【佳學(xué)基因檢測】結(jié)直腸癌基因檢測明確患者癌癥的與眾不同

腫瘤基因解碼基因檢測如何增加檢測的準確性？

腫瘤基因解碼發(fā)現(xiàn)RNF43基因的功能缺失突變通過穩(wěn)定Frizzled受體而誘導(dǎo)Wnt配體依賴的Wnt/β-catenin信號通路的激活,這種情況常見于由齒狀息肉腺瘤發(fā)展而來的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)型結(jié)直腸癌(結(jié)直腸癌(CRC))中。然而,RNF43突變?nèi)绾未龠M腫瘤發(fā)生的機制對基于數(shù)據(jù)庫比對的基因檢測來說還不清楚。在腫瘤致病基因鑒定基因解碼中,結(jié)直腸癌基因檢測建立了9個人類結(jié)直腸癌(CRC)來源的類器官,發(fā)現(xiàn)其中3個類器官系攜帶與MSI-高和BRAF V600E突變相關(guān)的RNF43移碼突變,表明這些結(jié)直腸癌(CRC)是通過鋸齒狀通路發(fā)展而來的。RNF43移碼突變的類器官需要Wnt配體和R-spondin來增殖,這表明R-spondin對ZNRF3的抑制和保留的RNF43功能是實現(xiàn)腫瘤發(fā)生所需的不可或缺的Wnt激活水平的必要條件。然而,RNF43突變類器官中的活性β-catenin水平低于APC雙擊突變的結(jié)直腸癌(CRC),這表明通過鋸齒狀通路發(fā)展的結(jié)直腸癌(CRC)具有較低的Wnt激活閾值。有趣的是,將RNF43突變的類器官與腸道肌成纖維細胞一起移植加速了異種移植瘤中β-catenin的核積累和增殖,表明基質(zhì)細胞在促進RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞的惡性表型中起關(guān)鍵作用。對亞克隆類器官細胞表達轉(zhuǎn)錄本的測序顯示,兩個類器官系攜帶單等位基因RNF43順式突變,即兩個RNF43移碼突變引入同一等位基因而野生型RNF43等位基因保留,而另一個類器官系攜帶雙等位基因RNF43反式突變。這些結(jié)果表明,雜合RNF43移碼突變通過鋸齒狀通路促進結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展;然而,與單擊突變相比,第二次RNF43突變可能通過進一步激活Wnt信號而在腫瘤發(fā)生中更具優(yōu)勢。最后,PORCN抑制劑治療顯著抑制了RNF43突變細胞來源的PDX腫瘤發(fā)展。這些結(jié)果揭示了RNF43突變相關(guān)結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展的新機制,以及Wnt配體抑制對RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)的治療潛力。

結(jié)直腸癌基因檢測明確患者癌癥的與眾不同關(guān)鍵詞

RNF43、鋸齒狀通路、結(jié)直腸癌、類器官、Wnt配體、PORCN抑制劑

腫瘤基因解碼為什么要關(guān)注結(jié)直腸癌基因檢測的全面性？

Wnt信號通路在成體組織干細胞的維持中起作用，這一過程由破壞復(fù)合物調(diào)控，其中GSK3磷酸化β-catenin，導(dǎo)致β-catenin通過泛素-蛋白酶體途徑降解。Wnt信號也在受體水平受到調(diào)控；即E3連接酶RNF43和ZNRF3通過泛素化Wnt受體Frizzled（FZD）來下調(diào)Wnt信號，導(dǎo)致其周轉(zhuǎn)。小鼠遺傳學(xué)腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼表明，同時破壞腸道中的Rnf43和Znrf3會導(dǎo)致Wnt配體獨立生長和通過Wnt信號激活發(fā)展成腸道腫瘤。

與此一致，在約18%的結(jié)直腸癌（結(jié)直腸癌(CRC)）病例中發(fā)現(xiàn)了RNF43的遺傳改變。RNF43突變也在卵巢、胃和胰腺癌中被發(fā)現(xiàn)。在遺傳性鋸齒狀息肉病中，發(fā)現(xiàn)了RNF43的胚系突變，并且通過雜合性丟失（LOH）的第二次打擊失活也在腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。此外，在卵巢癌中也報道了野生型RNF43的丟失。這些結(jié)果表明RNF43的雙擊突變在促進腫瘤發(fā)生中起作用。

