【佳學(xué)基因檢測(cè)】基因檢測(cè)ARF 腫瘤抑制因子，知曉是否有腫瘤發(fā)生、是否會(huì)進(jìn)一步惡化？

基因檢測(cè)與靶向藥物導(dǎo)讀

P14ARF（ARF；替代閱讀框）是一種廣泛表征的腫瘤抑制因子，它響應(yīng)致癌刺激，通過 p53 依賴性和獨(dú)立途徑介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。ARF 已被證明在廣泛的人類惡性腫瘤（如結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌）中經(jīng)常通過 CpG 島啟動(dòng)子甲基化而丟失，而 p14ARF 基因座中的點(diǎn)突變和缺失與各種形式的黑色素瘤有關(guān)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。雖然 ARF 主要在腫瘤發(fā)生的背景下進(jìn)行研究，但它也涉及純粹的發(fā)育過程，如精子發(fā)生、乳腺和眼部發(fā)育，同時(shí)它還參與血管生成的調(diào)節(jié)。而且，已發(fā)現(xiàn) ARF 在干細(xì)胞自我更新和分化中起重要作用。與腫瘤抑制因子的情況一樣，ARF 作為一種多效性蛋白發(fā)揮作用，在發(fā)育和腫瘤發(fā)生的十字路口調(diào)節(jié)許多不同的機(jī)制。在這里，致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組通過剖析 ARF 信號(hào)傳導(dǎo)與關(guān)鍵致癌和發(fā)育途徑的串?dāng)_，概述 ARF 在癌癥和發(fā)育生物學(xué)中的非規(guī)范功能。

關(guān)鍵詞： ARF，抑癌基因，非典型功能，癌癥生物學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，Hippo通路，Wnt通路，Notch通路

1. 基因檢測(cè)與靶向藥物基礎(chǔ)知識(shí)：

在人類染色體 9p21 上發(fā)現(xiàn)的 CDKN2A 基因座編碼兩個(gè)重疊的轉(zhuǎn)錄本，它們產(chǎn)生兩種不同的蛋白質(zhì)，p16INK4a 和 p14ARF (ARF) ，它們都是已確定的腫瘤抑制因子。P16INK4a 和 ARF 不顯示序列同一性，并通過不同的途徑發(fā)揮作用。P16INK4a 通過抑制 Cyclin D-CDK4/6 復(fù)合物發(fā)揮作用，該復(fù)合物將 Rb 蛋白維持在其活性形式。另一方面，ARF 作為各種類型細(xì)胞應(yīng)激的傳感器，包括致癌、熱休克和氧化應(yīng)激，隨后在p53 依賴或獨(dú)立時(shí)尚。有趣的是，ARF 被認(rèn)為是 Rb 和 p53 途徑之間的中間環(huán)節(jié)，因?yàn)?Rb 失活導(dǎo)致 ARF 轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)而激活 p53 依賴性檢查點(diǎn) 。

早期關(guān)于 ARF 對(duì) DNA 損傷反應(yīng)的作用的研究最初忽略了它的貢獻(xiàn) ，主要是因?yàn)?p53 在沒有 ARF 的情況下仍然可以被激活，然而 ARF 會(huì)因致癌刺激而升高. 這些初步研究將 DNA 損傷和致癌反應(yīng)視為具有不同介質(zhì)和結(jié)果的獨(dú)立過程。然而，現(xiàn)在已知癌基因激活可以觸發(fā) ARF 信號(hào)傳導(dǎo)，很容易導(dǎo)致衰老和細(xì)胞周期停滯。重要的是，在 ARF 和 DNA 雙鏈斷裂傳感器 Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) 之間建立了聯(lián)系，這表明，在癌細(xì)胞發(fā)生基因毒性應(yīng)激后，ATM 會(huì)負(fù)調(diào)節(jié) ARF 蛋白水平。值得注意的是，ARF 也被證明在 DNA 單鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮作用。

關(guān)于其在癌癥生物學(xué)中的既定作用，ARF 被確定為在 DNA 損傷反應(yīng)后抵御癌癥的第二道防線，其激活可能需要更高的致癌信號(hào)閾值。ARF 還在核苷酸切除修復(fù) (NER) 途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，促進(jìn)紫外線誘導(dǎo)的 DNA 損傷的修復(fù) 。此外，還顯示 ARF 的缺失與 BRAF 突變協(xié)同作用，導(dǎo)致 BRAFV600E 小鼠中紫外線誘導(dǎo)的 DNA 損傷和黑色素瘤形成增加。盡管 ARF 以其在穩(wěn)定 p53 水平（包括突變 p53 的水平）中的作用而聞名，有趣的是，在某些肺癌、宮頸癌、淋巴瘤和癌細(xì)胞系（如 HeLa 和 H1299）中報(bào)告了 ARF 表達(dá)增加，并伴有 p53 失活。值得注意的是，在 ARF 上調(diào)的甲狀腺癌等腫瘤中，ARF 異常地發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中離域。另一方面，ARF 在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞粘附過程的細(xì)胞質(zhì)中的作用也已被假設(shè) ，從而進(jìn)一步了解 ARF 在癌癥中的多效性作用。

