【佳學基因檢測】肌營養(yǎng)不良基因檢測復雜性的解析策略

佳學基因導讀：

在 961 名臨床懷疑患有杜氏肌營養(yǎng)不良癥的患者中，有 105 名被診斷患有其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)，其中最常見的是LGMD2E（變體SGCB c.544A>C）。在進行致病基因鑒定基因檢測中，檢測項目的選擇和指定，往往需要選擇拓展的檢測范圍 ，以便解決臨床癥狀出現(xiàn)的復雜性，增加檢測分析的準確性。

大多數(shù)其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者患有常染色體隱性疾病，包括肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 (LGMD)、Bethlem、Ullrich 先天性肌病和 Emery-Driefuss 肌營養(yǎng)不良癥。3.5% 的患者被確診患有其他疾病，如夏科-馬里圖斯病和桿狀體肌病。一小部分患者（0.6%）仍未確診。在總共 78 個已識別的基因變異中，有 44 個是新的。有趣的是，三分之一的其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者被發(fā)現(xiàn)患有 LGMD2E/R4，這是一種嚴重的 LGMD，會使幼兒出現(xiàn)與 DMD 相似的臨床癥狀。幾乎三分之一的無關 LGMD2E/R4 患者在SGCB基因中具有相同的點突變（c.544A>C），提示存在奠基者效應，這是肌營養(yǎng)不良基因檢測進行描述。

肌營養(yǎng)不良基因檢測復雜性的解析策略關鍵詞：

常染色體隱性遺傳病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 2E-R4、肌營養(yǎng)不良癥、下一代測序、重疊癥狀

肌營養(yǎng)不良基因檢測臨床大數(shù)據(jù)分析中所有經分子學證實的 LGMD 都是臨床上懷疑為 DMD/BMD 的。在肌營養(yǎng)不良基因檢測臨床大數(shù)據(jù)分析中，肌營養(yǎng)不良基因檢測試圖了解患者的發(fā)病年齡，這可能是區(qū)分 DMD/BMD 與其他肌營養(yǎng)不良癥的一個區(qū)別因素。根據(jù)發(fā)病年齡，很明顯，在肌營養(yǎng)不良基因檢測的隊列中，LGMD 2E 的嚴重程度與 DMD 最接近，其中變體 c.544A>C 最為常見，臨床癥狀也表現(xiàn)出相同的癥狀。

為什么要進行肌營養(yǎng)不良基因檢測的大數(shù)據(jù)比較分析

下一代 DNA 測序方法對臨床疑似杜氏肌營養(yǎng)不良癥 (DMD) 患者的精確和明確診斷做出了巨大貢獻，從而提高了診斷率。DMD 是一種單基因、X 連鎖隱性、退行性神經肌肉疾病，影響年輕男性，并導致致命的心肺和呼吸衰竭。及早準確識別肌營養(yǎng)不良蛋白 ( DMD ) 基因變異對于診斷該疾病至關重要，并正在成為有效疾病管理策略的重要組成部分。由于 DMD 是一種進行性疾病，因此需要盡早通過咨詢啟動護理指南和疾病預防策略，特別是因為現(xiàn)在已有針對一部分患者的有效療法。

在最近的一項研究中，肌營養(yǎng)不良基因檢測報告了961 名無親緣關系、臨床懷疑患有 DMD 的男性患者的DMD基因突變譜。肌營養(yǎng)不良基因檢測采用了一種分子診斷方法，這種方法對大多數(shù)患者來說都是經濟有效的，并遵循一個系統(tǒng)的過程，該過程依次包括使用 mPCR 識別熱點缺失、使用 MLPA 識別大量缺失和重復以及使用 NGS 先天性肌營養(yǎng)不良癥基因面板識別小插入/缺失和點突變。近 85% (816/961) 的患者被確診為DMD基因變異。其余 15% 的患者 (145/961) 缺乏DMD基因變異，佳學基因檢測對這一部分檢測樣本進行了深度分析，以提高解決臨床需求的目的。

材料與方法

患者納入和排除標準

2006 年至 2013 年間，佳學基因檢測及其合作機構接收了 961 名臨床懷疑患有 DMD/BMD 的男性患者，其中 99% 是無親屬關系的，進行分子診斷。這些患者大多是通過農村 MDCRC 社區(qū)遺傳學計劃以及來自合作的醫(yī)院和診所轉診到 MDCRC 的。

肌營養(yǎng)不良基因檢測的 961 名患者隊列包括年齡在 2-35 歲之間且表現(xiàn)出 DMD 特征癥狀的年輕男性。排除年齡在 35 歲以上的男性患者和具有 DMD 樣癥狀的女性患者。在采集樣本之前，已獲得每位患者（或父母/監(jiān)護人）的知情書面同意。

樣本采集及 DNA 分離和保存

使用 EDTA 真空采血管從臨床疑似 DMD 患者身上采集 3 毫升血液樣本。使用之前描述的簡單脫鹽方案提取基因組 DNA，并儲存在 -20°C 下直至進一步使用。

