【基因解碼】粘多糖病Ⅰ型基因矯正的研究和應(yīng)用

遺傳病、罕見病基因檢測(cè)導(dǎo)讀：

基因矯正技術(shù)是一種定向基因編輯技術(shù)。粘多糖病是一種溶酶體酶代謝性疾病。不同的患者可能具有類似的表型但是具有不同的致病基因。而基因矯正需要通過基因解碼正確地發(fā)現(xiàn)明確的致病基因位點(diǎn)后，從基因根源上進(jìn)行矯正治療的方法。

粘多糖病I型及溶酶體病

溶酶體酶缺乏癥是一大類缺乏有效治療的遺傳性疾病。通過基因解碼找到明確的致現(xiàn)基因后，通過基因矯正進(jìn)行治療是目前非常有潛力的一種治療方法。在佳學(xué)細(xì)胞這樣的干細(xì)胞做為載體的新型技術(shù)下，具有正常功能的基因信息被引入體內(nèi)，高效表達(dá)具有功能的蛋白質(zhì)，從而糾正生化缺陷并阻止疾病進(jìn)展。本案例描述了一種有效的基因矯正方法，使用2020年諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)，采用CRISPR-Cas9將溶酶體酶iduronidase靶向人類CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的CCR5安全港位點(diǎn)。修飾后的細(xì)胞分泌超內(nèi)源酶水平，維持長期的再增殖和多系分化潛能，并能改善免疫低下小鼠I型粘多糖病模型的生化和表型異常，這些研究為基因組編輯CD34+造血干細(xì)胞的開發(fā)提供了支持干細(xì)胞和祖細(xì)胞是治療粘多糖Ⅰ型的潛在方法。安全港方法為溶酶體酶的表達(dá)提供了一個(gè)靈活的平臺(tái)，使其適用于其他溶酶體儲(chǔ)存障礙。

溶酶體貯存性疾?。↙SDs）是由溶酶體蛋白缺乏引起的一大類遺傳性疾病，許多缺乏有效的治療方法。粘多糖癥I型（MPSI）是一種常見的LSD，其原因是iduronidase（IDUA）活性不足，導(dǎo)致糖胺聚糖（GAG）積聚和進(jìn)行性多系統(tǒng)惡化，嚴(yán)重影響神經(jīng)和肌肉骨骼系統(tǒng)。目前對(duì)多發(fā)性硬化癥的干預(yù)措施包括酶替代療法（ERT）和異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）；這兩種療法的療效都很有限。ERT不跨越血腦屏障，需要終身治療，花費(fèi)昂貴，長期治療還會(huì)產(chǎn)生抑制性抗體可以進(jìn)一步降低酶替代療法的效果。Allo-HSCT可以持續(xù)提供酶源，組織巨噬細(xì)胞能夠遷移到受影響的器官，包括大腦，在病變組織提供局部酶活性，比ERT效果更好。但是，對(duì)于移植引起的疾病，包括移植后的不可逆性疾病的治療，包括移植后的并發(fā)癥，以及移植治療的不確定性。

MPSI的人類和動(dòng)物研究表明，HSCT的治療效果可以通過增加循環(huán)IDUA水平來提高。在人類中，與來自MPSI雜合子的hspc移植患者相比，非攜帶者供體移植的患者具有更好的臨床反應(yīng)，并且酶表達(dá)降低。在小鼠中，將表達(dá)超正常酶水平的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPC）移植可顯著糾正表型?；诖?，慢病毒介導(dǎo)的高表達(dá)溶酶體酶的HSPCs的自體移植在LSDs（包括嚴(yán)重MPSI）的人體試驗(yàn)中得到了探索(NCT03488394）和異染性白質(zhì)營養(yǎng)不良。過氧化物酶體疾病X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良也已通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體熱休克蛋白成功治療，盡管缺失酶的超正常表達(dá)可能并不重要，因?yàn)榻徊嫘Ｕ皇窃摷膊〉奶卣?。這種自體方法消除了尋找免疫匹配供體的需要，并減少了同種異體移植的一些潛在并發(fā)癥。然而，與隨機(jī)插入病毒基因組、感染性微粒的攜帶、對(duì)某些載體的免疫反應(yīng)以及可變的轉(zhuǎn)基因表達(dá)有關(guān)的致瘤性的可能性仍然令人擔(dān)憂。