在大多數(shù)人類癌癥病例中，ARF 和 p16INK4a 都丟失了，因此很難確定它們對(duì)腫瘤抑制的個(gè)體貢獻(xiàn) 。在大約 30% 的人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)了完整的 CDKN2A 基因座的改變，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、腺癌和黑色素瘤。CDKN2A 基因座中染色質(zhì)重塑事件的鑒定最近開始描繪控制 ARF 和 p16INK4a 表達(dá)的遺傳機(jī)制。最近發(fā)現(xiàn)位于 ARF 啟動(dòng)子旁邊的順式元件通過長(zhǎng)程相互作用下調(diào) p16INK4a，從而為染色質(zhì)折疊促進(jìn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了一個(gè)明確的例子。

除了廣泛表征的 ARF 作為腫瘤進(jìn)展障礙的典型功能外，ARF 還涉及其他基本生物學(xué)過程，包括早期發(fā)育和形態(tài)發(fā)生。在這篇綜述中，致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組試圖通過強(qiáng)調(diào)腫瘤抑制和發(fā)育生物學(xué)之間的重要聯(lián)系來討論 ARF 生物學(xué)的非規(guī)范方面。致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組還旨在強(qiáng)調(diào) ARF 與調(diào)節(jié)癌癥和干細(xì)胞生物學(xué)主要方面的關(guān)鍵信號(hào)通路之間的相互作用。

2. ARF 在分化和形態(tài)發(fā)生中的作用

ARF 參與了許多調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和器官發(fā)育的過程，例如眼和乳腺發(fā)育、精子發(fā)生和血管生成。結(jié)果表明，由于初級(jí)玻璃體未有效成熟為次級(jí)玻璃體，Arf 基因敲除導(dǎo)致小鼠眼睛發(fā)育成沒有功能性晶狀體的小眼睛。ARF 表達(dá)是玻璃體血管系統(tǒng) (HVS) 退化所必需的，這是眼部發(fā)育的關(guān)鍵過程，在此期間 ARF 可防止覆蓋血管的壁細(xì)胞積聚，并通過血小板衍生生長(zhǎng)因子 (PDGF) 信號(hào)傳導(dǎo)維持血管穩(wěn)定性，獨(dú)立于p53 。ARF 還顯示通過 microRNA 誘導(dǎo)抑制 PDGF 受體合成。值得注意的是，Arf -/- 小鼠的表型與稱為持續(xù)性原發(fā)性玻璃體增生 (PHPV) 的人類先天性眼部疾病非常相似，其中患者還表現(xiàn)出小眼和晶狀體變性。

還發(fā)現(xiàn) ARF 可確定小鼠乳腺發(fā)育過程中細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡。p19ARF（小鼠中的 p14ARF 等效物）在整個(gè)妊娠期間的黃體酮依賴性調(diào)節(jié)導(dǎo)致 p19ARF 誘導(dǎo)，而 p19ARF 的缺失導(dǎo)致退化早期延遲并通過 p21 下調(diào)減少細(xì)胞凋亡。p19ARF 丟失的第二個(gè)影響似乎是乳腺上皮細(xì)胞的永生化。Yi等人的研究。(2004) 得出結(jié)論，盡管 p19ARF 對(duì)于乳腺分化可能是可有可無的，但它與黃體酮和 p21 的功能相互作用對(duì)于控制細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的平衡至關(guān)重要，可能以 p53 依賴性方式。

精子發(fā)生過程也被發(fā)現(xiàn)在 ARF 控制下，通過該過程，位于曲細(xì)精管基底膜上的精原細(xì)胞被觸發(fā)分化為精母細(xì)胞。鑒于 ARF 在體細(xì)胞中的抗增殖作用，ARF 在有絲分裂活躍的小鼠精原細(xì)胞中上調(diào)，而 Arf -/- 雄性小鼠在前期 I 顯示睪丸萎縮并伴有 p53 依賴性細(xì)胞凋亡（失巢凋亡），這是一個(gè)悖論。ATM 和 ARF 之間的功能聯(lián)系在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育中仍有待闡明，因?yàn)樵诰?xì)胞中發(fā)現(xiàn) ARF 水平因輻射而下調(diào) 。ARF 的關(guān)鍵作用也被證明在促進(jìn)導(dǎo)致精母細(xì)胞成熟的減數(shù)分裂方面。有趣的是，穆等人。(2014) 表明，精原干細(xì)胞自我更新依賴于 Polycomb-repressive complex 2 (PRC2)，通過其在有絲分裂和減數(shù)分裂生殖細(xì)胞中的活性，抑制體細(xì)胞特異性基因以促進(jìn) ARF 獨(dú)立機(jī)制中的精原細(xì)胞分化。