DNA 樣本的多重 PCR、多重連接依賴性探針擴增 (MLPA) 和下一代測序

按照圖 1中的算法對基因組 DNA 的分子診斷檢查進行了分析。首先進行 mPCR，旨在檢測DMD基因熱點區(qū)域的任何缺失，該區(qū)域覆蓋 30 個外顯子，正如肌營養(yǎng)不良基因檢測之前描述的。接下來在 mPCR 陰性樣本中進行 MLPA 分析，使用商業(yè)購買的 PO34 和 PO35 探針。mPCR 或 MLPA 后沒有發(fā)現(xiàn)DMD基因變異，因此使用下一代序列 (NGS) 分析對樣本進行測序。生成的文庫肌營養(yǎng)不良基因檢測的 Illumina HiSeq 系列 4500 上進行測序，以 80-100 倍的靶向測序深度生成 2 × 150 bp 序列讀數(shù)。僅在肌營養(yǎng)不良癥和先天性肌病組基因中發(fā)現(xiàn)的非同義和剪接位點變體用于臨床解釋。使用 ABI 3730xl 儀器上的標準協(xié)議進行 Sanger 測序，以驗證 NGS 識別的點突變的存在。

全外顯子組測序

DNA分離、外顯子組文庫制備和測序

使用肌營養(yǎng)不良基因檢測描述的手動鹽析法從全血中分離基因組 DNA  。為了制備文庫，將 200 ng Qubit 定量 DNA 片段化為 ~350 bp 插入片段。使用 ~50 Mb Agilent Sure Select 全外顯子組面板 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) 對文庫進行雜交和富集。然后對片段進行末端修復、3′腺苷酸化并與索引接頭連接。然后使用接頭特異性引物擴增接頭連接的片段，然后進行大小選擇和純化以生成 gDNA 文庫。使用 Tape Station評估文庫的片段大小分布，使用 Qubit（美國賽默飛世爾科技）進行量化，并根據(jù)制造商的協(xié)議在 Illumina Hiseq 4500（美國加州 Illumina）機器上測序為 2 × 150 bp 雙端讀數(shù)。文庫測序的平均測序深度為 ≥80–100×。

數(shù)據(jù)處理、變異調用和注釋

使用 fastq‐mcf（版本 1.04.676）進行質量檢查和接頭修剪后，將獲得的測序讀數(shù)與人類參考基因組（GRCh37/hg19）比對。對齊的讀數(shù)進行排序，刪除重復讀數(shù)，并使用 Sentieon（v201808.07）的 GATK 最佳實踐流程調用變異。使用 VEP 程序針對基因組的 Ensembl 版本 91 人類基因模型對變異進行基因注釋。對變異的等位基因頻率進行了注釋[群體數(shù)據(jù)庫 GnomAD（v3.0）、1000 基因組、MedGenome 群體特定數(shù)據(jù)庫、計算機預測工具[CADD、PolyPhen‐2、SIFT、Mutation Taster2 和 LRT] 和疾病數(shù)據(jù)庫 [OMIM、ClinVar 和 HGMD]。對具有臨床意義的變異進行優(yōu)先排序，并使用 Varminer（MedGenome 專有變異解釋工具）進行分析。除了單核苷酸變異 (SNV) 和小 Indel，還使用 ??ExomeDepth (v1.1.10) 方法從目標序列數(shù)據(jù)中檢測拷貝數(shù)變異 (CNV)。根據(jù)測試數(shù)據(jù)讀取深度與匹配的聚合參考數(shù)據(jù)集的比較，該算法檢測 CNV（≥400 bp 缺失和重復）。與疾病表型和遺傳相關的基因變異被優(yōu)先考慮。根據(jù) ACMG 指南對變異進行臨床解釋。

統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均使用 Microsoft Excel 進行。p值< 0.05 被認為具有顯著性。

結果

對 961 名疑似 DMD 患者采用分子診斷策略發(fā)現(xiàn) 145 名患者患有其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD) 和其他非肌營養(yǎng)不良癥

961 名男性患者的初步臨床診斷主要在社區(qū)初級衛(wèi)生保健層面進行，主要依據(jù)癥狀，特別強調發(fā)病年齡、頻繁跌倒、蹣跚步態(tài)、小腿肌肉肥大、爬樓梯困難、Gower 征和喪失行走能力的年齡。年齡在 2-35 歲之間且有一種或多種這些臨床癥狀的男性被確定為臨床疑似 DMD 患者。正如肌營養(yǎng)不良基因檢測之前所報告的，961 名臨床疑似 DMD 患者的 DNA 樣本接受了方法學算法，采用 mPCR、MLPA 和 NGS 的順序方案，旨在識別DMD基因中的變異。如圖 1所示，在 961 名疑似 DMD 患者中，715 名（74.4%）在使用多重 PCR 和 MLPA 進行 DNA 分析后被 證實患有DMD基因變異，另有 246 名患者在這一輪分析后未檢測到變異。這組 246 名疑似 DMD 患者接下來接受了下一代測序 (NGS) 分析，結果發(fā)現(xiàn)另外 101 名患者的DMD基因存在小的缺失/重復或點突變。這些相對較小的突變（包括點突變和小的缺失或插入）未被 mPCR 和 MLPA 方法檢測到。因此，NGS 分析提高了診斷率，從而將 DMD/BMD 的診斷從 74.4%（mPCR 和 MLPA）確診到肌營養(yǎng)不良基因檢測隊列中的總共 84.9% 的患者（圖 1）。

15% (145/961) 的患者盡管臨床上被懷疑患有 DMD/BMD，但卻 沒有被發(fā)現(xiàn)DMD基因變異。NGS 數(shù)據(jù)分析進一步顯示，145 名患者中有 100 名（圖1）患有其他肌營養(yǎng)不良癥（OMD；注：為了方便描述，肌營養(yǎng)不良基因檢測將其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)定義為沒有DMD基因突變，但患有真正的肌營養(yǎng)不良癥，并且具有已知肌營養(yǎng)不良相關基因的變異的患者），包括肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 (LGMD)、Bethlem 肌病和 Emery Dreifuss 肌病等。145 名患者中有 29 名被發(fā)現(xiàn)患有其他疾?。ǚ羌I養(yǎng)不良癥），并且有一些與 DMD 重疊的臨床癥狀。其中包括診斷為軸突夏科-馬里圖斯綜合征和桿狀體肌病等的患者。

