【佳學(xué)基因檢測(cè)】采用全外顯子組測(cè)序?qū)?a href='http://lucasfraser.com/cp/shengzhi/' target='_blank'>不孕不育中的巨精子癥進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)

遺傳病、罕見(jiàn)病基因檢測(cè)

精子癥是一種與男性不育癥相關(guān)的罕見(jiàn)精子形態(tài)異常，其特征是高比例的精子頭部不規(guī)則。采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)的目的是確定導(dǎo)致巨精子癥不育男性的基因原因。

采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)方法

用患者及其父母的外周血基因組 DNA 進(jìn)行全外顯子組測(cè)序 (WES)通過(guò)基因解碼在眾多突變體中找出致病基因突變。

采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)結(jié)果

來(lái)自近親家庭的巨精子癥患者進(jìn)行 WES 分析后，可以在 AURKC 基因 (c.269G>A) 中鑒定出一個(gè)新的純合錯(cuò)義變異體。生物信息學(xué)分析也表明這種變異是一種致病突變。定量實(shí)時(shí) PCR 分析表明，與他的父親相比，患者 AURKC 的 mRNA 水平顯著降低。此外，ICSI 后無(wú)法移植胚胎。

采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)結(jié)論

些結(jié)果進(jìn)一步支持 AURKC 在男性不育癥中的重要作用，并指導(dǎo)醫(yī)生為巨精子癥患者做出賊佳決策。

采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)關(guān)鍵詞：

精子癥，AURKC，輔助生殖技術(shù)，全外顯子組測(cè)序
 

球約有 7000 萬(wàn)對(duì)夫婦患有不孕癥，其中約一半是由男性因素造成的。巨精子癥是一種與男性不育癥相關(guān)的罕見(jiàn)精子形態(tài)異常，其特征是高比例的精子頭部不規(guī)則。這種綜合征于 1977 年新穎報(bào)道，影響不到 1% 的不育男性。它被認(rèn)為是一種常染色體隱性遺傳類(lèi)型的畸形精子癥，可導(dǎo)致男性不育。目前，已在巨精子癥患者中發(fā)現(xiàn)的賊相關(guān)的單基因缺陷是極光激酶 C ( AURKC ) 的突變。
AURKC基因編碼高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員，該家族在中心體功能、同源染色體分離和減數(shù)分裂期間的胞質(zhì)分裂中起著至關(guān)重要的作用。到目前為止，只有五個(gè)AURKC突變被描述為與巨精子癥相關(guān)：c.144delC (p.L499Wfs22)、c.744C>G (p.Y248*)、c686G>A (p.C229Y)、c.930 +38G>A（發(fā)生在 3′-UTR）和 c.436-2A>G（導(dǎo)致外顯子 5 跳躍的剪接位點(diǎn)突變）。人類(lèi)的這些突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能降低，導(dǎo)致減數(shù)分裂失敗，但精子發(fā)生不受影響，導(dǎo)致大頭精子的產(chǎn)生。
在這里，采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)報(bào)告了通過(guò)全外顯子組測(cè)序鑒定的來(lái)自近親家庭的不育男性的AURKC基因中的一種新型純合錯(cuò)義變異。此外，根據(jù)基因解碼分析，該變體具有很高的致病概率。還進(jìn)行了 ICSI，但未能生成任何適合移植的胚胎。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了AURKC在男性不育癥中的重要作用，并指導(dǎo)醫(yī)生為巨精子癥患者做出賊佳決策。
 

病人

證者是一名在佳學(xué)基因合作醫(yī)院接受不孕癥治療的 27 歲女性。患者丈夫的精液檢查結(jié)果見(jiàn)表1。 結(jié)果顯示，該患者患有巨精子癥（接近 100% 的大頭精子，精子數(shù)為 1 M/ml）。按照佳學(xué)基因不孕不育癥標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)詢(xún)表，得知患者丈夫的的父母為一級(jí)表親（圖 1）?；颊弑憩F(xiàn)出正常的勃起和射精，并報(bào)告每周性交 2-3 次；然而，他的妻子自2015年結(jié)婚以來(lái)一直無(wú)法懷孕?；颊邲](méi)有不健康的活動(dòng)或接觸不良化學(xué)物質(zhì)的歷史。體檢示男性外生殖器發(fā)育正常，雙側(cè)睪丸大小正常，雙側(cè)精索靜脈觸診無(wú)異常。先證者沒(méi)有原發(fā)性小頭畸形或呼吸道疾病?；颊呷旧w核型正常（46；XY），Y染色體未見(jiàn)缺失?；颊呒に厮秸?。