ARF 在大多數(shù)胎兒或年輕成年小鼠組織中不表達(dá)，但在胎兒卵黃囊中檢測(cè)到，這是一種源自胚外內(nèi)胚層 (ExEn) 的組織。ARF 失活延遲了源自胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的胚狀體中 ExEn 譜系的分化，但是，它不影響其他生殖細(xì)胞譜系的形成。結(jié)果表明，ARF 通過 p53 發(fā)揮作用以促進(jìn) ExEn 譜系的分化。

角質(zhì)形成細(xì)胞分化是涉及 ARF 信號(hào)傳導(dǎo)的另一個(gè)發(fā)育過程。研究發(fā)現(xiàn)，在人類角質(zhì)形成細(xì)胞分化的早期階段，p63 水平下調(diào)，而 ARF 水平升高，這可能是由于 ARF 介導(dǎo)的 p63 SUMO 化和隨后的失活。值得注意的是，伴隨 p63 缺失小鼠的嚴(yán)重皮膚和骨骼表型缺陷在 ARF 沉默后得到部分糾正，這表明在沒有 p63 的情況下，ARF 的異常上調(diào)可能與皮膚發(fā)育不相容。

除了在細(xì)胞成熟和器官發(fā)育中的作用外，ARF 還被證明在控制血管生成方面發(fā)揮著重要作用，這是一個(gè)涉及正常和病理?xiàng)l件的過程。川岸等人。(2010) 表明 ARF 通過小鼠細(xì)胞系中的 p53 途徑抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A (VEGFA) 的表達(dá) 。隨后在缺乏功能性 p53 表達(dá)的培養(yǎng)和異種移植的人類細(xì)胞系中進(jìn)行的研究表明，在 ATM 抑制后，ARF 和 VEGF 表達(dá)之間建立了反比關(guān)系。這些研究表明，在 p53 缺陷的背景下通過 ATM 抑制來穩(wěn)定 ARF 可能包括一種潛在的抗血管生成方法來對(duì)抗癌癥。與這些觀察結(jié)果一致，ARF 被證明可以阻止血管肉瘤的發(fā)展，可能以 p53 依賴性方式。此外，來自 Arf -/- 小鼠的腫瘤中 CD31 陽性細(xì)胞數(shù)量增加強(qiáng)烈表明新血管形成，而暴露于來自 Arf -/- 巨噬細(xì)胞旁分泌信號(hào)的內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出增加的流動(dòng)性，表明 ARF 缺乏促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和血管生成。

3. 干細(xì)胞生物學(xué)中的 ARF

CDKN2A 表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，隨后組織再生潛力下降。有人提出，在從干性到分化的轉(zhuǎn)變過程中，CDKN2A 基因座被重塑以對(duì)分化過程中出現(xiàn)的壓力和有絲分裂信號(hào)作出反應(yīng) 。組織的再生潛力取決于干細(xì)胞靜止和自我更新之間的平衡，這兩者都是與組織穩(wěn)態(tài)有關(guān)的關(guān)鍵過程。因此，干細(xì)胞衰竭被認(rèn)為是衰老的主要標(biāo)志。衰老的特征是慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的積累，伴隨著更高的腫瘤發(fā)生率。ARF/p53 通路在整個(gè)發(fā)育和出生后的生命中在多個(gè)組織中處于休眠狀態(tài)，從成年到老年，在廣泛的組織和物種中逐漸被激活。通過將人類 ARF 的調(diào)控和編碼序列引入斑馬魚基因組，結(jié)果表明 ARF 在截肢后的表皮鰭再生過程中增加，有助于抑制再生過程。然而，單獨(dú)抑制 ARF 不足以使再生。

ARF 有助于干細(xì)胞調(diào)節(jié)的一個(gè)主要機(jī)制是通過 p53 穩(wěn)定化。雖然 p53 活性降低與干細(xì)胞自我更新增加有關(guān)，但小鼠模型中 p53 過度活化導(dǎo)致再生潛力有限，這歸因于干細(xì)胞生態(tài)位的過早耗盡。因此，在 p53 突變小鼠模型中報(bào)道了造血干細(xì)胞 (HSC) 的消耗，并伴有造血功能受損、乳腺形態(tài)發(fā)生破壞、神經(jīng)干細(xì)胞池減少和嗅覺功能破壞，p53 突變小鼠模型具有比野生型對(duì)應(yīng)物更高的 p53 活性。與這些表型一致，通過 Mdm2 消融在小鼠表皮中誘導(dǎo) p53 導(dǎo)致干細(xì)胞活性受損和皮膚過早老化。相比之下，具有額外 Ink4a/Arf/p53 拷貝的小鼠表現(xiàn)出壽命延長(zhǎng)和衰老延遲，這與干細(xì)胞群的延長(zhǎng)保存有關(guān) 。因此，有人提出在衰老過程中適度和調(diào)節(jié) ARF/p53 通路的激活會(huì)產(chǎn)生較慢的增殖能力，這可能有助于干細(xì)胞靜止和改善干細(xì)胞衰老，同時(shí)防止干細(xì)胞群的衰竭。為了支持這一觀點(diǎn)，小鼠模型中 p53 或 p21 的缺失導(dǎo)致干細(xì)胞庫在高齡時(shí)退出靜止?fàn)顟B(tài)和長(zhǎng)期耗盡。