NGS 分析進一步顯示，肌營養(yǎng)不良基因檢測隊列中的 145 名患者中有 16 名在肌營養(yǎng)不良基因檢測的肌營養(yǎng)不良癥 NGS 基因組中檢測的基因中沒有變異。為了進一步研究這組患者的潛在遺傳原因，肌營養(yǎng)不良基因檢測對他們的 DNA 進行了全外顯子組序列 (WES) 分析。肌營養(yǎng)不良基因檢測的分析顯示，另外五名患者患有其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)，而最初的 NGS 分析未能發(fā)現(xiàn)這些疾病，這可能是由于兩種方法之間的程序差異。發(fā)現(xiàn)兩名其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者有兩個不同基因的突變（患者 1；SGCB和UBA1；患者 2：SYNE2和ANO5）（表 1；綠色陰影）。另外 16 名患者中的 5 名被診斷出患有其他疾病，包括先天性肌強直、夏科-馬里-圖斯病和布羅迪肌病等（表 1）。目前有六名患者仍未得到確診，且在查詢 WES 肌營養(yǎng)不良癥基因小組時未發(fā)現(xiàn)可識別的變異（表 1）。

表 1.16 個患者樣本的全外顯子組測序 (WES) 數(shù)據(jù)

大多數(shù)OMD患者患有常染色體隱性遺傳病

通過 NGS 和 WES 分析發(fā)現(xiàn)，105 名其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者中 78 名 (74.2%) 患有常染色體隱性遺傳 (AR) 疾?。ū?nbsp;2）。雖然肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 (LGMD) 2E 在該類患者中最為常見，為 37.1%，但 LGMD 2A (14%) 和 LGMD 2B (11.5%) 也很常見（表 2）。發(fā)現(xiàn)的其他 LGMD 包括 LGMD 2C、2D、2F 和 2Q。這一發(fā)現(xiàn)（表 2）并不令人驚訝，因為近親結婚和內婚是 AR 疾病傳播的基礎，在一些地區(qū)很常見。在這方面，在肌營養(yǎng)不良基因檢測 105 例其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)病例中，肌營養(yǎng)不良基因檢測發(fā)現(xiàn) 58 例病例為近親夫婦所生，其中 45 例患有 AR LGMD，其中 LGMD2E 最為常見（21/45）。在家族史方面，105 名患者中有 23 名有家族病史（表 3）。有趣的是，105 名患者中有 18 名既有家族病史，也是近親所生。其中，LGMD 2E 再次占主導地位，有五個家庭既有家族病史，也有近親所生。

表 2.已識別的其他肌營養(yǎng)不良癥的分類

表 3.常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳和 X 連鎖隱性遺傳疾病患者的數(shù)據(jù)匯總

105 名患者中，有 26 例為常染色體顯性 (AD) 遺傳模式的其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者。其中，Bethlem 肌病和 Emery Dreifuss 肌營養(yǎng)不良癥最為常見（各占 34.6%）（表 2）。僅發(fā)現(xiàn)一名患有 X 連鎖 AR 疾病的患者（表 2；X 連鎖 Emery-Dreifuss 肌營養(yǎng)不良癥-1）。

大多數(shù)其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者中發(fā)現(xiàn)的新變異

在 105 名患有所列其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)的患者中，共發(fā)現(xiàn) 78 種基因變異（表 4）。有趣的是，在 78 種基因變異中，有 44 種（56.4%）被發(fā)現(xiàn)是新變異。所有新變異都已存入 Global Variome 共享 LoVD 數(shù)據(jù)庫中，并標記為“新變異（2021 年）”

表 4.105 個其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)突變狀態(tài)匯總顯示共有 44 個新變異

在新變異中，LGMD2Q（n  = 6）和 LGMD2B（n  = 6）患者中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最多。鑒于所有變異中有 56.4% 被發(fā)現(xiàn)是新變異，因此大多數(shù)（46%）被預測為意義不明確的變異 (VUS)，27% 的變異被發(fā)現(xiàn)致病，其余 27% 的變異可能致病，這并不奇怪。78 種基因變異中有 34 種之前已在文獻中報道過（表 4）。

三分之一的其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者（32.3%）被診斷患有其他疾病

NGS 和 WES 分析共同顯示，105 名患者中有 34 名并未患有真正的肌營養(yǎng)不良癥，因此被歸類為“其他疾病”患者，如表 5所示。該組患者中的大多數(shù)（19/34）患有常染色體隱性遺傳病，其中最常見的是先天性肌無力綜合征（7/19），這是一組以肌肉無力為特征的遺傳性疾病，且在體力消耗后會加劇。桿狀體肌病是第二常見的疾?。?/19）。桿狀體肌病是一組異質性的先天性肌病，由至少 12 個基因的從頭突變引起，其中最常見的是α‐肌動蛋白（ACTA1）和肌動蛋白（NEB ）。癥狀范圍廣泛，以肌肉無力和肌張力低下為主要癥狀。19 名患者中有 3 名患有常染色體隱性遺傳的夏科-馬里-圖斯 (CMT) 病，而 14 名患者中有 2 名患有常染色體顯性遺傳的 CMT (表 5 )。CMT 代表一組異質性神經病變，其主要特征是肌肉無力和肌肉尺寸減小。