最近開發(fā)的基因組編輯工具將正確的基因添加與基因改變相結(jié)合，從而增加治療效益。其中，聚集規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白-9核酸酶（CRISPR/Cas9）是最簡(jiǎn)單的工程化方法，并已成功地用于在培養(yǎng)基中修飾HSPC。該系統(tǒng)通過傳遞Cas9核酸酶和短引導(dǎo)RNA（sgRNA）被重新用于編輯真核細(xì)胞。當(dāng)靶向由sgRNA確定的序列時(shí)，Cas9產(chǎn)生一個(gè)雙鏈DNA斷裂，從而用設(shè)計(jì)的供體DNA模板刺激同源重組，該模板包含嵌入在斷裂位點(diǎn)中心的同源臂之間的所需基因修飾。這個(gè)過程被稱為“同源重組介導(dǎo)的基因組編輯”（HR-GE）是最常用的原位基因矯正方法，被譽(yù)為治療單基因疾病的工具。盡管其在LSDs中的治療潛力仍有待探索，但為了通過在某些LSDs中自體移植轉(zhuǎn)基因HSPCs來最大限度地提高治療效果，有時(shí)功能酶的表達(dá)水平必須高于內(nèi)源性水平。這可以通過將表達(dá)盒（感興趣的外源啟動(dòng)子基因）插入非必要基因組區(qū)域（或“安全港”）來實(shí)現(xiàn)。

安全港提供了一個(gè)獨(dú)立于特定患者突變的平臺(tái)，易于適應(yīng)各種溶酶體酶，并且與慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，由于插入位點(diǎn)受到限制（常染色體中最多2個(gè)），因此確保了更可預(yù)測(cè)和一致的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外，它的破壞對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響，也沒有已知的致癌轉(zhuǎn)化潛力。

粘多糖病I型的基因矯正研究進(jìn)展

基因矯正工程師CCR5為靶點(diǎn)，插入一個(gè)表達(dá)盒，在人CD34+HPSCs及其后代中過度表達(dá)IDUA。CCR5被認(rèn)為是一個(gè)非必需基因，因?yàn)镃CR5的雙等位基因失活（CCR5?32）對(duì)人類健康沒有普遍的有害影響，CCR5缺失的唯一已知表型是對(duì)HIV-1感染的抵抗力和對(duì)西尼羅河病毒19的易感性增加?；虺C正工程師報(bào)告了人類HSPCs通過基因組編輯來表達(dá)CCR5位點(diǎn)的IDUA，并在一個(gè)新的免疫受損MSPI模型中改善了疾病的生化、內(nèi)臟、肌肉骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。

粘多糖I型病的基因矯正安全嗎？

為了評(píng)估基因毒性和搞清CCR5港脫靶效應(yīng)，基因矯正工程師使用了基于生物信息學(xué)的工具COSMID（CRISPR脫靶位點(diǎn)與錯(cuò)配位點(diǎn)、插入和缺失）。在CB衍生的HSPCs的兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用深度測(cè)序法測(cè)定了共67個(gè)可能的脫靶效應(yīng)位點(diǎn)。在每一個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，比較了模擬細(xì)胞和用RNP電穿孔的細(xì)胞與野生型（WT）Cas9或高保真度（HiFi）Cas937所測(cè)得的百分比指數(shù)。67個(gè)位點(diǎn)中有5個(gè)位于重復(fù)單元內(nèi)，重復(fù)與缺失不能明確到特定的位點(diǎn)。對(duì)于剩下的62個(gè)基因組位置，如果：（1）該位點(diǎn)的indels百分比大于0.1%（檢測(cè)限），（2）兩個(gè)重復(fù)樣本中存在脫靶效應(yīng)，以及（3）RNP中的indels高于模擬樣本，則認(rèn)為這些位點(diǎn)是真正的脫靶。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，只有四個(gè)位點(diǎn)被認(rèn)為是真正的偏離目標(biāo)。對(duì)于所有這些部位，Indels的頻率<0.5%，使用HiFi-Cas9可以有效消除脫靶效應(yīng)，同時(shí)保持了靶向效率。只有一個(gè)外顯子位點(diǎn)出現(xiàn)在SUOX基因（亞硫酸鹽氧化酶）。在該部位測(cè)得的最高脫靶比例為0.128%，低于HiFi-Cas9的檢測(cè)限。這些數(shù)據(jù)表明，CCR5-sgRNA與WT-Cas9，特別是HiFi-Cas9結(jié)合，在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的大屏幕上，其脫靶效應(yīng)可以忽略不計(jì)。