polycomb 組基因 BMI1 是許多器官中成體干細(xì)胞維持所必需的，被發(fā)現(xiàn)通過 CDKN2A 基因座調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和衰老。雅各布斯等人。（1999 年）證明，在 Bmi1 缺陷型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和早衰淋巴細(xì)胞中，p16INK4a 和 p19ARF 的表達(dá)均顯著增加，而 Bmi1 過表達(dá)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞永生化和 p16INK4A 和 p19ARF 水平降低。Cdkn2a 基因座的消耗顯著挽救了在 Bmi1 缺陷小鼠中觀察到的表型，使 Cdkn2a 在體內(nèi) Bmi1 靶標(biāo)中變得至關(guān)重要。根據(jù)這一觀察結(jié)果，另外還顯示 Bmi1 抑制 Ink4a/Arf 和 Hox 基因以允許嚙齒動(dòng)物中的干細(xì)胞自我更新。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)了先前報(bào)道的 Bmi1 和 Cdkn2a 基因座之間的聯(lián)系，因?yàn)樗C明了 Bmi1 缺陷型先天樣 B 淋巴細(xì)胞自我更新能力的降低可以通過額外刪除 Cdkn2a 基因座來挽救。

4. 主要信號(hào)通路的 ARF 串?dāng)_

除了作為腫瘤抑制因子的典型功能外，還發(fā)現(xiàn) ARF 和 ARF/p53 通路直接或間接參與其他關(guān)鍵信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，這些通路在發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起重要作用。ARF 信號(hào)傳導(dǎo)的那些非典型功能是通過 ARF 與其他通路成分或效應(yīng)器之間的各種類型的相互作用來確定的。

4.1。河馬途徑

Hippo 通路是一種進(jìn)化上保守的信號(hào)通路，可主動(dòng)控制器官生長(zhǎng)發(fā)育、組織再生和上皮穩(wěn)態(tài)。其中一些功能是通過末端效應(yīng)器 YAP 和 TAZ 引發(fā)的，它們通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來指導(dǎo)基因表達(dá) 。失調(diào)的 Hippo 通路與各種疾病有關(guān)，包括腫瘤發(fā)生，使其成分成為有希望的治療靶點(diǎn)。在絕大多數(shù)散發(fā)性人類惡性腫瘤中表觀遺傳沉默的腫瘤抑制因子 RASSF1A 是 Hippo 通路的上游調(diào)節(jié)因子，以促增殖 YAP-TEAD 復(fù)合物為代價(jià)驅(qū)動(dòng)促凋亡 YAP-p73 復(fù)合物的形成。最近發(fā)現(xiàn) RASSF1A 還充當(dāng)植入前小鼠胚胎、小鼠胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 從多能性向分化轉(zhuǎn)變所需的“分子開關(guān)”。

ARF 先前已被證明可以穩(wěn)定前列腺癌中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 標(biāo)志物 SLUG ，同時(shí)它還通過基質(zhì)金屬蛋白酶 7 (MMP7) 核易位調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。當(dāng)在 Pten/p53-null 小鼠中發(fā)現(xiàn) ARF 和 YAP 共同升高時(shí)，發(fā)現(xiàn)了 Hippo 通路和 ARF 之間的潛在串?dāng)_ 。隨后的工作表明，ARF 可能會(huì)解除對(duì)人類前列腺癌細(xì)胞中 Hippo 和 Wnt 通路的調(diào)節(jié) 。從機(jī)制上講，ARF 被證明通過穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì) YAP 并防止其核積累來解除對(duì) Hippo 途徑的調(diào)節(jié)，這可能是通過 ARF 介導(dǎo)的 YAP SUMOylation。茶衍生的碳納米點(diǎn)與核 ARF 相互作用以使其穩(wěn)定，從而有助于 YAP 細(xì)胞質(zhì)滯留，從而為靶向核 YAP 復(fù)合物的促增殖作用提供了潛在途徑。

Forkhead Box (Fox) m1b (FOXM1) 轉(zhuǎn)錄因子是肝細(xì)胞癌 (HCC) 發(fā)展所必需的，它包含一個(gè)抑制性 ARF 靶標(biāo) ?？ɡ崆倏频热?。(2004) 證明含有 9 個(gè) D-Arg 的 p19ARF 肽足以抑制 Foxm1 轉(zhuǎn)錄和 Foxm1 依賴性骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，使 (D-Arg)9-p19ARF 26-44 肽成為腫瘤發(fā)生中潛在的 FOXM1 抑制劑。有趣的是，癌癥中的 Hippo 通路失調(diào)已被證明通過 YAP-TEAD 依賴性 FOXM1 轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng) FOXM1 激活，而 FOXM1 還直接與靶基因啟動(dòng)子上的 TEAD 相互作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)展。重要的是，藥理學(xué) FOXM1 抑制限制了體內(nèi)腫瘤的大小，這意味著 FOXM1 可以潛在地作為肉瘤的治療靶點(diǎn) 。

