【佳學(xué)基因檢測(cè)】易栓癥基因檢測(cè)：一個(gè)家庭受益的案例

資深臨床醫(yī)師如何看待易栓癥基因檢測(cè)？

血栓癥就是高血栓形成傾向。血栓形成傾向是一種多因素疾病，涉及環(huán)境因素和遺傳因素。通過(guò)基因解碼所明確的導(dǎo)致血栓形成傾向相關(guān)先天性疾病傾向的因素包括抗凝血酶缺乏、蛋白C和蛋白S缺乏、凝血因子V Leiden突變、凝血酶原異常和抗磷脂綜合征。心血管疾病致病基因鑒定基因解碼揭示了在中國(guó)的一個(gè)家庭中，編碼凝血因子II（即凝血酶）的F2基因突變與血栓形成傾向風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)，該家庭中有四名成員（I-2、II-2、II-3和III-1）有深靜脈血栓栓塞史。致病基因鑒定基因解碼通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和計(jì)算機(jī)斷層血管造影術(shù)對(duì)該家庭的疾病進(jìn)行了評(píng)估。為了確定導(dǎo)致血栓形成傾向風(fēng)險(xiǎn)增加的基因原因及該病的遺傳力，采用全外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)兩名患者（II-2和III-1）進(jìn)行了分析。在兩名受影響個(gè)體中分別觀察到的2222和2203個(gè)遺傳變異中，經(jīng)篩選和Sanger測(cè)序確認(rèn)后，發(fā)現(xiàn)了一種外顯子錯(cuò)義F2突變T165M（NM_000506:c.C494T:p.T165M;rs5896）。I-2、II-3和III-1與先證者（患者II-2）都具有這一突變，而II-6則為該突變的雜合子形式。在正常對(duì)照組中未檢測(cè)到這種有害突變。本基因檢測(cè)項(xiàng)目明確了家族成員患病的共同原因，結(jié)合生相關(guān)生育技術(shù)可以阻斷該病在家族中的傳播。

易栓癥的基因解碼

易栓癥是高度血栓形成傾向。基因解碼揭示其是一種血液凝固障礙，以易于形成血栓為特點(diǎn)，并導(dǎo)致不良血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)增加，包括深靜脈血栓栓塞（DVT）和肺栓塞（PE）。血栓形成傾向的風(fēng)險(xiǎn)因素包括遺傳和環(huán)境原因。已有的基因解碼表明，血栓形成傾向是由蛋白質(zhì)分化或功能缺陷引起的，包括蛋白質(zhì)C和S的缺乏，以及已確定的約8種人類基因突變作為致病原因。然而，血栓形成傾向的遺傳原因在基因解碼的基礎(chǔ)上得以進(jìn)一 步增加。一名52歲的漢族男性因反復(fù)性DVT被轉(zhuǎn)診至佳學(xué)基因合作醫(yī)療機(jī)構(gòu)，其新穎因DVT住院發(fā)生在2001年。經(jīng)過(guò)治療后，患者康復(fù)。2003年，該患者因PE再次入院，并在人民醫(yī)院置入下腔靜脈濾器以防止進(jìn)一步的PE。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）血管造影術(shù)，患者的疾病被診斷為血栓癥。分析了可能參與其疾病發(fā)生的因素。為了調(diào)查可能的潛在原因，采用了全外顯子組測(cè)序（WES）技術(shù)及基因解碼來(lái)排除疾病發(fā)生的基因原因，并鑒定出F2基因的突變。未檢測(cè)到凝血因子V Leiden突變或凝血酶原G20210A突變。

F2基因位于染色體區(qū)域11p11-q12，跨越20.3kb。該基因轉(zhuǎn)錄并翻譯成凝血因子II，即凝血酶（462個(gè)氨基酸），它參與人類血液凝固的賊后階段并控制凝血酶原的合成。F2突變導(dǎo)致各種形式的血栓形成和凝血酶原異常。

佳學(xué)基因檢測(cè)在患病家族的同意下，招募了一個(gè)患有血栓形成傾向的漢族家庭。該家庭包括11名健在成員（包括先證者及受影響個(gè)體II-3、III-1），并選取了100名正常的漢族獻(xiàn)血者作為對(duì)照。正常獻(xiàn)血者的年齡范圍（35至60歲）和性別比例（50名男性，50名女性）與患有該疾病的II-2、II-3、III-1患者的選擇相匹配，且他們的年齡分別為52歲、50歲和32歲。血栓形成傾向的診斷基于典型的臨床和實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果，并通過(guò)CT血管造影術(shù)（CTA）進(jìn)行確認(rèn)。從所有研究參與者中采集抗凝管中的外周血，并按照標(biāo)準(zhǔn)程序，使用酚-氯仿法從家庭成員和正常獻(xiàn)血者的白細(xì)胞中提取基因組DNA。

