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【佳學(xué)基因檢測】 為什么線粒體病需要基因檢測分子診斷?

【佳學(xué)基因檢測】 為什么線粒體病需要基因檢測分子診斷? 線粒體病是兒童期常見的遺傳代謝病之一,發(fā)病率至少為1/5000。由于線粒體分布廣泛,多器官受累是本病臨床特點,常常累及腦、骨

佳學(xué)基因檢測】 為什么線粒體病需要基因檢測分子診斷?

 


線粒體病基因檢測導(dǎo)讀:

線粒體病是一種兒童常見的遺傳代謝疾病,患病率至少為1/5000。由于線粒體廣泛分布于人體各器官,因此該病的臨床特點是人體組織的多個器官會受到疾病的影響,常見受到影響的部位包括腦、骨骼肌、眼、耳、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟和血液系統(tǒng)等。

線粒體可視為人體的“能量工廠”,提供了90%以上的ATP,因此對于能量需求較大的組織,如腦、骨骼肌、肝臟、心肌和視網(wǎng)膜等,線粒體分布較多,反之亦然,造成了線粒體分布異質(zhì)性。

線粒體病的遺傳方式復(fù)雜,涉及到線粒體基因(mtDNA)的母系遺傳和核基因(nDNA)的孟德爾遺傳,遺傳異質(zhì)性較強,給基因診斷和分子檢測帶來了一定的困難。一般的診斷流程包括臨床表現(xiàn)、生化代謝和影像學(xué)檢查等,當(dāng)高度懷疑線粒體病時,需要進行基因檢測。如果基因檢測結(jié)果為陰性,應(yīng)重新進行臨床評估,若仍然懷疑線粒體病,則需要進行肌肉或皮膚活檢,并進行病理學(xué)分析和呼吸鏈酶學(xué)檢測,同時進行組織標(biāo)本的遺傳學(xué)分析。

由于線粒體病牽涉到多個基因,傳統(tǒng)的一代基因檢測方法需要逐個基因篩選,這不僅費時費力,而且成本高,同時檢出率也不盡如人意。自2009年起,隨著二代測序技術(shù)在線粒體病診斷中的應(yīng)用,基因診斷取得了巨大進步。這項技術(shù)的應(yīng)用使得我們能夠診斷和了解一些罕見的線粒體病,提高了診斷水平,但也帶來了一些新的困難。如何有效地將傳統(tǒng)的基因診斷方法與二代測序技術(shù)相結(jié)合,以及如何合理運用和解讀二代測序結(jié)果,是提高我國兒童線粒體病診治水平的關(guān)鍵問題。這需要廣大臨床醫(yī)生認(rèn)真思考和努力探索。

 

一、兒童常見線粒病的臨床表現(xiàn)及遺傳特點

1. 線粒體腦肌病伴乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作(mitochondrial encephalomyopathy,lactic acidosis,and stroke-like episodes,MELAS):

這是兒童時期賊常見的母系遺傳線粒體腦肌病,以進行性腦病、癲癇發(fā)作、眼瞼下垂、肌無力、易疲勞、乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作為特征,伴有多毛、身材矮小等。頭顱CT或MRI多表現(xiàn)為非血管分布的腦梗死樣改變,以頭部后面為主,后期出現(xiàn)皮質(zhì)及小腦萎縮,基底節(jié)區(qū)也可受累,表現(xiàn)為對稱性鈣化。當(dāng)臨床懷疑本病時,可以直接進行mtDNA A3243G檢測。80%的MELAS由編碼tRNA Leu基因的A3243G突變所引起,其次為tRNA Leu的T3271C,占7%-15%。其他致病突變包括G583A、C3256T、T3291C、G3697A、G4332A、G12147A、G13513A和A13514G等。

2. 肌陣攣癲癇伴破碎紅肌纖維(myoclonic epilepsy associated with ragged red fibers,MERRF):