Hippo 通路和 ARF 信號(hào)傳導(dǎo)之間的另一個(gè)潛在聯(lián)系可能源于 RASSF1A 支架蛋白已被證明可以抑制 MDM2，類似于 ARF 。RASSF1A 通過破壞細(xì)胞核中的 MDM2-DAXX-HAUSP 復(fù)合物來促進(jìn) MDM2 自泛素化和 p53 穩(wěn)定化。雖然 MDM2 上的 RASSF1A 結(jié)合區(qū)不同于 ARF 結(jié)合區(qū) ，但 E1A 調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子 E4F1 可以與 ARF 和 RASSF1A 物理相互作用，表明 RASSF1A 可能參與 ARF-MDM2 的總體調(diào)控。除了參與 p53 穩(wěn)定化之外，RASSF1A 還涉及 p53 介導(dǎo)的檢查點(diǎn)激活以響應(yīng) DNA 損傷。有趣的是，RASSF1A 被發(fā)現(xiàn)在 DNA 損傷時(shí)被 ATM 直接激活，從而通過 p73 為 Hippo 途徑提供促凋亡作用，而 ATM 被證明可以抑制 ARF 。鑒于 RASSF1A 積極參與 YAP-p73 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，ATM 抑制 ARF 可能是細(xì)胞用來防止 ARF 介導(dǎo)的 YAP 失活的機(jī)制，至少在 p53 缺陷型腫瘤的情況下是有意義的情景。

4.2. Wnt通路

Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)是所有動(dòng)物整個(gè)發(fā)育和成年生活中生物過程的主要調(diào)節(jié)器。異常 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)是人類多種病理狀況的基礎(chǔ)，包括癌癥。Wnt 信號(hào)級(jí)聯(lián)通過依賴 β-catenin 的基因調(diào)控發(fā)揮其功能，是維持干細(xì)胞自我更新的重要參與者。Wnt 級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵成分的突變導(dǎo)致各種癌癥的發(fā)展，例如黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌和肝癌。由于 Wnt 通路主要參與干性的調(diào)節(jié)，因此 Wnt 通路激活在患者衍生的類器官形成中起著關(guān)鍵作用，因?yàn)樗言诮Y(jié)腸、肺和皮膚等多種組織中得到證實(shí). Hippo 通路支架 RASSF1A 的失活被發(fā)現(xiàn)是 Wnt 和 Hippo 通路串?dāng)_導(dǎo)致多能性維持所必需的，而 RASSF1A 使 Wnt 與 Hippo 信號(hào)傳導(dǎo)分離，以使干細(xì)胞和胚胎通過 p73 向所有細(xì)胞譜系分化。

p14ARF、RASSF1A 和 APC1A 基因的 DNA 啟動(dòng)子甲基化被認(rèn)為是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。具有甲基化 p14ARF 啟動(dòng)子的患者預(yù)后顯著更差，并且來自上述集合的一個(gè)或多個(gè)基因的同時(shí)甲基化與預(yù)后不良有關(guān)，而與腫瘤分期和分化狀態(tài)無關(guān)，這表明所涉及的途徑可能協(xié)同促進(jìn)致癌進(jìn)展和干細(xì)胞調(diào)節(jié) (圖1）。

圖1:Hippo、Wnt 和 ARF/p53 信號(hào)通路在發(fā)育和腫瘤發(fā)生中的相互作用。Hippo 通路支架 RASSF1A 被 ATM 介導(dǎo)的磷酸化激活。雖然 ATM 抑制 ARF ，但 RASSF1A 和 ARF 都可以防止 MDM2 介導(dǎo)的 p53 降解。RASSF1A 激活導(dǎo)致形成穩(wěn)定的 YAP-p73 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而驅(qū)動(dòng)干細(xì)胞分化和凋亡。在沒有 RASSF1A 的情況下，YAP-TEAD 復(fù)合物通過基因轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖，例如FOXM1。FOXM1 被 ARF 抑制。ARF 還抑制 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo) ，它在激活后會(huì)破壞 β-連環(huán)蛋白破壞復(fù)合物的穩(wěn)定性，導(dǎo)致 β-連環(huán)蛋白核易位和 TCF/LEF 介導(dǎo)的癌基因轉(zhuǎn)錄，例如TBX3。TBX3 抑制 ARF 以促進(jìn)致癌增殖。

