【佳學(xué)基因檢測(cè)】Sanger測(cè)序與CMA在腎臟疾病診斷檢測(cè)中的應(yīng)用

診斷性基因檢測(cè)旨在確定導(dǎo)致個(gè)體患者疾病的突變，但人類基因組中豐富的變異使這項(xiàng)任務(wù)變得困難。典型的人類基因組包含約30億個(gè)DNA核苷酸，其中約2000萬(wàn)個(gè)核苷酸可能會(huì)發(fā)生改變，而不會(huì)對(duì)個(gè)人健康造成重大后果， 約20000個(gè)基因，其中近4000個(gè)與人類疾病有關(guān)。序列變化可能發(fā)生在任何核苷酸位點(diǎn)，包括單核苷酸變異（SNV）、小于5–10 bp（INDEL）的小插入或缺失以及結(jié)構(gòu)變異。鑒于典型人類基因組中存在大量罕見的、經(jīng)過預(yù)測(cè)具有破壞性效果的基因突變，將疾病的基因突變?cè)驓w結(jié)到錯(cuò)誤的基因變異序列上的風(fēng)險(xiǎn)。因此，診斷性基因檢測(cè)的一個(gè)主要困難是確定哪些基因突變是致病突變。根據(jù)《臨床基因檢測(cè)技術(shù)大全》，診斷性基因檢測(cè)所采用的方式主包括Sanger測(cè)序、CMA和NGS方法。其中NGS測(cè)序基因檢測(cè)又包括靶向基因測(cè)序基因檢測(cè)包、全外顯子組測(cè)序（WES）和全基因組測(cè)序（WGS）。

桑格爾測(cè)序（Sanger測(cè)序）

Sanger測(cè)序在檢測(cè)致病性SNV和<5–10bp的插入或缺失方面很有效。因此，當(dāng)所需要檢測(cè)的腎臟疾病是單基因疾病時(shí)，這種檢測(cè)方法仍然是腎臟疾病分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也是確認(rèn)NGS基因檢測(cè)結(jié)果的方法。桑格測(cè)序還可用于對(duì)NGS測(cè)不敏感的基因組區(qū)域，如高度重復(fù)、同源或富含鳥嘌呤胞嘧啶（GC）的區(qū)域的檢測(cè)。然而，由于桑格測(cè)序僅限于<1000 bp的單個(gè)DNA片段。這種方式無(wú)法檢測(cè)更大的結(jié)構(gòu)變異，并且隨著候選基因數(shù)量的增加，成本越來越高，時(shí)間效率也越來越低，限制了其在具有復(fù)雜基因源因的疾病的診斷性檢測(cè)。
 

染色體微陣列基因檢測(cè)

染色體微陣列技術(shù)（CMA）介紹

從歷史上看，對(duì)基因組疾病（即由結(jié)構(gòu)變異引起的遺傳疾病）的檢測(cè)需要用到核型分析分析技術(shù)，核型分析可以檢測(cè)染色體疾病、易位和其他大型基因組失衡。然而，許多基因組疾病是由拷貝數(shù)變異（CNV）引起的，所涉及的變異大于低于1–2MB。這個(gè)變異低于核型分析所能檢測(cè)的靈敏度。CMA技術(shù)可以檢測(cè)小的和大的CNV基因突變。
 

臨床上的CMA主要有兩種形式，即陣列比較基因組雜交和單核苷酸多態(tài)性陣列。這兩種技術(shù)都提供了極好的全基因組覆蓋率，并在臨床相關(guān)區(qū)域有豐富的探針，以實(shí)現(xiàn)單外顯子水平的分辨率。由于這種高分辨率，CMA對(duì)智力殘疾、自閉癥和多發(fā)性先天性異常的診斷率比核型分析高出10倍，現(xiàn)在被推薦為這些疾病的一線基因檢測(cè)方法。然而，與核型分析不同，CMAs無(wú)法檢測(cè)平衡的染色體重排或低程度嵌合體，并且對(duì)某些區(qū)域的變化（如假基因和重復(fù)元素）的靈敏度有限。此外，CMA通常只能將CNV的邊界解析為~1–2 kb，這妨礙了正確確定其大小和所影響的基因，這是診斷性CNV基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行解釋的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)。因此，需要根據(jù)所使用的特定CMA平臺(tái)的覆蓋范圍和對(duì)基因組疾病的臨床懷疑強(qiáng)度來解釋研究結(jié)果。
 

