【基因解碼】粘多糖?、裥突虺C正的研究和應(yīng)用
遺傳病、罕見(jiàn)病基因檢測(cè)導(dǎo)讀:
基因矯正技術(shù)是一種定向基因編輯技術(shù)。粘多糖病是一種溶酶體酶代謝性疾病。不同的患者可能具有類似的表型但是具有不同的致病基因。而基因矯正需要通過(guò)基因解碼正確地發(fā)現(xiàn)明確的致病基因位點(diǎn)后,從基因根源上進(jìn)行矯正治療的方法。
粘多糖病I型及溶酶體病
溶酶體酶缺乏癥是一大類缺乏有效治療的遺傳性疾病。通過(guò)基因解碼找到明確的致現(xiàn)基因后,通過(guò)基因矯正進(jìn)行治療是目前非常有潛力的一種治療方法。在佳學(xué)細(xì)胞這樣的干細(xì)胞做為載體的新型技術(shù)下,具有正常功能的基因信息被引入體內(nèi),高效表達(dá)具有功能的蛋白質(zhì),從而糾正生化缺陷并阻止疾病進(jìn)展。本案例描述了一種有效的基因矯正方法,使用2020年諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù),采用CRISPR-Cas9將溶酶體酶iduronidase靶向人類CD34+造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的CCR5安全港位點(diǎn)。修飾后的細(xì)胞分泌超內(nèi)源酶水平,維持長(zhǎng)期的再增殖和多系分化潛能,并能改善免疫低下小鼠I型粘多糖病模型的生化和表型異常,這些研究為基因組編輯CD34+造血干細(xì)胞的開(kāi)發(fā)提供了支持干細(xì)胞和祖細(xì)胞是治療粘多糖Ⅰ型的潛在方法。安全港方法為溶酶體酶的表達(dá)提供了一個(gè)靈活的平臺(tái),使其適用于其他溶酶體儲(chǔ)存障礙。
溶酶體貯存性疾?。↙SDs)是由溶酶體蛋白缺乏引起的一大類遺傳性疾病,許多缺乏有效的治療方法。粘多糖癥I型(MPSI)是一種常見(jiàn)的LSD,其原因是iduronidase(IDUA)活性不足,導(dǎo)致糖胺聚糖(GAG)積聚和進(jìn)行性多系統(tǒng)惡化,嚴(yán)重影響神經(jīng)和肌肉骨骼系統(tǒng)。目前對(duì)多發(fā)性硬化癥的干預(yù)措施包括酶替代療法(ERT)和異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT);這兩種療法的療效都很有限。ERT不跨越血腦屏障,需要終身治療,花費(fèi)昂貴,長(zhǎng)期治療還會(huì)產(chǎn)生抑制性抗體可以進(jìn)一步降低酶替代療法的效果。Allo-HSCT可以持續(xù)提供酶源,組織巨噬細(xì)胞能夠遷移到受影響的器官,包括大腦,在病變組織提供局部酶活性,比ERT效果更好。但是,對(duì)于移植引起的疾病,包括移植后的不可逆性疾病的治療,包括移植后的并發(fā)癥,以及移植治療的不確定性。
MPSI的人類和動(dòng)物研究表明,HSCT的治療效果可以通過(guò)增加循環(huán)IDUA水平來(lái)提高。在人類中,與來(lái)自MPSI雜合子的hspc移植患者相比,非攜帶者供體移植的患者具有更好的臨床反應(yīng),并且酶表達(dá)降低。在小鼠中,將表達(dá)超正常酶水平的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)移植可顯著糾正表型?;诖?,慢病毒介導(dǎo)的高表達(dá)溶酶體酶的HSPCs的自體移植在LSDs(包括嚴(yán)重MPSI)的人體試驗(yàn)中得到了探索(NCT03488394)和異染性白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。過(guò)氧化物酶體疾病X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良也已通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體熱休克蛋白成功治療,盡管缺失酶的超正常表達(dá)可能并不重要,因?yàn)榻徊嫘U皇窃摷膊〉奶卣?。這種自體方法消除了尋找免疫匹配供體的需要,并減少了同種異體移植的一些潛在并發(fā)癥。然而,與隨機(jī)插入病毒基因組、感染性微粒的攜帶、對(duì)某些載體的免疫反應(yīng)以及可變的轉(zhuǎn)基因表達(dá)有關(guān)的致瘤性的可能性仍然令人擔(dān)憂。
最近開(kāi)發(fā)的基因組編輯工具將正確的基因添加與基因改變相結(jié)合,從而增加治療效益。其中,聚集規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白-9核酸酶(CRISPR/Cas9)是最簡(jiǎn)單的工程化方法,并已成功地用于在培養(yǎng)基中修飾HSPC。該系統(tǒng)通過(guò)傳遞Cas9核酸酶和短引導(dǎo)RNA(sgRNA)被重新用于編輯真核細(xì)胞。當(dāng)靶向由sgRNA確定的序列時(shí),Cas9產(chǎn)生一個(gè)雙鏈DNA斷裂,從而用設(shè)計(jì)的供體DNA模板刺激同源重組,該模板包含嵌入在斷裂位點(diǎn)中心的同源臂之間的所需基因修飾。這個(gè)過(guò)程被稱為“同源重組介導(dǎo)的基因組編輯”(HR-GE)是最常用的原位基因矯正方法,被譽(yù)為治療單基因疾病的工具。盡管其在LSDs中的治療潛力仍有待探索,但為了通過(guò)在某些LSDs中自體移植轉(zhuǎn)基因HSPCs來(lái)最大限度地提高治療效果,有時(shí)功能酶的表達(dá)水平必須高于內(nèi)源性水平。這可以通過(guò)將表達(dá)盒(感興趣的外源啟動(dòng)子基因)插入非必要基因組區(qū)域(或“安全港”)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
安全港提供了一個(gè)獨(dú)立于特定患者突變的平臺(tái),易于適應(yīng)各種溶酶體酶,并且與慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)相比,由于插入位點(diǎn)受到限制(常染色體中最多2個(gè)),因此確保了更可預(yù)測(cè)和一致的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外,它的破壞對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響,也沒(méi)有已知的致癌轉(zhuǎn)化潛力。