有趣的是，發(fā)現(xiàn) Wnt 通路通過激活 CDKN2A 基因座來限制胚胎干細(xì)胞的自我更新。Wnt 效應(yīng)子 Tcf1 被募集到小鼠胚胎干細(xì)胞 (mESC) 的 Cdkn2a 基因座，在那里它觸發(fā) p16INK4a 和 p19ARF 的轉(zhuǎn)錄，它們充當(dāng)細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)劑，從而降低增殖率而不影響多能狀態(tài)細(xì)胞。mESC 中 Wnt 通路的抗增殖作用與其在體細(xì)胞中記錄的促有絲分裂作用形成對(duì)比。

達(dá)馬拉斯等人。(2001) 表明組成型活性 β-連環(huán)蛋白能夠在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo) ARF/p53 依賴性生長(zhǎng)停滯和衰老樣表型；然而，在沒有 ARF 或 p53 的情況下，β-連環(huán)蛋白與 Ras 合作引發(fā)致癌轉(zhuǎn)化。盡管證明了 β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的 ARF 激活和 p53 的穩(wěn)定，Damalas 等人的研究。沒有顯示隨后的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。其他研究表明，β-連環(huán)蛋白可能激活存活途徑以抑制 ARF/p53 途徑的促凋亡作用。

為了識(shí)別 ARF 信號(hào)傳導(dǎo)的下游靶點(diǎn)，在人類黑色素瘤細(xì)胞系中使用野生型或突變型 ARF 蛋白進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。對(duì)野生型和突變型 ARF 細(xì)胞系之間差異表達(dá)基因的通路分析表明，Wnt 通路成分可能作用于 ARF 信號(hào)傳導(dǎo)的下游，當(dāng) ARF 活性受損時(shí)有助于腫瘤的發(fā)展。與此一致，觀察到 ARF 和 Sprouty RTK 信號(hào)拮抗劑 4 (SPRY4) 之間的反比關(guān)系，SPRY4 是 Wnt 信號(hào)的進(jìn)化上保守的下游靶標(biāo)，因?yàn)樵跊]有 ARF 的情況下 SPRY4 水平增加。此外，TBX3 也被確定為 Wnt 通路的下游靶標(biāo)和 β-連環(huán)蛋白依賴性增殖和肝腫瘤發(fā)生中存活的關(guān)鍵介質(zhì) ，在抑制 ARF 表達(dá)的乳腺癌中也被發(fā)現(xiàn)上調(diào)通過與組蛋白脫乙酰酶相互作用。值得注意的是，HDAC 抑制劑的使用能夠以劑量依賴性方式挽救 TBX3 介導(dǎo)的 ARF 抑制，從而為破壞 Wnt 介導(dǎo)的 ARF 抑制提供潛在的治療窗口。

在 Wnt1 依賴性小鼠乳腺癌模型中證實(shí)了 p19ARF 而不是 p16INK4a 明顯參與了腫瘤逃避生長(zhǎng)限制（如化療）的過程。為了確定指導(dǎo)腫瘤逃逸的遺傳決定因素，采用了轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其中通過阻斷強(qiáng)力霉素依賴性 Wnt1 轉(zhuǎn)基因表達(dá)來模擬靶向化療。通過重新激活 Wnt 通路觀察到腫瘤逃逸。然而，影響 p16INK4a 和 p19ARF 表達(dá)的 Cdkn2a 缺失導(dǎo)致具有 EMT 特征的腫瘤反復(fù)，而不會(huì)重新激活 Wnt 通路。有趣的是，僅 p19ARF 缺失就能夠使 EMT 驅(qū)動(dòng)的腫瘤快速逃逸，而 p16INK4a 缺乏未能加速反復(fù)，這表明無論 Wnt 通路激活如何，失調(diào)的 ARF/p53 信號(hào)傳導(dǎo)都可能促進(jìn)乳腺癌反復(fù) 。

Cdkn2ab 基因敲除小鼠缺乏三個(gè)閱讀框（p15INK4b、p19ARF 和 p16INK4a），比 Cdkn2a -/- 小鼠發(fā)展出更廣譜的腫瘤，皮膚癌的比例更高。最近表明，Wnt7b 129P2 等位基因足以通過 CDK6 活性促進(jìn) Cdkn2ab -/- 細(xì)胞系的致癌轉(zhuǎn)化，CDK6 活性是一種已確定的 Wnt 靶標(biāo) 。Krimpenfort 等人最近的研究。（2019 年）表明，p15INK4b 活性的喪失（通過控制 Wnt 介導(dǎo)的 CDK6 活化在毛囊細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用）可能導(dǎo)致異常的祖細(xì)胞遷移和增殖。由于 p16INK4a 和 p19ARF 對(duì)響應(yīng)這些致癌信號(hào)的細(xì)胞構(gòu)成屏障，因此 p16INK4a 和 p19ARF 的伴隨缺失可能是皮膚腫瘤發(fā)生的易感性。

