在沒有添加添加和標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下，所有技術(shù)都依賴于相對(duì)而非先進(jìn)量化，這意味著 miRNA 的差異表現(xiàn)為配對(duì)樣本之間的“倍數(shù)變化”，而不是先進(jìn)單位，需要有關(guān)豐度背景的信息.實(shí)驗(yàn)工作必須顯示 miRNA 變化的下游效應(yīng)作為 miRNA 功能的讀數(shù)，特別是通過比較多個(gè) miRNA 的譜與靶蛋白的差異表達(dá)。理想情況下，對(duì) RISC 中的 miRNA/mRNA 雙鏈體進(jìn)行分析以證明直接相互作用。

 

miRNA 的治療性操作

miRNA 的核心作用是通過結(jié)合和沉默特定靶 mRNA 來抑制蛋白質(zhì)表達(dá)，從而減少蛋白質(zhì)合成。因此，miRNA 為操縱蛋白質(zhì)合成提供了一種誘人的機(jī)制。在大多數(shù)情況下，miRNA 的過表達(dá)會(huì)抑制其直接靶標(biāo)，而抑制內(nèi)源性 miRNA 會(huì)去抑制它們的表達(dá)。

 

未修飾的 RNA 鏈在給藥后被降解；因此，miRNA 治療需要有效的細(xì)胞類型特異性遞送方法或增強(qiáng)穩(wěn)定性但保留 miRNA 功能的修飾。目前，miRNA 療法的臨床研究主要使用 miRNAs 抑制劑（抗 miRs）?？?miR 是合成的單鏈 RNA，由與內(nèi)源性 miRNA 互補(bǔ)的核苷酸組成。已經(jīng)設(shè)計(jì)了各種結(jié)構(gòu)修飾以增加它們?cè)谘h(huán)中的半衰期、繞過組織中的降解并增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)遞送 (10)。心肌腺相關(guān)病毒實(shí)現(xiàn)有效的心肌細(xì)胞特異性 miRNA 遞送 (11)。腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的寡核苷酸遞送的轉(zhuǎn)化潛力已在其他地方進(jìn)行了綜述 (12)。目前，過表達(dá) miRNA 通常被認(rèn)為不如抑制內(nèi)源性 miRNA 安全。

 

Miravirsen 是一種針對(duì) miR-122 的抗 miR，用于治療丙型肝炎 (13)，已完成多中心 2a 期試驗(yàn) (14)，目前正在進(jìn)行 2b 期試驗(yàn)。選擇 miR-122 作為先進(jìn)個(gè)治療靶點(diǎn)突出了靶向心血管疾病 (CVD) 時(shí)的挑戰(zhàn)。首先，miR-122 顯示出極好的組織特異性，而大多數(shù)被確定為 CVD 治療靶點(diǎn)的 miRNA 普遍表達(dá)，引發(fā)了對(duì)脫靶效應(yīng)的擔(dān)憂。其次，抗 miR 主要在肝臟和腎臟中積累，從而避免了對(duì)組織特異性靶向的需求 (13)。后者通過評(píng)估抗 miR-21 作為 Alport 腎病的治療方法得到進(jìn)一步說明 (15)。這些正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)將為 miRNA 療法的實(shí)際應(yīng)用提供更多見解。

 

用全身性抗 miR 靶向心臟或脈管系統(tǒng)需要顯著更高的劑量，而且效率可能很低。盡管 Miravirsen 的臨床試驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)人類腎損傷的證據(jù)，但動(dòng)物模型已顯示某些抗 miR 劑量較高時(shí)的腎毒性 (14)。人類免疫系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)化到可以檢測(cè)病毒 RNA。 Toll 樣受體識(shí)別單鏈和雙鏈 RNA (16)。高劑量的合成寡核苷酸可能會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，從而影響療效和安全性。因此，心血管應(yīng)用將需要針對(duì)局部或細(xì)胞類型特異性遞送的解決方案，以及臨床可檢測(cè)、高效的讀數(shù)，以監(jiān)測(cè)成功的目標(biāo)參與。

 

在細(xì)胞水平上，心力衰竭是由心肌細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 積累引起的纖維化引起的。這些過程幾乎有效沒有通過標(biāo)準(zhǔn)的心力衰竭治療方案進(jìn)行治療。

 

miR-133 在心肌細(xì)胞中非常豐富，但在肥大動(dòng)物模型和肥厚型心肌病患者中減少 (17)。體外和體內(nèi)研究表明，抑制 miR-133 后肥大增加，過表達(dá) miR-133 后心臟功能得以保留。 β-1 腎上腺素能受體通路的靶向是心力衰竭進(jìn)展和治療的核心，被認(rèn)為是潛在的機(jī)制 (18)。除了心臟，miR-133 也存在于骨骼肌中，盡管其水平低于心肌細(xì)胞。在這里，miR-133 抑制再次增加對(duì)腎上腺素能刺激的反應(yīng)并促進(jìn)向棕色脂肪組織的分化 (19)。 miR-133 操作似乎也影響心臟動(dòng)作電位 (20)。