表 5.其他疾病患者的分類

在被確診患有常染色體顯性遺傳病的 14 名患者中，在其他疾病類別中，有 5 名患者患有遠端肌病，這是一組原發(fā)性肌肉疾病，與其他肌營養(yǎng)不良癥一樣，表現(xiàn)出肌肉無力和肌纖維逐漸喪失。還發(fā)現(xiàn)了一例罕見的 X 連鎖顯性減退體肌病-1 病例，發(fā)病時間為嬰兒期或幼兒期 (表 5 )。這類“其他疾病”的幾種臨床癥狀與 DMD 的臨床癥狀重疊，將在其他地方詳細闡述（手稿正在準備中）。

其他肌營養(yǎng)不良癥（OMD）患者的分析：常染色體隱性肢帶型肌營養(yǎng)不良癥（LGMD）

肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 2A 型 (LGMD2A/LGMDR1) (MIM# 253600)

LGMD2A 最近被歸類為 LGMDR1，是一種進行性肌病，表現(xiàn)為缺乏一種骨骼肌特異性的鈣依賴性鈣蛋白酶半胱氨酸蛋白酶家族異構體，即鈣蛋白酶 3 ( CAPN3 )在肌營養(yǎng)不良基因檢測研究的 78 名常染色體隱性其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)男性患者中，有 11 名被發(fā)現(xiàn)存在與 LGMD2A 相關的CAPN3基因變異。在這 11 名患者中，總共發(fā)現(xiàn)了 8 種CAPN3基因變異，其中每名患者都有 2 名發(fā)現(xiàn)了 3 個點突變 (c.2003T>G、c.946-2A>G 和 c.1343G>A)（表 6；參見彩色單元格）。此外，發(fā)現(xiàn) 3/8 的突變體是新的（表 6）。在肌營養(yǎng)不良基因檢測這個隊列中，發(fā)病平均年齡為 11.2±5.6 歲，診斷年齡為 18.8±5.9 歲，范圍為 8-27 歲。在這個隊列中，發(fā)病和診斷之間的間隔為 7.1 年。

表 6.11 名患有 LGMD2A（LGMDR1）且CAPN3基因發(fā)生突變的患者

肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 2B/R2（MIM# 253601）

LGMD2B/R2 屬于一類被稱為“dysferlinopathies”的疾病，該疾病是由DYSF基因突變導致 dysferlin 蛋白水平不足引起的。LGMD2B 被認為是 LGMD 的較輕形式，因為 LGMD2B 的發(fā)病年齡雖然各不相同，但通常相對較晚，在 20-30 歲之間發(fā)病。LGMD2B 的特征是骨盆和肩帶肌肉無力和萎縮。在所有 LGMD 中，LGMD2B 的進展最慢。

9 名疑似 DMD 患者經 NGS 分析確診為 LGMD2B/R2，其中 6 名患者DYSF基因發(fā)生新突變（表 7）。一對無親緣關系的患者具有相同的DYSF基因突變（c.1256G>C；表 7）。平均發(fā)病年齡為 17.8±8.8 歲，而該組患者的診斷年齡為 31.5±10.7 歲（范圍為 19-56 歲）。發(fā)病與診斷之間相差 13.8 年。

表 7.9 名 LGMD2B（LGMDR2）患者發(fā)生DYSF基因突變

注：彩色單元格表示相同的DYSF基因變體。78% 血緣關系和 22% 家族史。

肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 LGMD2Q/R17 (MIM# 613723)

七名患者經 NGS 證實具有 Plectin（PLEC）基因變異，從而可能診斷為 LGMD2Q。在這組患者中觀察到了 與PLEC基因相關的多種突變類型。雖然發(fā)現(xiàn)患者 1 和 6（表8）攜帶PLEC基因雜合突變，但發(fā)現(xiàn)患者 3、4、5 和 7 具有PLEC基因復合雜合變異（表 8）。此外，患者 2、3 和 5除了PLEC基因雜合變異外，還具有LAMA2和DYSF基因變異（表 8）。該組患者的發(fā)病年齡為 4.3+/- 1.5 歲，而診斷年齡為 14+/-7 歲。在肌營養(yǎng)不良基因檢測的隊列中， PLEC基因中發(fā)現(xiàn)的 7 種變異中有 6 種是新的（表 8），其中 7 名患者中有 2 名具有相同的PLEC變異（c.6359G>A），所有PLEC基因變異均歸類為 VUS。

表 8.7 名 LGMD2Q（LGMDR17）患者存在PLEC基因突變

3.5.4. 肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 2E/ (LGMD2E/R4, MIM# 604286)

在 105 名因就診癥狀而被誤診為 DMD 的患者中，29/105 (27.6%) 名患者通過 NGS 分析被準確診斷為患有 LGMD2E（表 9 ）。LGMD2E 是一種常染色體隱性遺傳病，由 β‐肌聚糖 ( SGCB )基因突變引起。

表 9.LGMD2E：29 名 LGMD2E（LGMDR4）患者，SGCB 發(fā)生突變，并具有臨床特征

雖然在 29/105 名SGCB基因突變患者中共發(fā)現(xiàn) 9 種變異（表 9和圖 2a中的箭頭），但在該 LGMD2E 患者隊列中遇到了兩組常見變異。c.544A>C 點變異出現(xiàn)在 18/29 (62%) 名無關患者中（圖 2a，紅色箭頭），而 c.572delT 移碼變異出現(xiàn)在 4 名患者中（圖 2a，粉色箭頭）。這兩種變異均曾被報道過，但并未出現(xiàn)在來自單個部位的多名患者樣本中。雖然前一種變異被預測可能致病，但后者已被發(fā)現(xiàn)具有致病性（表 9）。