4.3. NOTCH途徑

高度保守的 Notch 信號(hào)通路在各種情況下運(yùn)行，其結(jié)果可能大相徑庭。Notch 是一種細(xì)胞表面受體，由單個(gè)多肽鏈的細(xì)胞內(nèi)蛋白水解切割形成，其兩個(gè)衍生亞基經(jīng)歷二聚化并轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜。在與 Notch 配體（Delta/Jagged 家族成員）結(jié)合后，Notch 受體被 ADAM 蛋白酶在細(xì)胞外切割，而由 γ-分泌酶進(jìn)行的細(xì)胞內(nèi)切割導(dǎo)致 Notch 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 (NICD) 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，其中它進(jìn)入細(xì)胞核以調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。Notch 通路激活可導(dǎo)致不同的結(jié)果，具體取決于細(xì)胞類型和發(fā)育階段，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)它可促進(jìn)分化、干細(xì)胞維持或腫瘤發(fā)生，具體取決于每種情況下部署的靶基因集。因此，外部信號(hào)可能對(duì)于導(dǎo)航 Notch 活動(dòng)很重要。

T 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病 (T-ALL) 的兩個(gè)標(biāo)志是異常的 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)和 CDKN2A 基因座的缺失。有趣的是，已經(jīng)表明 Notch1 的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)е?T 細(xì)胞中的 Arf 激活，作為一種腫瘤抑制機(jī)制。然而，Arf 表達(dá)伴隨著對(duì) T-ALL 中 Cdkn2a 基因座缺失的強(qiáng)烈選擇壓力，從而導(dǎo)致克隆的存活繞過腫瘤抑制。隨后的研究表明，Cdkn2a 基因座在培養(yǎng)的 T-ALL 起始細(xì)胞中是表觀遺傳沉默的。然而，在異常 Notch1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化的 T 細(xì)胞前體中，Cdkn2a 基因座的表觀遺傳沉默被逆轉(zhuǎn)。這使得 Arf 表達(dá)成為可能，并再次為 Cdkn2a 缺失的克隆的存活提供選擇壓力。因此，Cdkn2a 的表觀遺傳狀態(tài)調(diào)節(jié) T 細(xì)胞成熟的發(fā)育階段，其中 Notch1 功能異常和 Cdkn2a 失活促進(jìn) T-ALL 。

LIM-only 轉(zhuǎn)錄因子 (LMO2) 基因在 T 細(xì)胞腫瘤中發(fā)生染色體易位，導(dǎo)致大約 9% 的 T-ALL 病例中 LMO2 表達(dá)異常增加。在鼠 T 細(xì)胞惡性腫瘤中，Arf 失活促進(jìn)胸腺細(xì)胞自我更新，并為侵襲性腫瘤的出現(xiàn)奠定了基礎(chǔ) 。Arf 啟動(dòng)子不直接被 Lmo2 或 Notch 占據(jù)，這意味著 Notch 激活可能是 T 細(xì)胞腫瘤發(fā)生的后續(xù)事件，并且 Lmo2 誘導(dǎo)功能與 Arf 丟失一起促進(jìn)原始胸腺細(xì)胞自我更新。重要的是，異常的 Notch 激活和 Arf 沉默獨(dú)立地與 Lmo2 上調(diào)合作以誘導(dǎo) T-ALL 。同樣，Lmo2 誘導(dǎo)促進(jìn)從 Cdkn2a -/- 小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表型的獲得。有趣的是，與 ARF 在抑制血管生成中的作用保持一致，Lmo2 能夠在 Cdkn2a -/- 背景中誘導(dǎo)血管生成。

Notch 和 ARF 信號(hào)通路之間的一個(gè)關(guān)鍵功能聯(lián)系是 Polycomb 組基因 BMI1，它通過抑制 CDKN2A 基因座積極促進(jìn)細(xì)胞增殖和干細(xì)胞自我更新 (圖 2）。已發(fā)現(xiàn) BMI1 是下游 Notch 靶標(biāo)，其在小鼠腸道干細(xì)胞 (ISC) 中的損失伴隨著 ISC 區(qū)室增殖減少、p16INK4a/p19ARF 積累和向模仿 Notch 功能喪失的杯狀譜系分化表型。布魯格曼等人。（2005 年）試圖探索 p16INK4a 或 p19ARF 是否對(duì)引發(fā) Bmi1 活性更為關(guān)鍵，并證明雖然 p19ARF 包含一個(gè)通用的 Bmi1 靶標(biāo)，但 p16INK4a 去抑制僅在細(xì)胞類型的一個(gè)子集中起作用，例如神經(jīng)干細(xì)胞，對(duì)于Bmi1 -/- 表型的表現(xiàn) 。研究結(jié)果表明 p16INK4a 與 p19ARF 在 Bmi-1 介導(dǎo)的細(xì)胞周期控制中的不同細(xì)胞類型特異性功能。值得注意的是，BMI1 也被證明可以獨(dú)立于 ARF 促進(jìn)人類肝癌的腫瘤發(fā)生。BMI1 的致瘤活性似乎也獨(dú)立于人類卵巢癌細(xì)胞中的 ARF 信號(hào)傳導(dǎo)，其中遺傳或藥理學(xué) BMI1 抑制會(huì)損害克隆生長(zhǎng)而不影響 CDKN2A 基因座的表達(dá)或 ARF 蛋白穩(wěn)定性。所提出的機(jī)制涉及通過 ATP 消耗誘導(dǎo)自噬，因?yàn)?BMI1 的靶向觸發(fā)了 PINK1-PARK2 依賴性線粒體途徑，從而導(dǎo)致壞死性凋亡。