這是另一種母系遺傳線粒體腦肌病,較MELAS少見,臨床以肌陣攣發(fā)作、癲癇、共濟失調(diào)和乳酸增高為主要特征。臨床懷疑本病時可直接進行mtDNA A8344G突變檢測。MERRF賊常見的mtDNA突變?yōu)榫幋atRNA Lys的A8344G,其他致病突變包括T8356C、G8363A、G12147A、7472insC等。

3. Leber遺傳性視神經(jīng)病(Leber hereditary optic neuropathy,LHON):

為母系遺傳的線粒體病,呈急性或亞急性起病,病前身體健康,以雙眼微痛性視力減退為主要表現(xiàn),雙側(cè)同時發(fā)病占25%,雙眼先后發(fā)病者占75%,間隔6-8周。男性青壯年好發(fā),G11778A、T14484C、G3460A 3種突變占LHON的95%以上。臨床懷疑LHON可直接檢測上述3種突變位點。

4. Kearns-Sayre綜合征(Kearns-Sayre syndrome,KSS)、Pearson綜合征和慢性進行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia,CPEO):

這是3種較常見的線粒體缺失綜合征,其發(fā)病機制相似,臨床癥狀取決于mtDNA缺失片段的大小及區(qū)域和在不同組織中的分布。除Pearson綜合征能在血液標(biāo)本中檢測到大片段缺失外,其他兩種只能在肌肉組織中檢出。

5. Leigh綜合征(Leigh syndrome,LS)又稱為亞急性壞死性腦脊髓病(subacute necrotizing encephalomyelopathy):

這是一種進行性神經(jīng)退行性疾病,是嬰幼兒期賊常見的線粒體腦病。其典型表現(xiàn)為認(rèn)知及運動功能的迅速退化,以及頭顱MRI顯示基底節(jié)或腦干對稱性病灶。

Leigh綜合征(LS)的遺傳特征復(fù)雜,表現(xiàn)出賊高的遺傳異質(zhì)性。該病與線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)中任意一種呼吸鏈酶復(fù)合物的缺陷或聯(lián)合缺陷有關(guān),其中以呼吸鏈酶復(fù)合物I和IV的缺陷賊為常見。此外,輔酶Q10缺陷和丙酮酸代謝障礙也可能引起該病。如果是由線粒體基因編碼的呼吸鏈酶復(fù)合物I、III、IV和V的缺陷引起的LS,則稱為母系遺傳的Leigh綜合征(MILS)。在MILS中,T8993G/C突變約占10%,其他突變?nèi)鏕13513A、T14487C等占10%-20%。

根據(jù)臨床表現(xiàn)和頭顱MRI的改變,臨床診斷LS并不困難。然而,由于致病基因的多樣性,傳統(tǒng)的一代基因檢測方法不僅耗時長、費用高,而且檢出率低。因此,二代基因檢測技術(shù)更適用于該病的診斷。

6. Alpers-Huttenlocher綜合征:

是由POLG基因突變導(dǎo)致的以藥物難治性癲癇、精神運動發(fā)育遲滯和肝臟受累為主的一種線粒體病,丙戊酸可誘發(fā)肝衰竭,多數(shù)患兒在發(fā)病后幾個月內(nèi)死亡,個別可生存數(shù)年。頭顱MRI顯示枕葉皮層急性缺氧改變。臨床懷疑本病時可檢測POLG基因。

二、線粒病的分子診斷如何選擇標(biāo)本和基因檢測技術(shù)?

有效地選擇樣本和基因檢測技術(shù)的前提是深入了解線粒體病的臨床和遺傳特點。只有掌握了這些特征,才能做出明智的選擇,避免走彎路,提高診斷正確率。線粒體病的臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜,有些呈現(xiàn)典型或非典型綜合征,而有些則無法歸類為特定的線粒體綜合征。同樣的臨床表型可能對應(yīng)不同的基因型,而同一基因型在不同患者身上可能表現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn),這些特征使線粒體病的診斷變得更加困難。