肌營養(yǎng)不良基因檢測發(fā)現(xiàn) 29 名患者發(fā)病年齡為 6.5+/-3.1 歲。失去行走能力的年齡為 11.5+/-3.7 歲，似乎低于之前報告的年齡）。為了確定是否可以從這組患者中收集到基因型與表型的相關性，肌營養(yǎng)不良基因檢測比較了 c.544A>C 變異患者（n  = 18）與 c572delT（n  = 4）和其他統(tǒng)稱的變異患者（n  = 7）的發(fā)病年齡。如圖 2b所示，c.544A>C 變異患者的發(fā)病年齡為 5.6+/-1.5 歲，而 c.572delT 變異患者的發(fā)病年齡為 6.8+/-2.9 歲。雖然這兩種變異的患者在這項指標上沒有統(tǒng)計學上的顯著差異，但變異 c.544A>C 與隊列中其他變異之間存在顯著差異（圖 2b：p  = 0.035）。鑒于 c.544A>C 和 c.572delT 變異之間的發(fā)病年齡沒有統(tǒng)計學差異，并且后者已被預測為致病，肌營養(yǎng)不良基因檢測的數(shù)據(jù)支持將前者從意義不明的變異重新歸類為致病變異。

鑒于肌營養(yǎng)不良基因檢測臨床大數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)的所有 LGMD 均被誤診為 DMD/BMD，肌營養(yǎng)不良基因檢測試圖確定是否可以根據(jù)發(fā)病年齡將 LGMD 與 DMD 區(qū)分開來。如圖 3所示，肌營養(yǎng)不良基因檢測之前對 961 名患者的研究發(fā)現(xiàn)，DMD 患者的平均發(fā)病年齡為 6.17+/− 3 歲。相比之下，LGMD2A 的發(fā)病年齡為 11.2+/−5.6（比 DMD 高 1.8 倍），LGMD2B 為 17.8+/−8.8（比 DMD 高 2.9 倍），LGMD2Q 為 4.3+/−1.5（比 DMD 低 0.7 倍或 30%），LGMD2E 為 6.5+/−3.1（與 DMD 相比無變化）。基于這一單一標準，很明顯，在肌營養(yǎng)不良基因檢測的隊列中，LGMD2E 的嚴重程度與 DMD 最接近，其次是 LGMD 2Q。

比較該隊列中 LGMD 患者的發(fā)病年齡和診斷年齡（圖 3），并與 DMD 進行比較，結果表明，LGMD2B 患者的兩項指標之間的差異最大（13.8 歲），其次是 LGMD2Q（9.7 歲）和 LGMD2A（7.1 歲）。臨床上最嚴重的肌營養(yǎng)不良癥 DMD（3.9 歲）和 LGMD2E（4.2 歲）的發(fā)病年齡和診斷年齡之間的差異似乎最小。

常染色體顯性肌病

Bethlem 肌病 (MIM# 158810) 和 Emery Driefuss 肌營養(yǎng)不良癥 (MIM# 616516)

在 105 名疑似 DMD 患者的 NGS 篩查中，發(fā)現(xiàn)了 10 例 Bethlem 肌病和 4 例 Ullrich 先天性肌營養(yǎng)不良癥 (UCMD；MIM# 254090)（表 2）。與表現(xiàn)為嚴重表型的 Ullrich 先天性肌營養(yǎng)不良癥相比，Bethlem 肌病是一種較輕的先天性常染色體顯性肌病。這兩種疾病都是由編碼 VI?? 型膠原蛋白的基因突變引起的，包括COL6A1（a1 鏈）、COL6A2（a2 鏈）和COL6A3（a3 鏈）。膠原蛋白 VI 是細胞外基質的重要組成部分，可生成與細胞和周圍基底膜相關的微纖維網絡。已知 IV 型膠原蛋白的突變會影響結締組織和肌肉，患者常常出現(xiàn) Gower 征、足尖行走和關節(jié)攣縮。

10 名確診患有 Bethlem 肌病的患者中，有 4 名患有COL6A1基因突變，5 名患者患有COL6A3基因突變，1 名患者患有COL6A2基因突變（表 10）。10 個已識別的變異中有 4 個是新發(fā)現(xiàn)的。這一小群患者的發(fā)病年齡和診斷年齡各不相同，平均年齡為 10.6+/-7.86 歲（范圍：2-23 歲，表 10）。

表 10.