粘多糖病I型的基因矯正研究進(jìn)展
基因矯正工程師CCR5為靶點(diǎn),插入一個(gè)表達(dá)盒,在人CD34+HPSCs及其后代中過(guò)度表達(dá)IDUA。CCR5被認(rèn)為是一個(gè)非必需基因,因?yàn)镃CR5的雙等位基因失活(CCR5?32)對(duì)人類健康沒(méi)有普遍的有害影響,CCR5缺失的唯一已知表型是對(duì)HIV-1感染的抵抗力和對(duì)西尼羅河病毒19的易感性增加?;虺C正工程師報(bào)告了人類HSPCs通過(guò)基因組編輯來(lái)表達(dá)CCR5位點(diǎn)的IDUA,并在一個(gè)新的免疫受損MSPI模型中改善了疾病的生化、內(nèi)臟、肌肉骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)。
粘多糖I型病的基因矯正安全嗎?
為了評(píng)估基因毒性和搞清CCR5港脫靶效應(yīng),基因矯正工程師使用了基于生物信息學(xué)的工具COSMID(CRISPR脫靶位點(diǎn)與錯(cuò)配位點(diǎn)、插入和缺失)。在CB衍生的HSPCs的兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),用深度測(cè)序法測(cè)定了共67個(gè)可能的脫靶效應(yīng)位點(diǎn)。在每一個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中,比較了模擬細(xì)胞和用RNP電穿孔的細(xì)胞與野生型(WT)Cas9或高保真度(HiFi)Cas937所測(cè)得的百分比指數(shù)。67個(gè)位點(diǎn)中有5個(gè)位于重復(fù)單元內(nèi),重復(fù)與缺失不能明確到特定的位點(diǎn)。對(duì)于剩下的62個(gè)基因組位置,如果:(1)該位點(diǎn)的indels百分比大于0.1%(檢測(cè)限),(2)兩個(gè)重復(fù)樣本中存在脫靶效應(yīng),以及(3)RNP中的indels高于模擬樣本,則認(rèn)為這些位點(diǎn)是真正的脫靶。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn),只有四個(gè)位點(diǎn)被認(rèn)為是真正的偏離目標(biāo)。對(duì)于所有這些部位,Indels的頻率<0.5%,使用HiFi-Cas9可以有效消除脫靶效應(yīng),同時(shí)保持了靶向效率。只有一個(gè)外顯子位點(diǎn)出現(xiàn)在SUOX基因(亞硫酸鹽氧化酶)。在該部位測(cè)得的最高脫靶比例為0.128%,低于HiFi-Cas9的檢測(cè)限。這些數(shù)據(jù)表明,CCR5-sgRNA與WT-Cas9,特別是HiFi-Cas9結(jié)合,在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的大屏幕上,其脫靶效應(yīng)可以忽略不計(jì)。
基因矯正的研究表明,在原代細(xì)胞中,Cas9介導(dǎo)的DSBs導(dǎo)致p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯,從而降低HR-GE的效率。因此,當(dāng)選擇成功接受HR-GE的細(xì)胞時(shí),p53陰性克隆的富集潛力引起了人們的關(guān)注。為了檢測(cè)p53在我們的細(xì)胞中的功能,我們針對(duì)四個(gè)生物樣本(兩個(gè)CB和兩個(gè)PB衍生的)來(lái)表達(dá)PGK-IDUA-YFP盒,并分離出mock、YFP+(接受HR-GE的細(xì)胞)和YFP−(未進(jìn)行HR-GE的細(xì)胞)。因?yàn)閜53克隆可能是一個(gè)罕見(jiàn)的具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的群體,為了增加檢測(cè)概率,細(xì)胞被允許擴(kuò)大100-150倍(約2周)?;虺C正工程師首先使用臨床驗(yàn)證的下一代測(cè)序分析,對(duì)所有四個(gè)樣本的三種情況下的所有TP53外顯子(NM_000546.5)進(jìn)行測(cè)序。盡管體外擴(kuò)增,在HR-GE+細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)新的TP53序列變異。與此一致,在用DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑阿霉素、mock、HR-GE+和HR-GE-細(xì)胞處理后,當(dāng)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p53蛋白穩(wěn)定性和qPCR測(cè)量的七個(gè)p53靶基因的轉(zhuǎn)錄激活時(shí),沒(méi)有可以辨別的信號(hào)。
基因矯正工程師總共進(jìn)行了200次尸檢(101只小鼠用于初次植入,50只用于二次植入,49只用于NSG-IDUAX/X校正研究),在這些尸檢中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤。實(shí)現(xiàn)中出現(xiàn)了三個(gè)腫瘤樣腫塊,經(jīng)組織學(xué)檢查證實(shí)為膿腫。這200只小鼠被移植了9000萬(wàn)經(jīng)過(guò)基因矯正后的人類細(xì)胞??紤]到MSPI患者HSCT的中位年齡約為1歲,平均體重為10 Kg,本研究中使用的基因矯正細(xì)胞數(shù)是正常劑量的兩倍(4.5×106 CD34 HSPCs/Kg)。因此,明顯缺乏致瘤性和CCR5 sgRNA的低脫靶效應(yīng)說(shuō)明該基因矯正方案是安全的。
關(guān)于粘多糖病基因矯正的真實(shí)應(yīng)用
基因矯正的臨床應(yīng)用是一個(gè)嚴(yán)肅的、充滿希望的方法。但是該方法的應(yīng)用需要患者的理解和配合,同時(shí)需要滿足監(jiān)管部門的要求,經(jīng)過(guò)專家的嚴(yán)格審評(píng)。請(qǐng)不同的基因病患者關(guān)注佳學(xué)基因的研究進(jìn)展,向佳學(xué)基因基因矯正研究基金捐助科研經(jīng)費(fèi),積極宣傳基因解碼和基因矯正知識(shí),共同促進(jìn)粘多糖基因矯正方案的早日實(shí)施。
