基因包測(cè)序可對(duì)某些疾病的相關(guān)基因進(jìn)行目標(biāo)基因測(cè)序，可同時(shí)檢測(cè)數(shù)種至數(shù)百種基因。基因包測(cè)序檢測(cè)基因數(shù)量少，檢測(cè)成本相對(duì)低，且具有針對(duì)性強(qiáng)、覆蓋范圍廣、周轉(zhuǎn)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，但其無法發(fā)現(xiàn)一些未知基因和特殊突變?；虬鼫y(cè)序適用的遺傳病特點(diǎn)為：①具有明顯臨床表型多樣性；②多個(gè)疾病中存在表型重疊現(xiàn)象，需要進(jìn)行鑒別診斷；③遺傳位點(diǎn)的異質(zhì)性，多個(gè)基因同時(shí)控制一個(gè)代謝通路 。由于其可以自由搭配基因種類及數(shù)量，臨床多用于某一類或幾類遺傳病基因檢測(cè)。目前，多種新生兒遺傳病篩查多采用此方法。相對(duì)于全外顯子測(cè)序的基因解碼，基因檢測(cè)包的正確率要高于少量位點(diǎn)的PCR檢測(cè)，但是明確低于基于全外顯子測(cè)序的基因解碼。

全外顯子組測(cè)序

全外顯子組測(cè)序由于檢測(cè)疾病范圍廣、檢測(cè)性價(jià)比高等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)用于識(shí)別臨床未確診疾病患者的基因檢測(cè)。相對(duì)于獲得更多、更全基因信息的全基因組測(cè)序來說，其局限性在于不能獲得完整的基因組信息、無法檢測(cè)DNA結(jié)構(gòu)突變、難以有效覆蓋高度同源區(qū)、易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，而且檢測(cè)成本高、檢測(cè)周期長(zhǎng)、生物信息學(xué)分析對(duì)于臨床醫(yī)生是一個(gè)難以客服的挑戰(zhàn)，故目前不適用于由醫(yī)院獨(dú)立開展、面向全部國民的新生兒疾病篩查。但是其對(duì)結(jié)構(gòu)突變的檢測(cè)和對(duì)未知突變的檢測(cè)要優(yōu)于基因檢測(cè)包及單基因測(cè)序。

全基因組測(cè)序

即對(duì)生物體整個(gè)基因組序列進(jìn)行測(cè)序，是檢測(cè)基因突變的出色手段。全基因組測(cè)序可以獲得個(gè)體全部差異和變異信息，較全外顯子組測(cè)序覆蓋的區(qū)域更廣，且在鑒定單堿基突變、插入缺失突變、拷貝數(shù)突變和結(jié)構(gòu)突變中更具優(yōu)勢(shì) 。目前，第二代STATseq項(xiàng)目可以在26?h內(nèi)進(jìn)行初步診斷，且敏感度和特異度均超過99.5% 。但全基因組測(cè)序面臨致病突變體的鑒定、臨床意義不明突變結(jié)果的解釋、短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量數(shù)據(jù)儲(chǔ)存和分析、相對(duì)高成本等諸多挑戰(zhàn)，其在臨床的適用性仍須進(jìn)一步評(píng)估。目前，全基因組測(cè)序多用于臨床疑似遺傳病及現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)未能明確病因的患者，不適用于新生兒遺傳病篩查 。

新生兒遺傳病基因篩查的臨床應(yīng)用

新生兒遺傳病基因篩查的疾病選擇及基因選擇

新生兒遺傳病篩查病種的選擇主要參考1968年世界衛(wèi)生組織Wilson-Jungner標(biāo)準(zhǔn)，即危及生命或可能導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾，易于篩查且具有有效治療或干預(yù)方案的疾病。在此基礎(chǔ)上，新生兒遺傳病基因篩查的疾病應(yīng)選擇：①目前開展篩查的疾??；②當(dāng)?shù)鼗疾÷始鞍l(fā)病率較高且危害重的疾??；③遺傳機(jī)制清晰及基因型與表型明確的疾??；④有第二種方法可輔助診斷的疾?。虎菘梢灾委煹募膊?。

