢的部分男性化。 WNT4 似乎阻止了胎兒卵巢中的 Leydig 細胞分化。關于先前報道的三例 WNT4 突變女孩，細胞內模型中 CYP17A1 和 HSD3B2 的不適當表達支持 WNT4 在類固醇生成酶表達中的抑制作用，這已通過臨床高雄激素血癥和受影響患者的血漿雄激素水平升高得到證實.然而，這里報道的病例與那三例與高雄激素血癥相關的非典型 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) 綜合征略有不同，因為 HSD3B2 的 mRNA 表達改變與 CYP17A1 不同。事實上，p.A233T WNT4 突變體不能抑制 CYP17A1 的表達，而 HSD3B2 的抑制作用得以維持。這是先進次觀察到 WNT4 突變體對特定類固醇生成酶的抑制作用?？傊?，這些數據表明 WNT4 突變導致雄激素合成酶的特定調節(jié)，并且表型數據可能與基因型相關。
其他三個具有相同表型（苗勒管發(fā)育不全和雄激素過多癥）的青春期女孩沒有 WNT4 突變強烈表明可能涉及 WNT4/β-連環(huán)蛋白信號通路的其他成分。已知 WNT 分泌的蛋白質與 Frizzled 家族的受體結合，啟動至少三個導致細胞行為基因表達調節(jié)和/或變化的細胞內途徑。經典途徑涉及來自低密度脂蛋白受體家族 (LRP6) 的輔助受體，并導致細胞內 β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定。 β-連環(huán)蛋白是一種多功能蛋白，可作為進入細胞核的轉錄調節(jié)因子。然而，它通過由腺瘤性結腸息肉 (APC) 和軸蛋白組成的復合物磷酸化后被泛素化迅速降解，這促進了酪蛋白激酶 1 和糖原合酶激酶 3 (GSK3) 對 β-連環(huán)蛋白的磷酸化。 WNT 蛋白與表面受體的結合導致蛋白質的活化，當蛋白質蓬亂時，反過來使破壞復合物失活，使 β-連環(huán)蛋白在細胞質中積累并進入細胞核。在沒有 WNT4 結合的情況下，不會發(fā)生 β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化，從而導致靶基因表達的改變。當未檢測到 WNT4 異常時，這種 WNT 信號通路的改變可能與 MRKH 綜合征的雄激素過多癥有關。 賊近的研究報告沒有 WNT4 基因突變，但這可能是因為招募了沒有高雄激素血癥臨床或生物學證據的患者。佳學基因重新審視了 MRKH 綜合征的分類和廣泛的 MRKH 亞型。與高雄激素血癥相關的非典型 MRKH 綜合征被認為屬于苗勒管發(fā)育不全的譜系。鑒于其非常典型的特征和 Biason-Lauber 工作所提供的進步，佳學基因建議將這種特殊的 MRKH 表型稱為 Biason-Lauber 綜合征