染色體微陣列技術(shù)的應(yīng)用

先天性腎和尿路異常（CAKUT）是小兒腎病的主要原因，可單獨(dú)出現(xiàn),也可以或作為多器官綜合征的一部分出現(xiàn)。CMA已被證明是綜合征性CAKUT患者的有效一線診斷工具，也可能適用于非綜合征形式的患者。例如，一項(xiàng)對(duì)522名腎發(fā)育不良兒童的研究發(fā)現(xiàn)，在380名孤立性泌尿生殖系統(tǒng)異?；颊咧校?5名（14.5%）患者的CNV是在已知基因組疾病中致病性基因突變。在迄今為止發(fā)表的所有研究中，約4-10%的CAKUT患者中發(fā)現(xiàn)了致病性CNV，并且在腎實(shí)質(zhì)缺損患者中，基因組中也肯有較多的CNV基因突變，是高達(dá)10%的患者的發(fā)病原因。這些研究在腎病兒童中發(fā)現(xiàn)了40多種不同的基因組疾病。常見的綜合征包括17q12缺失（人類在線孟德爾遺傳（OMIM）614527）、22q11.2（OMIM 188400）和16p11.2位點(diǎn)（OMIM 611913）的缺失。此外對(duì)419名患有全因慢性腎?。–KD）的兒童隊(duì)列進(jìn)行的CMA基因檢測(cè)，在7.4%的患者中檢測(cè)到診斷性CNVs基因突變。診斷率與已確定的發(fā)育延遲或產(chǎn)前檢查指標(biāo)一致。 重要的是，所研究的大多數(shù)患者在轉(zhuǎn)到兒科腎病或泌尿科進(jìn)行常規(guī)臨床檢查之彰并且之前沒有被診斷出患有綜合征形式的疾病，這突出了說明了才用常規(guī)臨床診斷手段提前發(fā)現(xiàn)遺傳性綜合征的難度。 在許多情況下，對(duì)基因組疾病的診斷會(huì)對(duì)患者所罹患的疾病進(jìn)行重新歸類，這對(duì)后續(xù)的臨床管理具有重要意義。此外，這些疾病通常具有多方面的的影響，包括代謝、骨骼和神經(jīng)并發(fā)癥。在沒有將不同征狀歸結(jié)同一個(gè)基因原因的的情況下，可能會(huì)引發(fā)長(zhǎng)戎、多種不必要的檢查?；蛘?，這種臨床病征被被錯(cuò)誤地歸結(jié)于繼發(fā)性腎功能不全，結(jié)果即使在經(jīng)過適當(dāng)?shù)哪I臟治療后仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)緩解疾病。例如，腎病兒童出現(xiàn)不良神經(jīng)認(rèn)知結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)增加，但這種風(fēng)險(xiǎn)常常被認(rèn)為是治療腎病時(shí)產(chǎn)生的心理社會(huì)負(fù)擔(dān)。然而，一項(xiàng)對(duì)CKD兒童的研究表明，認(rèn)知能力受到損害與腎臟疾病的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，患有基因組疾病的兒童神經(jīng)認(rèn)知能力較差。這些發(fā)現(xiàn)表明，在一些患者中，神經(jīng)認(rèn)知缺陷是由損害腎臟和神經(jīng)精神功能的基因組疾病引起的。因此，CMA有可能解釋看似不同的臨床特征，確定治療預(yù)期，并指導(dǎo)治療方法。 雖然需要進(jìn)一步的基因解碼研究來全面確定成年腎病患者中基因組疾病的患病率和CMA基因檢測(cè)的適應(yīng)癥，但上述兒童研究結(jié)果強(qiáng)烈支持其作為兒童腎病診斷評(píng)估的一線工具的實(shí)用性。
 

下一代測(cè)序Next-generation sequencing

NGS利用靶向捕獲和大規(guī)模并行測(cè)序同時(shí)評(píng)估選 定的基因組區(qū)域 的基因突變，從而實(shí)現(xiàn)快速、經(jīng)濟(jì)高效的大規(guī)模基因檢測(cè)分析。所選區(qū)域可以是多個(gè)感興趣的基因 （使用靶向NGS基因檢測(cè)包進(jìn)行檢測(cè)分析）、所有蛋白質(zhì)編碼區(qū)（使用WES進(jìn)行檢測(cè)）或者是對(duì)編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩者都 進(jìn)行檢測(cè)（使用WGS進(jìn)行分析）。在當(dāng)前的臨床基因檢測(cè)環(huán)境中，每種NGS方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)賊佳檢測(cè)方法的選擇正在迅速發(fā)展，反映在基因檢測(cè) 技術(shù)的掌握能力、對(duì)成本效益的估算，并根據(jù)病 人和病人的具體情況來決定。隨著測(cè)序的技術(shù)費(fèi)用穩(wěn)步下降，對(duì)基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析解釋成為決定一個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)能力高低的重要方面。對(duì)大量基因突變時(shí)行分析實(shí)踐中的主要困難。