新生兒遺傳病基因篩查選擇的基因包括某一種疾病的全部致病基因或優(yōu)勢(shì)基因。美國新生兒基因組測(cè)序（BabySeq）項(xiàng)目中包含三類基因：①對(duì)兒童期發(fā)病的疾病具有很高預(yù)測(cè)價(jià)值的基因；②具有中度證據(jù)和（或）外顯率的基因，兒童期干預(yù)可防止嚴(yán)重后果或成人期發(fā)病但兒童期的干預(yù)可能顯著改善臨床癥狀；③缺乏導(dǎo)致疾病證據(jù)的基因，具有低、中度外顯率或與成人期發(fā)病條件有關(guān)，尚無證據(jù)表明兒童期非侵入性治療起作用，但與患者的癥狀相關(guān)。對(duì)于可由多個(gè)基因突變導(dǎo)致的疾病，如高苯丙氨酸血癥、甲基丙二酸血癥及楓糖尿病等，可由數(shù)個(gè)至十幾個(gè)基因突變引起，為了節(jié)約實(shí)驗(yàn)室成本、生物信息學(xué)分析成本及檢測(cè)時(shí)間成本，需要選擇占比較高的基因，如苯丙氨酸血癥可選擇 PAH和 PTS基因，甲基丙二酸血癥可選擇 MMACHC、 MMUT、 MMAA和 MMAB基因。

新生兒遺傳病單病種基因篩查

耳聾基因篩查

耳聾患者中70%及以上是由遺傳因素引起的，新生兒聽力篩查雖然可以快速檢查聽力，但不適于遲發(fā)性、進(jìn)行性或藥物性耳聾篩查 。耳聾基因篩查有助于提高遺傳性耳聾的檢出率。目前采用的篩查方法為針對(duì)數(shù)個(gè)基因及突變位點(diǎn)的定量PCR技術(shù)，已取得了顯著效果。

脊髓性肌萎縮基因篩查

脊髓性肌萎縮是一種常染色體隱性神經(jīng)退行性疾病，是由于 SMN1基因純合缺失導(dǎo)致SMN蛋白缺乏而致。2017年，美國一項(xiàng)研究利用定量PCR技術(shù)對(duì)紐約3826名新生兒進(jìn)行篩查，檢測(cè)出1例脊髓性肌萎縮患兒，證實(shí)了脊髓性肌萎縮基因篩查的可行性。2019年，我國大陸地區(qū)新穎對(duì)脊髓性肌萎縮進(jìn)行大規(guī)模篩查，采用DNA質(zhì)譜技術(shù)對(duì)29?364名新生兒進(jìn)行篩查，確診3例患兒。該方法具有時(shí)間短、成本低、特異度及敏感度高等優(yōu)勢(shì)，有助于推動(dòng)脊髓性肌萎縮的新生兒篩查。

地中海貧血基因篩查

地中海貧血是由于人類珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致珠蛋白肽鏈異常引起的一組遺傳性溶血性疾病，以α-地中海貧血和β-地中海貧血最為常見。2016年，我國貴州省率先使用高通量測(cè)序聯(lián)合傳統(tǒng)地中海貧血篩查技術(shù)——跨越斷裂點(diǎn)PCR，對(duì)18?309名新生兒進(jìn)行地中海貧血基因篩查，結(jié)果顯示該地區(qū)地中海貧血基因攜帶率為12.9%（2362/18?309），且檢測(cè)出傳統(tǒng)方法無法檢測(cè)出的65例地中海貧血基因攜帶者和相關(guān)突變，提示高通量測(cè)序結(jié)合跨越斷裂點(diǎn)PCR可以有效地識(shí)別新的突變，降低誤診率 。