鋸齒狀腸腺瘤被認為是結(jié)直腸癌(CRC)的前體病變。值得注意的是，齒狀腺瘤和鋸齒狀通路型結(jié)直腸癌(CRC)中的RNF43突變與BRAF V600E突變和CpG島甲基化表型（CIMP）相關(guān)，導(dǎo)致MLH1啟動子的甲基化，這進一步引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI），而不需要DNA錯配修復(fù)基因突變。此外，在胃、食道和子宮內(nèi)膜的MSI癌癥中也檢測到RNF43突變，表明RNF43突變是MSI型癌癥的主要驅(qū)動因素。更進一步，在Rnf43 -/- 小鼠中，結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸腫瘤發(fā)展加速，使用Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子的體內(nèi)篩選確定Rnf43是腸道腫瘤發(fā)生的候選驅(qū)動因子。綜合這些結(jié)果表明，由RNF43功能障礙引起的FZD受體水平增加通過Wnt信號激活驅(qū)動腸道腫瘤發(fā)生，特別是在通過鋸齒狀通路發(fā)展的MSI-結(jié)直腸癌(CRC)中。Wnt被棕櫚?；疧-?；?a href='http://lucasfraser.com/cp/chabiyin/cancer/2024/77267.html' target='_blank'>轉(zhuǎn)移酶（PORCN）棕櫚?；?，這對Wnt分泌是必需的，PORCN抑制劑抑制了RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞的生長。與此一致，轉(zhuǎn)化腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼表明PORCN抑制是針對Wnt配體依賴性癌癥的有效治療策略。

最近的腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼已經(jīng)確定了RNF43突變類型與其致瘤潛力之間的聯(lián)系。然而，關(guān)于RNF43突變的遺傳信息仍不足以理解結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展的機制。此外，已經(jīng)顯示37%的Wnt配體依賴性胰腺癌細胞需要外源性Wnt配體，而其他細胞利用內(nèi)源性Wnt配體。這種細胞類型差異在結(jié)直腸癌(CRC)中尚未得到很好的表征。

在本腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼中，結(jié)直腸癌基因檢測建立了人類結(jié)直腸癌(CRC)來源的類器官，并在CIMP-高/MSI-高結(jié)直腸癌(CRC)中發(fā)現(xiàn)了RNF43移碼突變。重要的是，RNF43突變的類器官依賴于內(nèi)源性或外源性Wnt配體，PORCN抑制劑顯著抑制了類器官增殖和異種移植瘤發(fā)生。此外，對亞克隆細胞來源轉(zhuǎn)錄本的測序表明，雜合單等位基因RNF43突變驅(qū)動結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)展，而第二次打擊突變可能對腫瘤發(fā)生有利。

如何進行腫瘤致病基因鑒定基因解碼？

全外顯子組測序

使用原始類器官細胞（非亞克?。┻M行全外顯子組測序。使用NucleoSpin Tissue XS（Macherey-Nagel，杜倫，德國）提取基因組DNA。使用SureSelect Human All Exon V6試劑盒（Agilent，弗里蒙特，加利福尼亞州，美國）制備雙端文庫，并使用Illumina NovaSeq 6000進行測序（外包給Takara Bio，草津，日本）。生成的fastq文件使用DRAGEN Bio-IT平臺（Illumina，圣迭戈，加利福尼亞州，美國）映射到人類參考基因組版本GRCh37（hg19）上。檢查了APC、CTNNB1、RNF43、ZNRF3、KRAS、BRAF、TGFBR2、ACVR2A和TP53基因中的移碼突變、無義突變和已報道的致癌突變。

CIMP分析

使用EpiTect Bisulfite試劑盒（Qiagen，希爾登，德國）對基因組DNA進行亞硫酸氫鈉修飾。通過亞硫酸鹽焦磷酸測序分析經(jīng)典CIMP標記物（MINT1、MINT2、MINT31、MLH1和CDKN2A）和新CIMP標記物（CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3和SOCS1）的DNA甲基化水平，如先前所述。

MSI分析

提取基因組DNA，并根據(jù)修訂的貝塞斯達指南對兩個單核苷酸（BAT25和BAT26）和兩個雙核苷酸（D2S123和D5S346）微衛(wèi)星標記物（System Biotics，相模原，日本）進行MSI分析。如果這些標記物中有兩個或更多顯示不穩(wěn)定性，則將樣本診斷為MSI-高。