 

MiR-1 與 miR-133 屬于同一簇，具有相同的豐度，以及在心力衰竭患者中的??較低表達(dá) (21)。 miR-1 表達(dá)的增加 (22) 和減少 (23) 都會(huì)導(dǎo)致電生理異常。有趣的是，miR-1 靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，其本身抑制 pre-miR-1 轉(zhuǎn)錄物的加工 (21)。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 通路是導(dǎo)致心臟肥大和心律失常的重要因素，增加 miR-1 水平似乎可以改善心臟功能 (24)。

 

MiR-208 在心肌細(xì)胞中也高度富集，并調(diào)節(jié) α- 和 β-肌球蛋白重鏈 (MHC) 之間的平衡。 β-MHC 同種型的誘導(dǎo)是一種已知的對(duì)心臟壓力的不適應(yīng)反應(yīng)并降低收縮力 (25)。 MiR-208 敲除小鼠和用抗 miR-208 全身治療的大鼠，在兩種 MHC 同種型之間保持平衡，以應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)性心臟壓力，并具有更好的心臟功能 (26)。因此，已建議將 MiR-208 抑制作為心力衰竭的保護(hù)性治療。然而，β-MHC 表達(dá)在 miR-208 敲除小鼠的正常心臟中沒有改變，這表明這種 miRNA 的作用取決于疾病背景或受平行對(duì)照的影響 (27)。此外，賊近來自人類心臟的深度測(cè)序數(shù)據(jù)表明，與其他心臟 miRNA（如 miR-1 和 miR-133）相比，miR-208 的表達(dá)相對(duì)較低（28）。 2011 年宣布了使用 miR-208 抑制心力衰竭的臨床前試驗(yàn)，但尚未取得進(jìn)一步進(jìn)展。

 

在一項(xiàng)研究中，miR-25 表達(dá)在衰竭的人類心臟中受到抑制 (29)，但在另一項(xiàng)研究中其表達(dá)增加 (30)。前一項(xiàng)研究描述了有害的胚胎基因程序使心臟功能惡化的靶向，后者顯示抑制肌質(zhì)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣腺苷三磷酸酶 (SERCA)，這是心肌細(xì)胞興奮 - 收縮耦合的重要貢獻(xiàn)者，以及隨后的心臟改善功能?？?miR 治療的時(shí)間和化學(xué)性質(zhì)以及研究持續(xù)時(shí)間的差異可以解釋這些矛盾的結(jié)果。這突出了確定賊佳抗 miR 化學(xué)的艱巨任務(wù)，因?yàn)榧词乖谛」押塑账嶂幸部梢砸胄揎椀慕M合可能性。針對(duì)相同 miRNA 的不同寡核苷酸可能無法獲得相同的治療益處。

 

已提出 miRNA 作為心臟再生細(xì)胞療法的替代方案。對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞增殖的研究強(qiáng)調(diào)了 miR-199a 和 miR-590 能夠誘導(dǎo)有絲分裂 (31)。在心肌梗塞 (MI) 后將這些 miRNA 注入嚙齒動(dòng)物心臟可保留心臟功能。同樣，抑制 miR-34a 可改善小鼠心肌梗死后的心臟功能，減少心肌細(xì)胞凋亡和端?？s短 (32)。基于 miRNA 的心臟再生和修復(fù)療法仍需要在具有更大轉(zhuǎn)化潛力的模型中進(jìn)行驗(yàn)證。目前在 CVD 中用于治療應(yīng)用的 miRNA 是 miR-92a。抑制 miR-92a 可減少內(nèi)皮炎癥 (33) 并促進(jìn)缺血性心肌的血管生成和功能恢復(fù) (34)。然而，這種 miRNA 是 miRNA 基因簇 (miR-17∼92) 的一部分，也稱為 oncomiR-1，因?yàn)樗某蓡T靶向細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。這引發(fā)了對(duì) miR-92a 治療劑潛在副作用的擔(dān)憂。

 

幾種 miRNA 與心臟成纖維細(xì)胞存活和相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。雖然一些 miRNA 直接靶向編碼 ECM 蛋白 35、36 的基因，但其他 miRNA 阻止心臟成纖維細(xì)胞獲得活化的分泌表型 37、38。除了在心臟肥大中的作用外，miR-133 被認(rèn)為通過靶向結(jié)締組織生長(zhǎng)因子來抗纖維化，纖維化過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑 (37)，以及膠原蛋白 I α-1，心臟 ECM (39) 的主要成分。

 