表1：患者射精的精子參數(shù)和形態(tài)

基因組 DNA 提取和全外顯子組測(cè)序 (WES)

據(jù)試劑盒生產(chǎn)者的方案，使用 QIAamp DNA blood midi 試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）從外周血樣本中提取患者及其父母的基因組 DNA。

證者及其父母的基因組 DNA 接受了基于全基因組的的全外顯子測(cè)序分析。全外子組基因測(cè)序基因檢測(cè)由佳學(xué)基因在在 HiSeq2000 測(cè)序平臺(tái)（Illumina，San Diego，CA，USA）上進(jìn)行。移除序列接頭后，使用 Burrows-Wheeler 比對(duì)器將全外顯子組測(cè)序測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組 Hg19 比對(duì)，然后移除 PCR 重復(fù)項(xiàng)。使用 SAMtools 識(shí)別包括單核苷酸多態(tài)性和插入缺失在內(nèi)的變體，并通過(guò) ANNOVAR 軟件進(jìn)行注釋。候選基因被認(rèn)為是滿(mǎn)足以下標(biāo)準(zhǔn)的變體：(i) 錯(cuò)義、無(wú)意義、移碼和剪接位點(diǎn)變體，(ii) 在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（dbSNP，1000G）中不存在或罕見(jiàn)（頻率低于 1%）， (iii) 患者的純合子變異及其父母的雜合子變異。

Sanger測(cè)序驗(yàn)證

用 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證了先證者及其父母的 AURKC 突變。我們使用特定引物（正向引物為 5'-AACCAGGATTCGAGTGTCTG-3'，反向引物為 5'-CAATCTCCAGGTAGACGATGGAG-3'）擴(kuò)增 AURKC 基因外顯子 3 的 PCR 產(chǎn)物。然后，在 ABI 3730XL 自動(dòng)測(cè)序儀（Applied Biosystems，F(xiàn)orster City，CA，USA）上對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

RNA提取和Q-PCR

用制造商的方案使用 TRI REAGENT® BD（分子研究中心）對(duì)全血進(jìn)行 RNA 提取。用 5 μl 提取的 RNA 在患者及其父母身上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。oligo-dT 的雜交通過(guò)在 42°C 下孵育 30 分鐘并使用以下混合物在冰上淬滅來(lái)進(jìn)行：5 μl RNA、10 μl 2Xsupermix（10 mM，Pharmacia）、1 μl gDNA（0.5 mM， Roche 診斷）和 4 μl H 2 O。然后使用 StepOne-PlusTM 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)（Life Technologies）和 Power SYBR Green PCR，將 2 μl 獲得的 cDNA 混合物用于定量 PCR（Q-PCR） Master Mix (Life Technologies) 根據(jù)制造商的協(xié)議?；虮磉_(dá)倍數(shù)變化的定量是通過(guò)相對(duì)定量法 (2−ΔΔCT ) 使用gapdh基因作為參考。數(shù)據(jù)顯示為平均值的平均倍數(shù)增加標(biāo)準(zhǔn)誤差。補(bǔ)充文件 1中描述了引物。

ICSI、胚胎和胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)

患者及其妻子在佳學(xué)基因合作醫(yī)院接受了胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)試劑生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用 Vitrolife G-SERIES™ 培養(yǎng)基（Vitrolife，瑞典哥德堡）進(jìn)行胚胎培養(yǎng)?；颊叩钠拮咏邮芰艘粋€(gè) ICSI 周期。“結(jié)果”部分描述了詳細(xì)結(jié)果。

AURKC 蛋白的序列比對(duì)