10 名患有 Bethlem 肌病 (LGMDD5) 且COL6A基因發(fā)生突變的患者

金剛砂肌營養(yǎng)不良癥（MIM# 616516、MIM# 612998、MIM# 612999、MIM# 614302）

根據(jù) Lamin A/C ( LMNA ; n  = 1)、Nesprin 1 ( SYNE1 ; n  = 9)、Nesprin 2 ( SYNE2 ; n =  1) 和 LUMA ( TMEM43 ; n  = 1) 基因中發(fā)現(xiàn)的變異，12 名患者被診斷患有 Emery‐Driefuss 肌營養(yǎng)不良癥 (EDMD)（表 11）。EDMD 是一種 X 連鎖常染色體顯性肌營養(yǎng)不良癥，常見癥狀為肌肉萎縮、關節(jié)攣縮、心臟傳導異常和心肌病。EDMD 屬于一類稱為核膜病或核纖層蛋白病的疾病，包括一組不斷增長的與核膜基因突變有關的人類遺傳性疾病。根據(jù)相關的突變基因，OMIM 目前可識別出七種亞型，包括 EDMD1 至 7。然而，超過 60% 的 EDMD 患者沒有可識別的EMD（emerin）或LMN突變，這是兩種最常見的 EMDA 相關突變基因。肌營養(yǎng)不良基因檢測隊列中的患者被分為 EDMD3 ( n  = 1)、EDMD4 ( n  = 9)、EDMD5 ( n  = 1) 和 EDMD 7 ( n  = 1)（表 11 ）。有趣的是，在肌營養(yǎng)不良基因檢測的 EDMD 隊列中發(fā)現(xiàn)的 50% 的變異是新發(fā)現(xiàn)的。肌營養(yǎng)不良基因檢測估計SYNE1基因變異的 EDMD4 患者的診斷年齡為 17.7 +/−12.6 歲（表 11，范圍為 8-37 歲）。

表 11.12 名 Emery‐Dreifuss 肌營養(yǎng)不良癥患者

NGS 分析后發(fā)現(xiàn)患者中存在多種同時發(fā)生的其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)基因變異

如圖 4a和 LOVD 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)所示，肌營養(yǎng)不良基因檢測 105 名其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者中的大多數(shù) (56%) 都攜帶一個真正的其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)基因變異。有趣的是，大約三分之一 (27.6%) 的患者攜帶兩個變異，而 14.3% 的患者攜帶三個變異。兩名患者 (1.9%) 被發(fā)現(xiàn)各有四個變異。其中第一例患者在LAMA2基因中存在兩種變異（外顯子 15；c.2131_2134dup 4 bp 插入和外顯子 60；c.8396C>G），兩種變異均被歸類為可能致病，并且在PLEC基因中存在兩種錯義變異（外顯子 31；c.4757G>A 和外顯子 32；c.13172C>T；均被歸類為 VUS）。第二例患者在SYNE1基因中存在一種錯義變異（外顯子 87；c.16671T>A；VUS），在SGCA基因中存在一種錯義變異（外顯子 9；c.1109G>A；VUS），并且在NEB基因中存在兩種錯義變異（外顯子 134；c.20419T>C 和外顯子 168；c.23969C>T，均為 VUS）。診斷時，第一名患者 14 歲，可以行走；第二名患者 13 歲。撰寫本報告時，兩名患者分別為 27 歲和 29 歲，但目前行走狀況未知。

在具有兩種和三種基因變異的患者中（圖 4b），大多數(shù)具有其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)基因變異（2 種其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)基因變異：20 名患者和 3 種其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)基因變異：9 名患者）。只有少數(shù)具有雙重變異的患者的臨床數(shù)據(jù)可用（表 12）。兩例均為近親結婚的產物，一例（患者 1）的TMEM43和SYNE1基因有未知意義的變異，另一例（患者 4；表 12 ）的SYNE2和ANO5基因有未知意義的變異，這兩例患者都不能行走并患有脊柱側彎。此外，患者 2 是半行走能力，表現(xiàn)為肩胛骨翼狀，具有PLEC和LAMA2基因的雙重變異。另一方面，患者 3 被發(fā)現(xiàn)具有SYNE1和FLNC基因的未知意義的變異。但他仍然沒有癥狀并且看似正常。他曾接受過肌營養(yǎng)不良癥基因變異檢測，因為他已故的兩位叔叔有疑似 DMD 的癥狀。不幸的是，叔叔們沒有接受基因檢測。盡管如此，考慮到他的家族病史和其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)相關基因變異的存在，這個人必須保持謹慎。

表 12.患有兩種其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)變異且病情嚴重程度

需要注意的是：雖然一種或多種變異對所描述的肌營養(yǎng)不良癥的貢獻可能很大，但目前還無法就這些突變基因對疾病致病性的貢獻得出任何結論。

其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)與 DMD 具有重疊的臨床癥狀，在缺乏基因檢測選項的診所中很容易被誤診

肌營養(yǎng)不良基因檢測研究中的大多數(shù)患者來農村。由于農村診所目前不具備使用最先進的 NGS 方法診斷肌營養(yǎng)不良癥的能力，因此農村診所的醫(yī)生在診斷過程中嚴重依賴臨床表現(xiàn)。因此，在 961 名臨床疑似 DMD 患者中，近 15% 經 NGS 和 WES 分析證實患有其他肌營養(yǎng)不良癥和其他疾?。ㄒ姳?nbsp;2和表5），這并不奇怪。為了確定患者被誤診的原因，肌營養(yǎng)不良基因檢測選擇了九種常見的 DMD 癥狀，并詢問這些癥狀在肌營養(yǎng)不良基因檢測患者隊列中其他經基因確診的肌營養(yǎng)不良癥中出現(xiàn)的頻率。根據(jù)肌營養(yǎng)不良基因檢測在圖 5中的觀察，與經基因確診的 DMD 患者相比，所有考慮的 DMD 特異性癥狀都與肌營養(yǎng)不良基因檢測隊列中遇到的所有其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)相關，盡管頻率有所不同。LGMD2B 和 LGMD2E 患者的運動里程碑延遲癥狀更為明顯，與 DMD 患者相比，貝特萊姆肌病患者中足尖行走更為常見（圖 5）。然而，這些結論必須謹慎看待，因為在肌營養(yǎng)不良基因檢測的研究中，常染色體隱性遺傳病患者數(shù)量有限。