圖 2:Notch 和 ARF/p53 信號(hào)通路之間的相互作用。Notch 是一種跨膜受體，在被 γ-分泌酶切割后，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 (NICD)，該胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 (NICD) 能夠轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核并直接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。BMI1 被 Notch 激活以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和干細(xì)胞自我更新，尤其是在神經(jīng)組織中。Notch 和 Bmi1 都直接占據(jù) Arf 啟動(dòng)子以抑制 Arf 表達(dá) ，從而擾亂 Arf 介導(dǎo)的 p53 穩(wěn)定化。

另外據(jù)報(bào)道，Notch 通過抑制 Arf 表達(dá)來抑制小鼠 T 細(xì)胞淋巴瘤形成中的 p53，而 p53 在 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)受到 γ-分泌酶抑制劑的干擾時(shí)被激活。隨后的一項(xiàng)研究表明，Notch 通過直接占據(jù) Arf 啟動(dòng)子來抑制 Arf，其中 Polycomb 抑制復(fù)合物 2 (PRC2) 以 LSD1 依賴性方式被募集，允許組蛋白修飾最終終止 Arf 轉(zhuǎn)錄(圖 2) 。相反，Notch 刺激已被證明可激活肌肉干細(xì)胞中的 p53，從而通過 Hey 轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)肌肉再生。然而，在老年動(dòng)物中觀察到 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)延遲，導(dǎo)致 p53 抑制獨(dú)立于 p16INK4a 或 p19ARF，從而導(dǎo)致肌肉細(xì)胞再生潛力的下降。

5. 討論

ARF 是一種腫瘤抑制蛋白，在腫瘤發(fā)生的重要方面具有確定的作用，例如 DNA 損傷反應(yīng)。除了眾所周知的 p53 穩(wěn)定劑功能外，ARF 還與 p53 非依賴性機(jī)制有關(guān)，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。有趣的是，在某些腫瘤類型中也發(fā)現(xiàn) ARF 信號(hào)上調(diào)，例如在伯基特淋巴瘤或大多數(shù) p53 突變腫瘤中。為了最終確定 ARF 信號(hào)傳導(dǎo)的影響，ARF 仍需要與 p16 分開研究，因?yàn)?CDKN2A 基因座的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本似乎在神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和分化等過程中具有不同的作用。

在這篇綜述中，致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組試圖總結(jié)關(guān)于 ARF 信號(hào)在癌癥和發(fā)育生物學(xué)中的非典型作用的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)。此外，鑒于發(fā)育和腫瘤發(fā)生通常受類似機(jī)制控制，致癌基因與抑癌基因在腫瘤發(fā)生與的遺傳中的影響重大課題研究組概述了單獨(dú)的 ARF 或 ARF/p53 通路與主要信號(hào)通路之間的串?dāng)_，在這兩種情況下都具有關(guān)鍵作用。積累的證據(jù)表明，ARF 是一種多效性蛋白，根據(jù)細(xì)胞類型、發(fā)育階段和突變負(fù)荷，具有不同的調(diào)節(jié)因子和相互作用因子。通過強(qiáng)調(diào) ARF 和其他通路成分之間的相互作用，重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程之間可能會(huì)出現(xiàn)新的聯(lián)系，從而為探索旨在糾正發(fā)育缺陷和限制腫瘤生長(zhǎng)的新治療方法提供可能性。例如，，或觀察到 Notch 信號(hào)與人類腫瘤（如肺和乳腺）中的 RASSF1A 表達(dá)負(fù)相關(guān) ，結(jié)合 RASSF1A 和 ARF 介導(dǎo)的 p53 調(diào)節(jié)，提供了 RASSF1A–值得探索的 ARF。沿著這些思路，Notch 轉(zhuǎn)錄靶標(biāo) BMI1 是發(fā)育過程中 ARF 表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子，已知對(duì)阿爾茨海默病等退行性疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用。因此，Notch-BMI1-ARF 軸構(gòu)成了該領(lǐng)域的一個(gè)重要臨床靶點(diǎn)，可以潛在地進(jìn)行治療利用。

Non-Canonical Functions of the ARF Tumor Suppressor in Development and Tumorigenesis.

Lagopati N, Belogiannis K, Angelopoulou A, Papaspyropoulos A, Gorgoulis V.

Biomolecules. 2021 Jan 12;11(1):86. doi: 10.3390/biom11010086.

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)

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