用 ClustalX2.1 對(duì)不同物種的 AURKC 蛋白進(jìn)行序列比對(duì)。每個(gè)物種的相應(yīng)分子代碼如下：Homo sapiens ( NP_001015878.1 ), Mus musculus ( AAI00338.1 ), Bos Taurus ( NP_001180124.1 ), Desmodus rotundus ( XP_024425801.1 ), Pan paniscus ( XP_003816716.1 ), Pongo abelii ( XP_002829903.1 ) 和褐家鼠( NP_001295465.1 )。

一例巨精子癥患者的WES分析

了確定引起巨精癥的來(lái)自基因序列變化的遺傳原因，男性不孕癥基因解碼基因檢測(cè)使用患者及其父母的外周血基因組 DNA 進(jìn)行了男性不孕癥致病基因鑒定基因解碼基因檢測(cè)，以確定可能存在的致病突變?？紤]到血緣家族史，基因解碼過(guò)程中首先關(guān)注純合突變。在排除頻繁基因突變和應(yīng)用技術(shù)和生物過(guò)濾器之后，建立了有限的純合突變列表。為了確定這 36 個(gè)基因中的任何一個(gè)是否與巨精癥有關(guān)，基因解碼首先檢查了每個(gè)基因的組織表達(dá)模式。在這些純合變異基因中，只有兩個(gè)基因表現(xiàn)出睪丸富集表達(dá)。已鑒定的基因之一是 AURKC，基于基因解碼的全外顯子測(cè)序基因檢測(cè)在患者的外顯子 3 中鑒定出一個(gè)新突變（c.269G>A，GenBank 登錄號(hào)，NM_001015878）。因此，氨基酸的變化被確定為Arg90Gln。另一個(gè)已鑒定的基因是配子發(fā)生素 ( GGN ) ，這個(gè)基因發(fā)生的突變是c.148T>C，GenBank 登錄號(hào)，NM_152657.3。 在外顯子 3 中被 WES 在患者中鑒定出來(lái)。因此，氨基酸的變化被確定為T(mén)rp50Arg。

圖 2：近親家族的全外顯子組測(cè)序分析。A本研究中使用的過(guò)濾策略。B受影響患者及其父母的 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證。箭頭表示突變位點(diǎn)?；颊呒捌涓赣HAURKC mRNA 表達(dá)的C Q-PCR 分析。通過(guò) Q-PCR 確定的信使 RNA 表達(dá)計(jì)算為相對(duì)于gapdh的比率，并相對(duì)于他的父親表達(dá)。D不同物種中 AURKC 蛋白的序列比對(duì)。箭頭指的是突變位點(diǎn)

通過(guò) Sanger 測(cè)序驗(yàn)證

們接下來(lái)進(jìn)行了 Sanger 測(cè)序，以驗(yàn)證患者及其父母AURKC和GGN基因的純合變異。使用 PCR 從患者及其父母的基因組 DNA 中擴(kuò)增AURKC基因的外顯子 3 。AURKC中的純合錯(cuò)義變異在該患者中得到驗(yàn)證，并且他的父母具有雜合等位基因（圖 2B）。

AURKC中已識(shí)別變體的不利影響

幸的是，我們無(wú)法獲得受影響患者及其父母的睪丸活檢樣本；因此，我們建立了 Q-PCR 來(lái)研究變異的影響。Q-PCR 分析表明，AURKC 的 mRNA 水平在患者中顯著下調(diào)（圖 2C）。

突變的計(jì)算機(jī)分析

過(guò)三種在線(xiàn)致病性預(yù)測(cè)工具（Polyphen-2、SIFT、Mutation taster）對(duì) AURKC 基因中 c.269G>A 突變的生物信息學(xué)分析表明，該突變很可能是致病突變。此變體是 ExAC、1000G 和 gnomAD 數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在的新突變。R90 的突變位點(diǎn)從人類(lèi)到斑馬魚(yú)高度保守，表明該位點(diǎn)對(duì) AURKC 蛋白的功能具有重要作用（圖 2D）。

CSI 使用患者的精子

密度梯度離心和仔細(xì)檢查后，選擇了一些適合 ICSI 微量移液器的“外觀正常”的精子。在佳學(xué)基因檢測(cè)合作醫(yī)院為患者嘗試了一個(gè) ICSI 周期。對(duì)于 ICSI 周期，我們收集了 10 個(gè)卵子和 7 個(gè) MII 卵母細(xì)胞；沒(méi)有一個(gè)胚胎發(fā)育到胚泡階段。
 