圖１：受試者的計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影圖像。箭頭表示下腔靜脈濾器。

全外顯子組測(cè)序（全外顯子測(cè)序）

利用全外顯子組測(cè)序（WES）技術(shù)對(duì)先證者及其兒子（III-1）的DNA進(jìn)行測(cè)序。對(duì)約26,000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)對(duì)具有血栓癥（血檢形成傾向）患者和健康個(gè)體的基因突變序列進(jìn)行比對(duì)。使用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0試劑盒（Roche Diagnostics，美國(guó)印第安納波利斯）捕獲每個(gè)樣本的編碼序列，并將每個(gè)捕獲的文庫(kù)加載到Solexa Hiseq2000平臺(tái)（Illumina，美國(guó)圣地亞哥）上進(jìn)行序列分析。使用Covaris S2系統(tǒng)（Covaris Inc.，美國(guó)馬薩諸塞州沃本市）對(duì)兩名受影響個(gè)體的基因組DNA樣本進(jìn)行片段化。然后將DNA Library Prep Reagent Set（New England Biolabs Inc.，美國(guó)）中的接頭連接到所得片段的兩端。通過(guò)連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增捕獲的片段，隨后進(jìn)行測(cè)序。
 

突變序列定位與基因解碼分析

參與者的全外顯子組測(cè)序（WES）是從血液中提取的基因組DNA進(jìn)行的，并通過(guò)佳學(xué)基因高通量基因測(cè)序及基因解碼平對(duì)啊進(jìn)行分析。使用Burrows-Wheeler Aligner將所有的測(cè)序的區(qū)域定位到與人類參考基因組。使用SOAPsnp軟件包和SOAP denovo分別檢測(cè)合并BAM文件中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）以及插入或缺失（indels）。（http://www.soap.genomics.org.cn/soapsnp.html）。

候選SNP的篩選與標(biāo)記

使用以下分析參數(shù)對(duì)候選SNP進(jìn)行篩選和標(biāo)記：i) SNP質(zhì)量得分大于20；ii) 測(cè)序深度不低于4倍；iii) 兩個(gè)SNP之間的距離大于5個(gè)堿基對(duì)；iv) 估計(jì)的拷貝數(shù)小于2。

圖2：先證者的計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影圖像顯示了肝硬化和脾腫大。（紅色箭頭指示先證者的肝腫塊，白色箭頭指示脾臟）。

候選基因驗(yàn)證

候選突變通過(guò)高通量測(cè)序獲得后，佳學(xué)基因進(jìn)一步采用諾貝爾獲獎(jiǎng)技術(shù)Sanger測(cè)序驗(yàn)證WES的高效性，以確認(rèn)候選基因的突變。使用的PCR引物為正向5′-TGTGAACATCACCCGGTCAG-3′和反向5′-GACTGACGCCAGCTCTGAAG-3′，設(shè)計(jì)用于驗(yàn)證T165M基因中的候選突變。結(jié)果與WES識(shí)別的候選突變一致。此外，還通過(guò)以下方法驗(yàn)證了WES結(jié)果的高效性：i) 家族內(nèi)驗(yàn)證，在每個(gè)家庭成員的基因組中觀察到表型和基因型的共分離突變；ii) 在100名正常獻(xiàn)血者中進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)在正常獻(xiàn)血者中未觀察到表型和基因型的共分離突變。此外，使用ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）對(duì)凝血因子II的跨物種氨基酸進(jìn)行了比較。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取F2的氨基酸序列，然后輸入到ClustalW2中。ClustalW2的結(jié)果顯示了所選序列的賊合適匹配，并以一種易于識(shí)別和理解的方式對(duì)齊了它們的同一性、相似性和差異性。

基因解碼結(jié)果找到了家族中血栓傾向患者的臨床特征

已知增加血栓事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的遺傳因素包括蛋白C和蛋白S缺乏。此外，因子V Leiden和凝血酶原G20210A突變、因子VIII、IX或XI水平升高、同型半胱氨酸和纖維蛋白原也可能是血栓事件的危險(xiǎn)因素。通過(guò)佳學(xué)基因合作醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和CT血管造影，證實(shí)了患者的易栓癥的臨床診斷。分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、一期凝血試驗(yàn)和單克隆抗因子X(jué)I捕獲抗體測(cè)定因子VIII、IX和XI的水平。采用多克隆酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定蛋白C和蛋白S，采用STAGO自動(dòng)凝血儀進(jìn)行凝血研究。患者的凝血因子及蛋白C和S水平均正常。然而，先證者及其他受累家族成員的纖維蛋白原水平異常。觀察到他們的活化部分凝血活酶時(shí)間和血漿凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)。血漿免疫反應(yīng)性纖維蛋白原水平也較低。
 