基因矯正的研究表明，在原代細(xì)胞中，Cas9介導(dǎo)的DSBs導(dǎo)致p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，從而降低HR-GE的效率。因此，當(dāng)選擇成功接受HR-GE的細(xì)胞時(shí)，p53陰性克隆的富集潛力引起了人們的關(guān)注。為了檢測(cè)p53在我們的細(xì)胞中的功能，我們針對(duì)四個(gè)生物樣本（兩個(gè)CB和兩個(gè)PB衍生的）來表達(dá)PGK-IDUA-YFP盒，并分離出mock、YFP+（接受HR-GE的細(xì)胞）和YFP−（未進(jìn)行HR-GE的細(xì)胞）。因?yàn)閜53克隆可能是一個(gè)罕見的具有生長優(yōu)勢(shì)的群體，為了增加檢測(cè)概率，細(xì)胞被允許擴(kuò)大100-150倍（約2周）?；虺C正工程師首先使用臨床驗(yàn)證的下一代測(cè)序分析，對(duì)所有四個(gè)樣本的三種情況下的所有TP53外顯子（NM_000546.5）進(jìn)行測(cè)序。盡管體外擴(kuò)增，在HR-GE+細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)新的TP53序列變異。與此一致，在用DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑阿霉素、mock、HR-GE+和HR-GE-細(xì)胞處理后，當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p53蛋白穩(wěn)定性和qPCR測(cè)量的七個(gè)p53靶基因的轉(zhuǎn)錄激活時(shí)，沒有可以辨別的信號(hào)。

基因矯正工程師總共進(jìn)行了200次尸檢（101只小鼠用于初次植入，50只用于二次植入，49只用于NSG-IDUAX/X校正研究），在這些尸檢中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤。實(shí)現(xiàn)中出現(xiàn)了三個(gè)腫瘤樣腫塊，經(jīng)組織學(xué)檢查證實(shí)為膿腫。這200只小鼠被移植了9000萬經(jīng)過基因矯正后的人類細(xì)胞。考慮到MSPI患者HSCT的中位年齡約為1歲，平均體重為10 Kg，本研究中使用的基因矯正細(xì)胞數(shù)是正常劑量的兩倍（4.5×10⁶ CD34 HSPCs/Kg）。因此，明顯缺乏致瘤性和CCR5 sgRNA的低脫靶效應(yīng)說明該基因矯正方案是安全的。

關(guān)于粘多糖病基因矯正的真實(shí)應(yīng)用

基因矯正的臨床應(yīng)用是一個(gè)嚴(yán)肅的、充滿希望的方法。但是該方法的應(yīng)用需要患者的理解和配合，同時(shí)需要滿足監(jiān)管部門的要求，經(jīng)過專家的嚴(yán)格審評(píng)。請(qǐng)不同的基因病患者關(guān)注佳學(xué)基因的研究進(jìn)展，向佳學(xué)基因基因矯正研究基金捐助科研經(jīng)費(fèi)，積極宣傳基因解碼和基因矯正知識(shí)，共同促進(jìn)粘多糖基因矯正方案的早日實(shí)施。

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)

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