過(guò)去十年中，五個(gè)突變（c.144delC (p.L49Wfs22)、c.744C>G (p.Y248*)、c686G>A (p.C229Y)、c.930+38G>A（發(fā)生在 3 ′-UTR) 和 c.436-2A>G（導(dǎo)致外顯子 5) 跳躍的剪接位點(diǎn)突變）在AURKC基因中已被報(bào)道與巨精癥有關(guān)。在這項(xiàng)研究中，我們?cè)趤?lái)自近親家庭的患者的AURKC基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的純合突變 (c.269 G>A; p.R90Q) 。對(duì)患者進(jìn)行了一個(gè) ICSI 周期，但沒(méi)有一個(gè)胚胎發(fā)育到囊胚階段。

今為止，大量報(bào)告提供的證據(jù)表明，在先進(jìn)次、第二次或兩次減數(shù)分裂期間染色體分離和/或胞質(zhì)分裂失敗是巨精子癥的主要原因 。Aurora 激酶是進(jìn)化上高度保守的激酶，是減數(shù)分裂過(guò)程中正確的染色體分離和胞質(zhì)分裂所必需的 。AURKC有 7 個(gè)外顯子，編碼人類(lèi) 309 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。AURKC是極光激酶家族的一個(gè)組成部分，主要在睪丸中表達(dá)。在采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)，佳學(xué)基因在AURKC的外顯子 3 中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的錯(cuò)義突變導(dǎo)致氨基酸變化的基因 (p.R90Q)。AURKC 蛋白的序列比對(duì)表明，該突變位點(diǎn)在不同物種中是保守的（圖2C）。

用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)利用三種在線(xiàn)致病性預(yù)測(cè)工具（Polyphen-2、SIFT、Mutation taster）來(lái)預(yù)測(cè)該變異的危害性（表 2）。結(jié)果表明，該變異具有很高的致病概率。

前的研究比較了有和沒(méi)有AURKC突變的患者的常規(guī)精液圖和精細(xì)胞圖的值。結(jié)果表明，大頭精子的比例普遍達(dá)到了更高的值，1% 的正常精子的存在是AURKC突變患者中賊具鑒別力的參數(shù)。與之前的研究一致，采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)中AURKC基因錯(cuò)義變異（c.269G>A）的患者顯示 96% 的大頭精子。然而，正常精子的比例達(dá)到了4%。一種解釋可能是，除了巨精子癥，這里研究的這名患者的精子數(shù)量也很低 (1.71 × 10 6). 操作員和實(shí)驗(yàn)室之間對(duì)正常精子特征的可變?cè)u(píng)分也可能影響結(jié)果，因?yàn)橐恍╊^部或鞭毛具有輕微形態(tài)缺陷的精子可以被認(rèn)為是正常的。

多研究描述了巨精子癥患者的妊娠失敗。此外，進(jìn)一步的研究建議，當(dāng)患者頭部精子增大超過(guò) 30% 時(shí)，應(yīng)進(jìn)行 AURKC 基因的系統(tǒng)遺傳篩查。如果發(fā)現(xiàn)AURKC基因突變，則不應(yīng)嘗試 ICSI 。在這項(xiàng)研究中，患者的妻子在一個(gè) ICSI 周期后未能懷孕，再次證明了AURKC與基因突變和 ICSI 結(jié)果。因此，不推薦對(duì)此類(lèi)患者進(jìn)行 ICSI。

之，采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)在 AURKC 基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的錯(cuò)義突變 (c.269 G>A; p.R90Q)。迄今為止，這是與巨精子癥相關(guān)的 AURKC 基因的第六個(gè)報(bào)告變體。采用全外顯子組測(cè)序?qū)Σ辉胁挥械木蘧影Y進(jìn)行致病基因鑒定基因檢測(cè)擴(kuò)大了 AURKC 突變的范圍，有助于指導(dǎo)從業(yè)者為巨精子癥患者做出賊佳決策。