- 上一篇:【佳學(xué)基因檢測(cè)】白質(zhì)腦病、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎和低丙種球蛋白血癥基因解碼、基因檢測(cè)
- 下一篇:【佳學(xué)基因檢測(cè)】健康夫妻如何才能避免生育患早衰癥的桐桐及其他罕見(jiàn)病孩子?
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】拉倫綜合癥基因檢測(cè)的坑不要跳!...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】如何確定格蘭奇綜合癥(GRNG)基因檢測(cè)的質(zhì)量?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】肉芽腫性多血管炎(GPA)基因解碼分析法...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】灰血小板綜合征一定要做基因檢測(cè)嗎?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】怎么檢查高登哈綜合征基因?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】戈林·喬杜里·莫斯綜合癥基因測(cè)序基因檢測(cè)...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】GLA缺乏癥可以做基因檢測(cè)嗎?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】吉爾·德拉圖雷特綜合征基因檢測(cè)如何理解?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】吉萊斯皮綜合征要做基因檢測(cè)嗎?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】得了生長(zhǎng)激素受體缺乏癥還能生孩子嗎?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】家族性水平性凝視麻痹,伴有進(jìn)行性脊柱側(cè)彎一定要做基因檢測(cè)嗎?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】GAMT 缺陷基因檢測(cè)的可信度?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】戈謝綜合癥基因檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與結(jié)構(gòu)功能分析法...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】先天性眼外肌纖維化的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】系統(tǒng)性硬皮病基因檢測(cè)如何做?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】怎么知道是否遺傳了多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤基因?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】2 型神經(jīng)纖維瘤病基因測(cè)序基因檢測(cè)...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】福克斯內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良要做基因檢測(cè)的基本知識(shí)...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】想了解弗雷澤綜合癥基因及弗雷澤綜合癥基因檢測(cè)...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】想了解法伯氏病基因及法伯氏病基因檢測(cè)...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】家族性匹克氏病為什么要做基因檢測(cè)?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】法布里氏病基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)如何確定的...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】在醫(yī)院做二氫嘧啶脫氫酶缺乏癥基因檢測(cè)是怎樣的?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】肺泡毛細(xì)血管發(fā)育不良伴肺靜脈錯(cuò)位怎么做基因檢測(cè)?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】新生兒篩查就是新生兒基因檢測(cè)嗎?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】新生兒篩查出苯丙酮尿癥為什么還要做基因檢測(cè)?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】新生兒篩查是什么項(xiàng)目?可以替代基因檢測(cè)嗎?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】?jī)嚎瞥R?jiàn)的遺傳病有哪些?怎么做基因檢測(cè)?...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】全基因組測(cè)序(WGS)基因檢測(cè)如何變靶罕見(jiàn)病的診斷...
- 【佳學(xué)基因檢測(cè)】楓糖尿病是一種單基因遺傳病...
- 來(lái)了,就說(shuō)兩句!
-
- 最新評(píng)論 進(jìn)入詳細(xì)評(píng)論頁(yè)>>