4.基因檢測大數(shù)據(jù)分析結果解讀

杜氏肌營養(yǎng)不良癥 (DMD) 通常根據(jù)臨床表現(xiàn)進行診斷，包括行走、站立和坐下困難、小腿肌肉肥大、跟腱早期攣縮、腿部肌肉無力、肌酸激酶水平升高、肌肉活檢異常以及確認的分子分析。在肌營養(yǎng)不良基因檢測的患者隊列中，肌營養(yǎng)不良基因檢測觀察到了其他臨床特征，例如足尖行走、頻繁跌倒、Gower 征和蹣跚步態(tài)。另一方面，肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 (LGMD) 是一類由 15 個或更多基因改變引起的多樣化遺傳疾病。這些基因改變會影響肌肉纖維，導致沒有特定或獨特的臨床特征來預測多樣化的基因型變異。由于臨床表現(xiàn)相互重疊且有時十分復雜，臨床醫(yī)生很難僅根據(jù)患者癥狀做出準確的臨床診斷。因此，LGMD 患者很容易被誤認為 DMD/BMD 患者，尤其是后者癥狀較輕時。本報告強調了從基因上準確診斷肌營養(yǎng)不良癥的必要性，并通過適當?shù)淖稍冇媱潓嵤┘膊」芾砗皖A防策略。

在 961 名先前描述的臨床疑似 DMD 患者中，靶向下一代序列分析結合全外顯子組測序 (WES) 顯示，105/961 (10.9%) 患有與其他肌營養(yǎng)不良癥相關的基因變異，包括 Bethlem 和 Ullrich 先天性肌病、Emery‐Driefuss 肌營養(yǎng)不良癥和肢帶型肌營養(yǎng)不良癥 (LGMD)。這些肌營養(yǎng)不良癥大多數(shù)被發(fā)現(xiàn)是常染色體隱性遺傳病，其中包括具有純合變異的患者以及少數(shù)具有復合雜合變異的患者。有趣的是，三分之一的其他肌營養(yǎng)不良癥患者被發(fā)現(xiàn)患有 LGMD2E，這是一種嚴重的 LGMD 形式，會影響非常年幼的兒童。另外 34/961 (3.5%) 名患者被發(fā)現(xiàn)患有其他疾病，包括夏科-馬里-圖斯病和桿狀體肌病等。一小部分患者 (6/961；0.6%) 盡管有 DMD 樣癥狀，但仍未確診，因為沒有已知的其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)基因變異。有趣的是，這六名患者中有三名在首次出現(xiàn)癥狀時經常跌倒和行走困難。雖然三人中的兩人在 28 歲和 14 歲時仍能行走，但一名患者在 10 歲時就無法行走了。這六個病例需要進一步檢查，也許可以通過全基因組測序，以精確識別可能導致診斷其潛在疾病的基因變異。

在墨西哥進行的一項類似研究中，72 名臨床懷疑患有肌營養(yǎng)不良癥且沒有DMD基因缺失證據(jù)的 18 歲以下無血緣關系男性，NGS 分析顯示 68% 患有DMD基因變異，12.5% 患有常染色體隱性 LGMD 相關基因型，包括 LGMD 類型 2A-R1、2C-R5、2E-R4、2D-R3 和 2I-R9。肌營養(yǎng)不良基因檢測臨床大數(shù)據(jù)分析中沒有 LGMD2B-R2 的原因是研究中納入的患者數(shù)量較少。

CAPN3基因是第一個與肌營養(yǎng)不良癥相關的非結構蛋白， 據(jù)報道該基因有 400 多個突變。然而，突變CAPN3在 LGMD2A 致病性中 的作用仍不清楚。眾所周知，LGMD2A 是全球最常見的 LGMD 類型。在一名疑似 LGMD2A 患者中發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象（表 6，患者 #5）。雖然該患者CAPN3基因（外顯子 18；c.2033A>T）的錯義突變雜合子與 LGMD 2A 有關，但進一步研究發(fā)現(xiàn)CLCN1基因（外顯子 18；c.1667T>A）存在第二個雜合突變，該突變與先天性肌強直（湯姆森?。┯嘘P?；谶@一觀察，該患者以及其他其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)相關基因存在多個突變的患者（甚至基因分析）的準確診斷仍不清楚。因此，需要注意的是，雖然一種或多種變異對所述肌營養(yǎng)不良癥的貢獻可能很大，但目前還無法就這些突變基因對疾病致病性的貢獻得出任何結論。

在 11 名被確診患有CAPN3變異的患者中， 由于兩名無血緣關系的患者具有相同的 CAPN3 基因突變，因此患者 #6（9 歲）和 #7（6 個月）之間的發(fā)病年齡存在令人驚訝的顯著差異（表6 ） 。進一步檢查兩名患者的突變譜后發(fā)現(xiàn)，雖然 #6 在CAPN3基因中發(fā)生純合突變（外顯子 18；c.2003T>G），但 #7 在 PLEC 基因中發(fā)現(xiàn)了另外兩個雜合變異（外顯子 28；c.4198G>A 和外顯子 32；c.8887G>A）。這些額外的變異可能導致后者發(fā)病年齡更早，這表明與肌肉功能相關的基因的多種突變可能共同導致疾病的嚴重程度。

之前對 238 名歐洲 LGMD2A 患者的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病平均年齡為 13.8±8.1 歲，范圍為 2-49 歲。該研究發(fā)現(xiàn) 30.7% 的患者在CAPN3基因中存在 c.2362AG>TCATCT 插入突變。在肌營養(yǎng)不良基因檢測的隊列中未觀察到此突變（表 6）。