對于一些典型的線粒體綜合征,通過mtDNA熱點突變篩查可以確診大多數(shù)患者,例如,通過檢測A3243G突變可以確診MELAS,檢測A8344G突變可以確診MERRF,檢測G11778A、T14484C和G3460A三種突變可以確診LHON,檢測T8993G/C、G13513A和T14487C三種突變可以確診MILS。因此,mtDNA熱點突變篩查仍然是線粒體病分子診斷的首要步驟。當(dāng)血樣本未檢測到突變時,需要排除假陰性結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn),隨著年齡增長,血液中A3243G突變的檢測率逐漸降低,而尿液樣本的陽性率高于血液樣本,因此賊好同時檢測血液和尿液樣本。在排除假陰性結(jié)果后,如果mtDNA全基因組(16569bp)測序為陰性,則需要進行肌肉病理學(xué)檢查,并選擇肌肉樣本進行mtDNA全測序。在進行線粒體母系遺傳的分子學(xué)診斷過程中,必須考慮到組織分布的特異性。對于臨床表現(xiàn)不典型、無法歸類為特定綜合征的患者,也可以直接進行mtDNA全基因組測序。

由于LS遺傳復(fù)雜,賊好的辦法是通過組織標(biāo)本或皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)進行呼吸鏈酶活性測定,在酶學(xué)基礎(chǔ)上再進行基因篩查。線粒體疾病的基因檢測基因解碼的分析表明,180例線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物IV缺陷,47例發(fā)現(xiàn)SURFl基因突變;而國內(nèi)在145例LS中,僅2例發(fā)現(xiàn)SURF1基因突變。酶學(xué)檢測可以提高基因確診率,但組織酶活性測定需要嚴(yán)格的實驗室條件和技術(shù)要求,且為有創(chuàng)性檢查,建議直接采用基因檢測。

隨著二代測序技術(shù)的進步,通過基因捕獲技術(shù),能夠針對目標(biāo)基因或全外顯子進行高通量、簡便、快速、低成本的平行測序。這種方法使得大量候選基因或全外顯子可以同時進行測序,為一些線粒體病患者提供了避免創(chuàng)傷性檢查的可能性,從而在線粒體病的診斷方面取得了重大突破,尤其是對于Leigh綜合征(LS)和一些罕見的線粒體病。通過逐步認(rèn)識和了解這些通過基因確診的線粒體病的臨床表型,可以為未來的診斷提供重要的線索,總結(jié)規(guī)律,縮小篩查范圍,甚至可以直接通過一代Sanger測序來進行致病基因的檢測。

舉例來說,佳學(xué)基因病例集中曾經(jīng)收治過一個2歲3個月的患者,表現(xiàn)為松軟兒癥狀,乳酸輕度增高,尿代謝篩查提示甲基丙二酸輕度增高,血液串聯(lián)質(zhì)譜顯示丙酰肉堿(C3)、甲基丙二酰肉堿(C4DC)輕度升高,頭顱MRI示雙側(cè)尾狀核頭部、殼核對稱性異常。盡管臨床上不符合甲基丙二酸尿癥的表現(xiàn),但考慮到可能是LS。然而,直到3年后,通過佳學(xué)基因的靶向基因捕獲測序,臨床醫(yī)師才確診為SUCLA2基因的突變,明確將患者診斷為線粒體DNA耗竭綜合征。有了這一經(jīng)驗,第2例患者通過基因檢測,很快就得到了確定性診斷。

 

三、對線粒體的基因檢測結(jié)果如何進行分析和解讀?

進行mtDNA全基因組測序不僅可以篩查致病性點突變和片段缺失,還能檢測到一些致病性不明的點突變。然而,在基因診斷中存在一些陷阱,需要結(jié)合豐富的遺傳學(xué)知識和臨床經(jīng)驗做出判斷。例如,D-loop是線粒體DNA環(huán)上少有的非編碼區(qū),一般來說,檢測到D-loop區(qū)的突變通常不會導(dǎo)致疾病。

mtDNA全基因組包含37個基因,共計16569個堿基對,呈裸露的環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu),不含有內(nèi)含子。由于氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的大量氧自由基,線粒體DNA較易發(fā)生突變,其突變率比核DNA高出10至17倍,而且線粒體DNA本身不具備自我修復(fù)的能力。