全外顯子組測(cè)序確定F2為候選基因

對(duì)先證者及其兒子（II-2和III-1）的外顯子組進(jìn)行了捕獲和測(cè)序。按照之前描述的測(cè)序和過(guò)濾步驟后，為兩名受累個(gè)體確定了候選變異體?？傮w而言，外顯子組實(shí)現(xiàn)了高覆蓋率，為兩名受累個(gè)體分別產(chǎn)生了9300萬(wàn)和9900萬(wàn)條測(cè)序讀段，分別覆蓋了73億和74億個(gè)堿基。其中，約90.7%的讀段與人類參考基因組比對(duì)成功，60.5%的讀段落在靶向和富集的外顯子上。靶向外顯子的平均測(cè)序深度為84倍。在該家族的兩名受累個(gè)體中，分別鑒定出101,037和97,227個(gè)遺傳變異，包括非同義突變、剪接受體和剪接供體位點(diǎn)變異以及插入/缺失（indels）。此外，這些II-2和III-1的變異體還通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）dbSNP構(gòu)建版132（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）、SIFT（http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html.）和PolyPhen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)估。SIFT和PolyPhen2程序用于蛋白質(zhì)分析，其應(yīng)用過(guò)程符合之前描述的分析方案。經(jīng)過(guò)這一過(guò)濾步驟后，僅在候選區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)變異體（NM_000506:c.C494T:p.T165M;rs5896）。該變異體是一個(gè)之前在其他漢族人群研究中未被觀察到的純合子錯(cuò)義突變，但在新疆哈薩克族人群中，該變異體被報(bào)道為與血栓傾向相關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。

Sanger測(cè)序

為了驗(yàn)證全外顯子組測(cè)序（WES）的結(jié)果，采用Sanger測(cè)序分析了該家族中F2基因的候選突變（T165M）。結(jié)果顯示，Sanger測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了候選變異體（T165M）的存在，排除了假陽(yáng)性的可能性。多方法驗(yàn)證，高效了檢測(cè)結(jié)果的正確性。

圖3： 一個(gè)患有血栓傾向（thrombophilia）的家族的家系圖

T165M的為什么是致病基因？基因解碼進(jìn)一步明確

根據(jù)《人體致病基因集及其結(jié)構(gòu)功能分析》，F(xiàn)2的結(jié)構(gòu)與人類凝血酶原相似。受影響的氨基酸（T165M）位于第6外顯子，導(dǎo)致第165位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?。先前的研究已揭示，?外顯子及其側(cè)翼區(qū)域具有高度多態(tài)性。然而，通過(guò)ClustalW2將受影響的人、小鼠、猩猩、兔子、大鼠、牛、綿羊、馬、豬、熱帶爪蟾和黑猩猩基因組中的氨基酸序列及其側(cè)翼區(qū)域（殘基145-185）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)T165M位于F2的一個(gè)高度保守區(qū)域內(nèi)。進(jìn)一步說(shuō)明該基因序列的正常對(duì)健康維護(hù)的重要性。

易栓癥基因檢測(cè)的重要意義

在易栓癥的致病基因查找及其遺傳性的分析判定中，采用CT血管造影和臨床試驗(yàn)對(duì)家族內(nèi)的血栓傾向進(jìn)行了診斷。CT血管造影已成為評(píng)估深靜脈血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）的有用診斷成像方法，且比其他成像方式更為有效，特別是對(duì)于縱隔和實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)的評(píng)估。能夠可視化先證者體內(nèi)下腔靜脈濾器的位置、脾腫大和肝硬化。實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果可能表明該家族血栓傾向風(fēng)險(xiǎn)增加的根本原因。值得注意的是，在先證者中未檢測(cè)到因子V Leiden和凝血酶原G20210A突變。潛在原因可能是血液凝固成分異常，這可能影響凝血酶介導(dǎo)的機(jī)制以及凝血和抗凝過(guò)程。

易栓癥致病基因鑒定基因解碼利用全外顯子組測(cè)序（WES）技術(shù)發(fā)現(xiàn)了這一家庭可能的F2變異體與血栓傾向潛在分子機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)，并揭示T165M突變是疾病發(fā)生的原因，其遺傳性遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律?；蚪獯a進(jìn)一步明確，如果家族成員是變異的雜合子基因型不會(huì)形成血栓癥，而純合子具有血栓形成高風(fēng)險(xiǎn)。