LGMD2Q 的特征是近端肌肉無力，偶爾跌倒，爬樓梯困難，并且病程進展導致成年早期失去行走能力，這是由PLEC基因變異引起的 (Irwin McLean et al.,  1996 )。在 7 名患有PLEC基因變異的其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)患者中，有 4 名被發(fā)現(xiàn)具有PLEC基因復合雜合變異。另一方面，3/7 患者具有PLEC基因雜合變異以及DYSF（外顯子 34；c.3779G>A 和內含子 34；c.3898-4C>G）和LAMA2（外顯子 14；c.1963C>T）基因的其他變異（表 8）。此外，患者 1 和 6 僅含有雜合 PLEC 基因變異。因此，對這些患者進行進一步分析可能有助于了解PLEC基因中的單個或多個變異，加上與其他肌營養(yǎng)不良癥 (OMD)相關的基因中的其他變異是否會導致疾病。

肌營養(yǎng)不良基因檢測隊列中三分之一的常染色體隱性肌營養(yǎng)不良癥患者被發(fā)現(xiàn)具有與 LGMD2E 相關的SGCB基因變異。雖然 LGMD2E 的臨床癥狀各不相同，但診斷年齡通常在 10 歲以下。在十幾歲中后期，患者會喪失行走能力。肌營養(yǎng)不良基因檢測隊列中的 29 名 LGMD2E 患者中，近三分之二是近親結婚的產物。有趣的是，29 名無血緣關系的患者中有 18 名都屬于泰米爾納德邦，他們在SGCB基因的外顯子 4 中攜帶相同的 c.544A>C 變異，這可能會破壞肌營養(yǎng)不良蛋白復合體的完整性。在 8 個伊朗家族中也觀察到了類似的結果，這些家族具有相同的單倍型，其SGCB基因發(fā)生致病突變，導致外顯子 2 缺失，從而形成 β‐肌聚糖蛋白的跨膜結構域。這項研究還提出了奠基者效應（Mojbafan et al.,  2020 ）。在第二項來自伊朗的研究中，Alavi 等人表明，14 名 LGMD2E 患者中有 12 名發(fā)生缺失突變，導致SGCB基因外顯子 2 丟失。有趣的是，12 名出現(xiàn)這種缺失的患者中有 10 名來自伊朗南部和東南部，基于三個單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 標記的單倍型分析強烈表明存在奠基者效應的可能性）。在肌營養(yǎng)不良基因檢測隊列中，來自印度泰米爾納德邦同一地理區(qū)域的多名無親屬患者中發(fā)現(xiàn)SGCB基因的相同突變，這提示存在奠基者效應。要確認這一發(fā)現(xiàn)，需要更多患者樣本和進一步分析。這是首次報道印度 LGMD2E 患者中存在多名 c.544A>C 點變異。

此前已有研究表明，LGMD2E 是 LGMD 中最嚴重的類型之一。肌營養(yǎng)不良基因檢測患者隊列的數(shù)據(jù)證實了這一點，并進一步表明，當比較發(fā)病年齡和喪失行走能力的年齡時，LGMD2E 和 DMD 是相當?shù)摹＿@一觀察結果或許可以解釋為什么肌營養(yǎng)不良基因檢測的隊列中有大量 LGMD2E 患者被誤認為是 DMD 患者。

肌營養(yǎng)不良基因檢測的分析明確表明，不建議僅根據(jù)癥狀對患者進行診斷，因為這可能會導致多達 15% 的病例被誤診為 DMD，正如肌營養(yǎng)不良基因檢測在隊列中觀察到的那樣。因此，強烈建議使用明確定義的肌營養(yǎng)不良癥組通過 NGS 進行基因分析，并應將其納入肌營養(yǎng)不良基因檢測之前推薦的診斷工作流程（圖 1）中，用于出現(xiàn) DMD 樣癥狀的患者。使用這種方法的結果可能會影響治療以及患者及其家屬的咨詢，從而對患者的健康起著至關重要的作用。

肌營養(yǎng)不良基因檢測對印度泰米爾納德邦 LGMD 和其他常染色體隱性遺傳病患病率的研究不應得出任何流行病學結論，主要是因為肌營養(yǎng)不良基因檢測的研究最初旨在識別和診斷 DMD 患者，因此肌營養(yǎng)不良基因檢測臨床大數(shù)據(jù)分析僅考慮了男性。

通過對 961 名臨床疑似 DMD 患者進行完整的基因分析，肌營養(yǎng)不良基因檢測的研究結果表明，僅根據(jù)臨床標準，大約 15% 的患者可能會被誤診為患有 DMD。這項研究強調了進行完整的基因檢查以準確診斷肌營養(yǎng)不良癥和肌病患者的必要性。因此，疑似肌營養(yǎng)不良癥病例，尤其是那些疑似患有 DMD 的病例，如果在 mPCR 和 MLPA 分析后沒有得到確認的分子診斷，則需要通過下一代測序進行調查。這項工作將確認肌營養(yǎng)不良癥的類型，以便盡早啟動適當?shù)淖稍冇媱潱愿嬷A防策略并啟動治療方案（如果有）。這些全面的努力旨在提高患者的生活質量，并賦予攜帶者女性（如適用）和近親結婚的父母權力，使他們能夠做出明智的生育選擇，以阻止肌營養(yǎng)不良癥在社區(qū)中的傳播。