RNF43密碼子370的基因分型

使用TaqMan SNP基因分型檢測（Applied Biosystems，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州，美國）檢查RNF43密碼子370的基因型。野生型RNF43密碼子370（VIC）和p.Rpo370fs（FAM）的TaqMan引物和探針序列在補充材料和方法中提供。使用Mx3000P（Stratagene，拉霍亞，加利福尼亞州，美國）的等位基因判別/SNP系統(tǒng)分析PCR結(jié)果。合成定制的RNF43 p.Pro370fs cDNA以獲得純合突變對照。

人類基因表達數(shù)據(jù)庫分析

從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）下載人類結(jié)直腸癌(CRC)表達數(shù)據(jù)。提取攜帶APC深度缺失（n = 19）或在密碼子659 N端的RNF43移碼突變（n = 12）的結(jié)直腸癌(CRC)表達數(shù)據(jù)，并使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）（Ingenuity Systems，Qiagen；www.ingenuity.com）檢查上游調(diào)節(jié)因子。Z-score ≥2且P值<0.05被認為表示具有統(tǒng)計學(xué)意義的激活。

腫瘤致病基因鑒定基因解碼如何增加結(jié)直腸癌致病及靶向藥物基因檢測的準確性？

腫瘤的致病基因鑒定基因解碼先前的工作已經(jīng)明確，具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的鋸齒狀息肉更容易發(fā)展為結(jié)直腸癌（結(jié)直腸癌(CRC)）。RNF43突變常見于無蒂鋸齒狀病變（SSL）和MSI型結(jié)直腸癌(CRC)中，表明RNF43突變可能通過鋸齒狀途徑驅(qū)動結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展。結(jié)直腸癌基因檢測的腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼發(fā)現(xiàn)，在CIMP高和MSI高的結(jié)直腸癌(CRC)衍生類器官中存在RNF43移碼突變，這些突變與BRAF V600E突變相關(guān)。

值得注意的是，RNF43突變型結(jié)直腸癌(CRC)中的活性β-catenin水平明顯低于APC雙擊突變結(jié)直腸癌(CRC)，且僅在APC突變型結(jié)直腸癌(CRC)中觀察到β-catenin的核積累。這表明鋸齒狀途徑腫瘤發(fā)生的Wnt激活閾值低于常規(guī)途徑。有腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼報道，與非超突變結(jié)直腸癌(CRC)相比，MSI高超突變結(jié)直腸癌(CRC)中的Wnt激活程度顯著降低。常規(guī)途徑中，高水平的Wnt激活可能是形成腺瘤性息肉所必需的初始事件，如在Apc Δ716基因敲除小鼠中觀察到的。盡管在Rnf43 −/− Znrf3 −/− 復(fù)合突變小鼠腸道中發(fā)現(xiàn)了腺瘤性增生，但在Rnf43 −/− 單突變小鼠中未觀察到此現(xiàn)象。這些結(jié)果暗示RNF43突變誘導(dǎo)的Wnt激活程度可能不足以啟動常規(guī)型結(jié)直腸癌(CRC)，但可以促進鋸齒狀途徑腫瘤發(fā)生。

腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼中，所有RNF43移碼突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞均以R-spondin依賴的方式增殖。這表明可能需要通過R-spondin抑制ZNRF3功能并保留RNF43功能，才能達到RNF43突變細胞中腫瘤發(fā)生所需的Wnt信號水平。

先前腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼報道，卵巢腫瘤和鋸齒狀結(jié)腸腫瘤中存在導(dǎo)致野生型RNF43丟失的LOH或二次體細胞突變，這暗示RNF43可能需要兩次突變失活才能發(fā)生腫瘤。然而，結(jié)直腸癌基因檢測的結(jié)果顯示C14和C24細胞中存在雜合的單等位基因RNF43突變，表明RNF43的雙等位基因失活可能不是鋸齒狀通路腫瘤發(fā)展的必要條件。另一方面，結(jié)直腸癌基因檢測在C45細胞中發(fā)現(xiàn)RNF43存在兩次雙等位基因突變，這提示RNF43的兩次突變可能通過增加Wnt激活水平促進結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)展。此外，結(jié)直腸癌基因檢測還發(fā)現(xiàn)RNF43中p.Pro370fs和p.Gly659fs的順式突變位于同一等位基因。最近的分析表明，RNF43最常見的突變p.Gly659fs會輕微損害RNF43功能，而N端截斷突變在增加Wnt信號活性方面比C端突變更有效。因此，p.Gly659fs突變可能在C14和C24腫瘤發(fā)生的早期階段引入，導(dǎo)致Wnt信號略有增加。隨后在相同等位基因處引入另一個N端p.Pro370fs突變，可能通過進一步增加Wnt活性促進腫瘤的發(fā)生。