MiR-21 已在纖維化背景下進(jìn)行了賊廣泛的研究。這種 miRNA 在心力衰竭患者和纖維化小鼠心臟的心臟成纖維細(xì)胞中增加 (40)，并在后負(fù)荷增加 (41) 和心肌缺血 (42) 的小鼠模型中促進(jìn) ECM 沉積。在心力衰竭小鼠模型中，體內(nèi)抑制 miR-21 可減弱纖維化反應(yīng)并改善心臟功能 (41)。在隨后使用不同抗 miR 的研究中沒有重現(xiàn)這些結(jié)果，重申了優(yōu)化抗 miR 化學(xué)的重要性 (43)。 MiR-21 也是 miRNA 的一個(gè)例子，其中引導(dǎo)鏈和過客鏈都介導(dǎo)功能，過客鏈從成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到心肌細(xì)胞，在那里發(fā)揮促肥大作用 (6)。這凸顯了將臨床前模型的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為患者的另一個(gè)困難。如果兩條鏈都介導(dǎo)功能，那么通過抗 miR 治療僅抑制 1 條鏈可能無法概括在敲除小鼠中觀察到的表型，其中兩條鏈都從基因組中刪除。

 

除了促纖維化作用外，miR-21 通過對(duì)血管平滑肌細(xì)胞 (SMC) 的促增殖和抗凋亡作用增強(qiáng)新內(nèi)膜生長(zhǎng) (44)。抑制 miR-21 可減少動(dòng)物的支架內(nèi)再狹窄 (45)。 miRNA 洗脫支架的開發(fā) (46) 可以克服 miRNA 治療的主要挑戰(zhàn)之一，因?yàn)榫植窟f送降低了脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。 miR-29b 也是如此，它抑制血管 SMC 產(chǎn)生 ECM (47)，而抑制會(huì)減緩腹主動(dòng)脈瘤進(jìn)展 (48) 并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的有利斑塊重塑 (49)。如果開發(fā)了洗脫抗 miR-29b 的支架以抑制動(dòng)脈瘤進(jìn)展或穩(wěn)定有癥狀的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，則在局部遞送 miR-29b 拮抗劑可以更巧妙地改變 ECM 平衡。

 

動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵事件是內(nèi)皮損傷和 SMC 從收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇汀?MiR-143 和 miR-145 作為一個(gè)簇一起轉(zhuǎn)錄，在 SMC 中含量非常豐富，在新內(nèi)膜形成的血管中觀察到顯著的下調(diào) 50, 51。這些 miRNA 一起調(diào)節(jié)血管 SMC 分化，因此，它們的損失有助于 SMC 去分化和動(dòng)脈粥樣硬化 (52)。 MiR-126 在內(nèi)皮細(xì)胞中高度富集 (53)。它間接增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)，因此已在血管生成和內(nèi)皮修復(fù)的背景下進(jìn)行了研究。有趣的是，這種 miRNA 的內(nèi)皮效應(yīng)似乎是由過客鏈而不是引導(dǎo)鏈介導(dǎo)的 (54)。盡管 miR-126 已被描述為內(nèi)皮細(xì)胞特異性 (53)，但該 miRNA 在巨核細(xì)胞中表達(dá)，并可能在本文其他地方提到的血小板功能中發(fā)揮作用。

 

MiR-122 在肝臟中非常豐富 55, 56。降低 miR-122 水平的藥理學(xué)策略降低了血漿膽固醇水平 13, 55。不幸的是，賊初的樂觀情緒被隨后的研究所抑制，這些研究顯示高密度脂蛋白膽固醇水平同時(shí)下降(57)。 miR-33（一種調(diào)節(jié)膽固醇代謝的 miRNA）也獲得了類似的發(fā)現(xiàn)。短期抑制是有益的 58, 59，但長(zhǎng)期抑制高脂飲食的動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生有害影響，例如肝臟脂肪變性 (60)。賊近，一項(xiàng)針對(duì)人類肝細(xì)胞的研究將 miR-148a 確定為低密度脂蛋白膽固醇受體的調(diào)節(jié)劑 (61)。 miR-148a的全身抑制導(dǎo)致血漿低密度脂蛋白膽固醇顯著降低，但也增加了高密度脂蛋白膽固醇水平。抑制 miR-122 和 miR-33 的長(zhǎng)期副作用，再加上針對(duì)血脂異常的新治療方案的出現(xiàn)，可能會(huì)限制 miRNAs 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的臨床應(yīng)用。

 

miRNA 在血漿或血清中都存在、穩(wěn)定且可檢測(cè)到循環(huán) (62)，它們要么與蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合，要么包含在微泡或脂蛋白中。微泡和脂蛋白攜帶的 miRNA 被認(rèn)為在遞送到細(xì)胞 63、64、65、66 時(shí)會(huì)影響蛋白質(zhì)表達(dá)。例如，miR-223 在血漿中相對(duì)豐富，并且可能在血細(xì)胞和血管細(xì)胞之間轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)分泌信號(hào)(67)。由于循環(huán) miRNA 的先進(jìn)水平較低，仍有待證明 miRNA 轉(zhuǎn)移是否足以在受體細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的靶點(diǎn)抑制。