重癥聯(lián)合免疫缺陷病基因篩查

重癥聯(lián)合免疫缺陷病為X-連鎖或常染色體隱性遺傳，是原發(fā)免疫缺陷病最嚴(yán)重的類型。定量PCR技術(shù)用于測(cè)定干血斑提取DNA中T細(xì)胞受體切除環(huán)的含量，其敏感度和特異度高，是目前新生兒重癥聯(lián)合免疫缺陷病篩查的主要方法。自2008年美國率先利用T細(xì)胞受體切除環(huán)篩查重癥聯(lián)合免疫缺陷病起，許多國家如英國、法國、西班牙等都紛紛進(jìn)行了重癥聯(lián)合免疫缺陷病篩查研究。2010年，我國臺(tái)灣地區(qū)率先進(jìn)行了重癥聯(lián)合免疫缺陷病試點(diǎn)篩查項(xiàng)目，在106?931名受檢新生兒中篩查出2例患兒。

新生兒遺傳病多病種基因篩查

單病種基因篩查一次實(shí)驗(yàn)僅能篩查一種疾病，篩查效率低。遺傳病種類繁多，多病種基因篩查有助于節(jié)約成本，提高篩查效率，實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)篩查數(shù)十種至數(shù)百種疾病的目的。高通量測(cè)序因其測(cè)序速度快、檢測(cè)疾病譜廣、不依賴于典型的臨床表現(xiàn)，越來越廣泛地應(yīng)用于新生兒遺傳代謝性疾病篩查 。但目前利用高通量測(cè)序進(jìn)行大樣本新生兒遺傳病篩查的報(bào)道較少，多為串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)后的二級(jí)篩查 。英國Campen等設(shè)計(jì)了一個(gè)包含 PAH、 ACADM、 TSHR、 CFTR、 HBB的基因包，篩查苯丙酮尿癥、中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥、先天性甲狀腺功能低下癥、囊性纖維化和鐮刀型細(xì)胞貧血等五種疾病，結(jié)果顯示敏感度100%，特異度99.96%，正確度99.5%，證實(shí)了基因包測(cè)序用于新生兒篩查的有效性，且其報(bào)告時(shí)間僅1周，每樣本檢測(cè)成本約62.41英鎊，但其篩查疾病偏少。國內(nèi)Luo等設(shè)計(jì)包含573種基因的基因包，利用高通量測(cè)序在1127名受檢新生兒中篩查出4例葡萄糖-6-磷酸脫氫酶患兒，1例原發(fā)性肉堿缺乏癥患兒（此患兒串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)陰性），同時(shí)獲得中國常見基因的攜帶率數(shù)據(jù)?；虬鼫y(cè)序聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜法可彌補(bǔ)目前新生兒遺傳代謝病篩查的缺陷，有效地降低假陽性率和假陰性率，使結(jié)果更加高效。2020年，我國廣東地區(qū)開展了串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)合高通量測(cè)序篩查遺傳代謝性疾病的研究 ，共篩查20?000名新生兒，結(jié)果證實(shí)串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)合高通量測(cè)序可有效降低串聯(lián)質(zhì)譜法篩查的假陽性率和假陰性率，并及早明確患者致病基因突變位點(diǎn)，為后續(xù)的臨床治療和遺傳咨詢提供依據(jù)。

新生兒遺傳病基因篩查結(jié)果解讀

根據(jù)ACMG聯(lián)合分子病理協(xié)會(huì)在2015年提出的“序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南”，突變位點(diǎn)評(píng)級(jí)可分為致病性、可能致病性、臨床意義不明、可能良性和良性5個(gè)等級(jí)。其中，致病性和可能致病性突變對(duì)臨床有診斷意義；臨床意義不明不能直接作為臨床診斷的依據(jù)，需要結(jié)合臨床，必要時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的家系成員驗(yàn)證、輔助檢查、臨床隨訪等；可能良性和良性為不致病。對(duì)于報(bào)告結(jié)果的解讀，ACMG建議用“陽性”、“陰性”、“不確定”以及“攜帶者”作總結(jié)性說明。“陽性”即檢出的致病突變可解釋受檢者的臨床指征；“陰性”即沒有檢出任何可疑的突變；“不確定”即檢出的突變?yōu)榕R床意義不明或常染色體隱性遺傳的疾病只檢出一個(gè)雜合致病突變而不足以解釋受檢原因；“攜帶者”則僅適用于隱性遺傳病攜帶者篩查的報(bào)告。