值得注意的是，將RNF43移碼突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞與肌成纖維細胞共移植可增加β-catenin核積累和PDX腫瘤細胞增殖，表明RNF43突變細胞的惡性表型高度依賴于基質(zhì)細胞。多項腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼已證實Wnt信號在轉(zhuǎn)移中的作用：Wnt激活通過增加核Smai2表達促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而β-catenin和FOXO3的核積累則加速結(jié)腸癌細胞的肝轉(zhuǎn)移。因此，轉(zhuǎn)移性微環(huán)境細胞可能通過激活Wnt信號在播散性RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼證明ETC-159治療可顯著抑制RNF43突變PDX腫瘤。因此，進一步腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼PORCN抑制劑是否可以抑制RNF43突變細胞轉(zhuǎn)移灶的發(fā)展對未來臨床策略具有重要意義。

總之，結(jié)直腸癌基因檢測建立了RNF43移碼結(jié)直腸癌(CRC)衍生的類器官。腫瘤遺傳性與靶向藥物基因解碼發(fā)現(xiàn)，RNF43突變鋸齒狀通路結(jié)直腸癌(CRC)的Wnt/β-catenin活化水平低于常規(guī)通路型結(jié)直腸癌(CRC)。雜合RNF43移碼突變可能通過鋸齒狀通路促進腫瘤發(fā)生，而二次RNF43突變可能通過增加Wnt活化水平進一步促進結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展。最后，PORCN抑制顯著抑制了RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)細胞的PDX腫瘤發(fā)展，表明PORCN抑制劑可能是針對RNF43突變結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)展和轉(zhuǎn)移的有效治療策略。

以基因解碼為基礎(chǔ)的腫瘤遺傳性及靶向藥物基因檢測具有什么樣的特點？

基因解碼為基礎(chǔ)的腫瘤遺傳性及靶向藥物基因檢測增加結(jié)直腸癌致病及靶向藥物基因檢測的準確性和全面性，主要是從以下幾個方面考慮:

擴大基因檢測范圍:

除了傳統(tǒng)的APC、KRAS、BRAF等基因外，還應(yīng)包括:

RNF43、ZNRF3等Wnt信號通路相關(guān)基因

MLH1、MSH2等錯配修復(fù)基因

CIMP相關(guān)標記基因如CACNA1G、IGF2等

新發(fā)現(xiàn)的驅(qū)動基因如TGFBR2、ACVR2A等

采用多組學(xué)檢測方法:

全外顯子組測序:檢測編碼區(qū)突變

全基因組測序:檢測大片段缺失、重排等

RNA測序:檢測基因融合和表達異常

甲基化測序:檢測CIMP狀態(tài)

蛋白質(zhì)組學(xué):檢測蛋白功能異常

提高檢測靈敏度:

使用高深度測序

采用數(shù)字PCR等高靈敏度技術(shù)

液體活檢ctDNA檢測

關(guān)注基因突變的具體類型和位置:

區(qū)分激活突變和失活突變

注意突變的功能域位置

分析突變的等位基因狀態(tài)(雜合/純合)

建立綜合評分系統(tǒng):

整合多個基因的突變情況

考慮基因間的相互作用

納入臨床病理特征

開發(fā)人工智能算法:

機器學(xué)習(xí)模型預(yù)測致病性

深度學(xué)習(xí)分析復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

建立大規(guī)模數(shù)據(jù)庫:

收集更多患者樣本數(shù)據(jù)

整合多中心研究結(jié)果

定期更新數(shù)據(jù)庫

重視功能驗證:

體外細胞實驗驗證基因功能

動物模型驗證致病機制

臨床試驗驗證靶向藥物效果

關(guān)注腫瘤異質(zhì)性:

多區(qū)域取樣

單細胞測序分析

動態(tài)監(jiān)測腫瘤進展

結(jié)合臨床信息:

分析基因型-表型相關(guān)性

考慮患者個體差異

納入治療反應(yīng)和預(yù)后信息

通過以上方法,可以更全面、準確地鑒定結(jié)直腸癌致病基因和靶向藥物靶點,為精準醫(yī)療提供有