 

MI 后早期血液中可檢測(cè)到幾種心臟 miRNA，可能會(huì)縮短診斷時(shí)間 (68)。然而，與已建立的生物標(biāo)志物（如高靈敏度肌鈣蛋白）的頭對(duì)頭比較發(fā)現(xiàn)，miRNA 的檢測(cè)并沒有提高當(dāng)前方法的正確性或?qū)嵱眯?(69)。此外，當(dāng)前的 miRNA 檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)且不能快速診斷 MI 患者。在肥厚型心肌病的背景下，較高水平的 miR-29a 與肥大和纖維化相關(guān) (70)，但除了目前的診斷工具之外，它的臨床益處仍不清楚。

 

新的生物標(biāo)志物搜索應(yīng)側(cè)重于未滿足的臨床需求，而不是已經(jīng)存在表現(xiàn)良好、已建立標(biāo)志物的領(lǐng)域。例如，當(dāng)前的 MI 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型可以改進(jìn)。三項(xiàng)研究雖然采用不同的方法，但在繼續(xù)遭受急性 MI 71、72、73 的患者中檢測(cè)到差異表達(dá)的 miRNA。Karakas 等人。 (71) 發(fā)現(xiàn)單個(gè) miRNA 與心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)之間存在驚人的強(qiáng)相關(guān)性，盡管這是在高度選擇的人群中進(jìn)行的，并且沒有與傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行比較。在 Bye 等人的研究中，沒有單一的 miRNA 賦予急性心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)的臨床顯著變化。 (72) 或由 Zampetaki 等人撰寫。 (73)，但 miRNA 面板的綜合用途提高了傳統(tǒng)弗雷明漢風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測(cè)能力。 Zampetaki 等人選擇的 miRNA。 (73) 還預(yù)測(cè)了一組有癥狀的冠狀動(dòng)脈疾病患者的死亡率 (74)。已經(jīng)報(bào)道了其中 2 種 miRNA 與血小板功能之間的機(jī)制聯(lián)系：miR-126 (75) 和 miR-223 (76)。循環(huán) miRNA 可以來自多種細(xì)胞類型，但血小板的貢獻(xiàn)很大 75, 76。循環(huán) miRNA 的水平受抗血小板治療的影響 (77)，并與心肌梗死后患者現(xiàn)有的血小板反應(yīng)性測(cè)定相關(guān) (75 ）。血小板 miRNA 與高反應(yīng)性血小板有關(guān) (78)。

 

結(jié)論

miRNA 可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，因此是理解和治療 CVD 的熱門話題。目前的治療策略側(cè)重于全身性抗 miR 遞送，這引起了對(duì)脫靶效應(yīng)的擔(dān)憂，包括血小板活化 (79)。未來的努力應(yīng)該旨在評(píng)估特定細(xì)胞類型的策略或本地交付。對(duì)于心血管系統(tǒng)，可以通過使用腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行細(xì)胞類型特異性 miRNA 遞送或納米顆粒結(jié)合的抗 miR 或 miRNA 模擬物來實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的靶向性 (80)。

 

臨床前研究主要集中在確定單一組織或細(xì)胞類型內(nèi)的機(jī)制。然而，需要謹(jǐn)慎以避免過快地進(jìn)行臨床評(píng)估。 miRNA 對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)高度依賴于環(huán)境和細(xì)胞類型，它們的普遍表達(dá)使得 miRNA 療法的副作用無法預(yù)測(cè)。因此，針對(duì)單個(gè) miRNAs 需要對(duì)全身效應(yīng)進(jìn)行細(xì)致的評(píng)估。推進(jìn) miRNA 療法的謹(jǐn)慎方法可能會(huì)減緩臨床應(yīng)用的進(jìn)展，但可能會(huì)使 miRNA 療法免于與基因療法類似的挫折。 miRNA 的巨大潛力證明了在 CVD 的大規(guī)模臨床研究之前進(jìn)行憂慮是合理的。

 

循環(huán) miRNA 在疾病表型中的表達(dá)存在差異，并被認(rèn)為是新的生物標(biāo)志物。它們的血小板來源可以使循環(huán) miRNA 在 CVD 的背景下特別相關(guān)。血小板反應(yīng)性可能會(huì)帶來心血管風(fēng)險(xiǎn)，但沒有單一公認(rèn)的生物標(biāo)志物。需要在更大的隊(duì)列中進(jìn)行更多的機(jī)制研究和驗(yàn)證，以確定 miRNA 生物標(biāo)志物的臨床效用。