目前,人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫MITOMAP(http://www.mitomap.org)收錄了60個已被證實的致病點突變。如果在檢測中發(fā)現(xiàn)了這些突變,并且臨床表型也符合,那么可以做出確診。鑒于線粒體遺傳多為母系遺傳,建議進行母系成員的致病突變檢測,同時采樣血液和尿液以避免假陰性結(jié)果。

然而,對于已有報道的突變,需要進行嚴(yán)格的分析,而不是盲目下診斷。首先,要確認(rèn)臨床表現(xiàn)是否相符,其次要檢索突變是否影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能,并查看是否有相關(guān)的功能研究支持。舉例來說,我們曾診斷一名患有線粒體DNA耗竭綜合征的兒童,但檢測到的mtDNA G5821A 100%突變被文獻報道為與耳聾相關(guān),與患者的臨床表現(xiàn)不符,且致病意義不明。因此,不能單純依據(jù)此突變進行診斷。

因此,對于通過mtDNA全基因組測序發(fā)現(xiàn)的突變,必須進行嚴(yán)格的篩查。只有那些在人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫MITOMAP中已被證實為致病性的突變才能做出確診,對于尚未經(jīng)過證實的突變,需要慎重評估后才能做出診斷。

針對核基因的靶向捕獲測序結(jié)果,如果發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有報道的致病性突變,并且該突變與患者的臨床表現(xiàn)和遺傳方式相符合,那么可以做出診斷。

然而,對于尚未報道過的新突變,臨床醫(yī)生需要結(jié)合遺傳學(xué)意義和臨床綜合分析,從以下幾個方面進行致病性的推測:

非已知的單核苷酸多態(tài)性(SNPs):查詢SNPs數(shù)據(jù)庫,并在大規(guī)模正常對照群體(如千人基因組或本地正常人)中確認(rèn)未檢測到此變異。

突變對蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響:此類突變可能包括移碼、剪切、缺失和無義突變,或者經(jīng)過功能預(yù)測軟件預(yù)測位于高度保守區(qū)、導(dǎo)致氨基酸變異較大的錯義突變。

符合孟德爾遺傳特征:突變符合孟德爾遺傳規(guī)律,即在家系中呈現(xiàn)經(jīng)典的遺傳模式。

通過以上分析,可以對新突變的致病性進行初步的推測和評估。

無論是傳統(tǒng)測序還是二代測序診斷線粒體病,其確診率仍然維持在30%左右。線粒體的結(jié)構(gòu)和功能涉及1500多個基因,但目前已發(fā)現(xiàn)的致病基因僅有200余個,這意味著基因診斷率并不高。 對于那些基因檢測結(jié)果為陰性,但臨床上仍然高度懷疑患有線粒體病的患者,需要進行組織標(biāo)本的酶活性檢測。呼吸鏈酶復(fù)合物I是其中分子量賊大、結(jié)構(gòu)賊復(fù)雜的部分,含有44個亞基。已經(jīng)確定其中有7個亞基由線粒體基因編碼,另外由核基因編碼的16個亞基基因突變與線粒體病有關(guān),但其余的亞基致病性尚不清楚,這意味著大約一半的亞基的致病性還不為人所知。 

綜上所述,線粒體病是一種臨床和遺傳異質(zhì)性較高的疾病。在診斷典型線粒體綜合征時,應(yīng)首先選擇敏感的組織進行熱點突變篩查,而不是盲目進行二代測序。 隨著遺傳學(xué)檢測技術(shù)的飛速發(fā)展,檢測成本不斷降低,檢測時間不斷縮短,這為遺傳異質(zhì)性較強和罕見的線粒體病帶來了新的機遇和發(fā)展。相信在不久的將來,會有越來越多的致病基因被發(fā)現(xiàn),越來越多的線粒體病得到診斷。這不僅將為患者的治療和預(yù)后評估提供重要依據(jù),還將為患者及其家屬提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務(wù)。同時,這也將為線粒體病發(fā)病機制和靶向治療的研究奠定基礎(chǔ)。

(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)
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