由于新生兒基因篩查是在新生兒出生后2~7?d采血進(jìn)行基因檢測(cè)，即使是遺傳病患兒采血時(shí)大部分可能并無臨床表現(xiàn)，判斷檢測(cè)到的基因突變是否致病時(shí)無臨床表型作為依據(jù)。故除按照上述基因檢測(cè)結(jié)果解讀原則對(duì)基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷外，尚需結(jié)合目前的常規(guī)篩查結(jié)果及特異代謝物檢測(cè)進(jìn)行解讀：①對(duì)于目前常規(guī)篩查的疾病，需要結(jié)合篩查結(jié)果進(jìn)行解讀，包括高苯丙氨酸血癥、先天性甲狀腺功能減退癥、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、串聯(lián)質(zhì)譜篩查疾病及耳聾等；②對(duì)于目前未進(jìn)行常規(guī)篩查但有明確特異代謝物的疾病，如溶酶體疾病、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、糖原貯積癥等，基因檢測(cè)結(jié)果解讀時(shí)建議進(jìn)行特異代謝物檢測(cè)，以便診斷或排除篩查疾??；③對(duì)于無特異代謝物的遺傳病，基因檢測(cè)結(jié)果按照上述基因檢測(cè)結(jié)果解讀原則解讀。

新生兒遺傳病基因篩查相關(guān)倫理問題

新生兒遺傳病基因篩查相關(guān)倫理問題主要有以下四方面：①政策制訂的倫理學(xué)問題。新生兒疾病篩查政策制訂應(yīng)基于衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)評(píng)價(jià)及成本效益分析結(jié)果，尊重人權(quán)?；蚪M技術(shù)的引入可為更多新生兒提供早期干預(yù)的機(jī)會(huì)以預(yù)防嚴(yán)重疾病、障礙或死亡。但必須確保以不損害當(dāng)前篩查計(jì)劃的有效性或社會(huì)支持的方式使用基因篩查技術(shù)。②新生兒監(jiān)護(hù)人的知情選擇權(quán)。新生兒疾病篩查應(yīng)遵循自愿和知情選擇的原則，其知情選擇和決定權(quán)由其監(jiān)護(hù)人代為行使。在進(jìn)行新生兒篩查前應(yīng)將檢查的項(xiàng)目、意義、方法、費(fèi)用等如實(shí)告知監(jiān)護(hù)人，給予詳盡解釋，并取得書面同意。③保護(hù)隱私權(quán)。基因篩查結(jié)果信息涉及多方面的關(guān)聯(lián)，因此在測(cè)序數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)、解讀和使用過程中必須注意保護(hù)患兒及家庭信息和隱私。此外，在篩查陽性的患兒過程中，涉及具有血緣關(guān)系的相關(guān)親屬的隱私，須對(duì)親屬信息嚴(yán)格保密。④篩查過程中的倫理學(xué)問題。對(duì)于篩查結(jié)果陽性的患兒家屬出現(xiàn)焦慮、絕望等情緒時(shí)須做好安撫和溝通解釋工作；檢查結(jié)果可能出現(xiàn)攜帶者、假陽性、假陰性、不確定性結(jié)果等情況，因此如何提請(qǐng)患兒家屬重視的同時(shí)不增加其心理負(fù)擔(dān)，對(duì)醫(yī)生的遺傳咨詢能力和報(bào)告解讀能力提出了較高的要求。

出生缺陷及遺傳病降低的共識(shí)

幾十年來，檢測(cè)干血斑特異代謝物的生化篩查技術(shù)在新生兒遺傳病篩查中發(fā)揮了重要作用。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，基因篩查有助于擴(kuò)大新生兒遺傳病篩查病種，部分遺傳代謝病生化指標(biāo)檢測(cè)聯(lián)合基因檢測(cè)技術(shù)將提高新生兒遺傳代謝病的篩查效率。隨著新生兒遺傳病基因篩查的相關(guān)研究逐步開展，在新生兒遺傳病基因篩查的疾病種類、基因選擇、基因篩查流程、篩查結(jié)果判讀、篩查陽性者隨訪、診斷、治療等方面將陸續(xù)形成專家共識(shí)，遺傳代謝病患兒有望得到更早的診斷及治療。