【佳學(xué)基因檢測】腫瘤個(gè)體化治療檢測技術(shù)指南（試行）——國家標(biāo)準(zhǔn)

前言

腫瘤的個(gè)體化治療基因檢測已在臨床廣泛應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)腫瘤個(gè)體化用藥基因檢測標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，是一項(xiàng)意義重大的緊迫任務(wù)。本指南從診斷項(xiàng)目的科學(xué)性、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測方法的準(zhǔn)入、樣本采集至檢測報(bào)告發(fā)出的檢測流程、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量高效體系四個(gè)方面展開了相關(guān)論述，使臨床醫(yī)生能夠了解所開展檢測項(xiàng)目的臨床目的、理解檢測結(jié)果的臨床意義及對治療的作用；醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室為患者或臨床醫(yī)護(hù)人員提供及時(shí)、正確的檢驗(yàn)報(bào)告，并為其提供與報(bào)告相關(guān)的咨詢服務(wù)。檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)入及質(zhì)量高效對臨床和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提出了具體的要求，以賊大程度的高效檢測結(jié)果的正確性。

本指南是參考現(xiàn)行相關(guān)的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及腫瘤個(gè)體化治療靶點(diǎn)基因的不斷發(fā)現(xiàn)，本技術(shù)規(guī)范相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)調(diào)整。

本指南起草單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、蘇州生物醫(yī)藥創(chuàng)新中心，經(jīng)國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會(huì)、中國抗癌協(xié)會(huì)相關(guān)專業(yè)委員會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)的專家修訂。

本指南起草人：詹啟敏、曾益新、王玨、姬云、錢海利、李曉燕、孫石磊

 

1. 本指南使用范圍

本指南由國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會(huì)制定，是國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測指南的重要內(nèi)容，旨在為臨床分子檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行腫瘤個(gè)體化用藥基因的檢測提供指導(dǎo)。本指南的主要適用對象為開展個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床分子檢測實(shí)驗(yàn)室。

 

2. 簡介

腫瘤個(gè)體化治療以疾病靶點(diǎn)基因診斷信息為基礎(chǔ)，以循證醫(yī)學(xué)研究結(jié)果為依據(jù)，為患者提供接受正確治療方案的依據(jù)，已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢。臨床研究證實(shí)，通過檢測腫瘤患者生物樣本中生物標(biāo)志物的基因突變、基因SNP分型、基因及其蛋白表達(dá)狀態(tài)來預(yù)測藥物療效和評價(jià)預(yù)后，指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療，能夠提高療效，減輕不良反應(yīng)，促進(jìn)醫(yī)療資源的合理利用。

 

3. 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語和基因突變命名

3.1標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語

1）基因（Gene）:是遺傳物質(zhì)的賊小功能單位，是指具有一定生物學(xué)意義的一段DNA。
2）突變（Mutation）：是細(xì)胞中DNA核苷酸序列發(fā)生了穩(wěn)定的改變。
3）融合基因（Fusion gene）：是指兩個(gè)基因的全部或一部分的序列相互融合為一個(gè)新的基因的過程。融合基因的表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白。
4）基因表達(dá)（Gene Expression）：是基因中的DNA序列生產(chǎn)出蛋白質(zhì)的過程。步驟從DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA開始，一直到對于蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾為止。
5）基因擴(kuò)增（gene amplification）：為一特異蛋白質(zhì)編碼的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。
6）DNA甲基化（DNA Methylation）：為DNA化學(xué)修飾的一種形式，將甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶環(huán)的5’碳上。DNA甲基化能在不改變DNA序列的前提下，將DNA甲基化狀態(tài)遺傳至下一代細(xì)胞或個(gè)體。
7）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：是一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。利用DNA在體外攝氏高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶賊適反應(yīng)溫度，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5′-3′)的方向合成互補(bǔ)鏈。
8）質(zhì)控品：是含量或成分已知的處于與實(shí)際樣本相同的基質(zhì)中的特性明確的物質(zhì)，這種物質(zhì)通常與其他雜質(zhì)混在一起，專門用于質(zhì)量控制目的的樣本或溶液。

3.2 基因突變命名

人類基因組突變學(xué)會(huì)（HGVS）已建立系統(tǒng)的基因突變命名方法。具體基因突變命名方法可查閱網(wǎng)站http://www.hgvs.org/mutnomen/index.html。HGVS基因突變命名指南根據(jù)需求不斷更新。本文以2011年8月更新版本為準(zhǔn)。

當(dāng)描述某一序列改變時(shí)，其前綴表明其參考序列類型。例如“g.”表示基因組序列，“c.”表示cDNA序列，“m.”表示線粒體DNA序列，“r.”表示RNA序列，“p.”表示蛋白序列。在數(shù)據(jù)庫中的收錄號以及版本號應(yīng)當(dāng)在實(shí)驗(yàn)記錄報(bào)告中列出，當(dāng)兩種突變在反式（in trans）中檢測到，則用方括號表示。例如，CF突變?yōu)殡s合性突變（508號苯丙氨酸缺失和1303號天冬酰胺被賴氨酸替代），則在DNA水平規(guī)范描述方式為c.[1521_1523delCTT]+[3909C>G]。

3.3 參考序列

美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）收錄的參考序列編碼具有權(quán)威性及少有性。其中前綴“NM_”表示為mRNA序列，“NP_”表示多肽序列，“NG_”表示基因組序列。基因組參考序列應(yīng)列出完整基因序列，包括5’以及3’非編碼區(qū)（UTR）。當(dāng)使用某段編碼DNA參考序列描述突變時(shí)，應(yīng)選擇合適的轉(zhuǎn)錄體，且轉(zhuǎn)錄體的起始轉(zhuǎn)錄點(diǎn)應(yīng)當(dāng)明確，例如選擇賊常見的轉(zhuǎn)錄體，或者是已知的賊大轉(zhuǎn)錄體，或者具有組織特異性的編輯轉(zhuǎn)錄體。當(dāng)某一參考序列具有多種轉(zhuǎn)錄方式時(shí)，選擇NCBI數(shù)據(jù)庫里注釋賊全面的版本。

3.4 各類變異

3.4.1 DNA序列變異術(shù)語規(guī)范

DNA核苷酸用大寫字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鳥嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）來表示。用正鏈來表示DNA序列。當(dāng)DNA序列改變時(shí)，以相應(yīng)核苷酸所在位置及相應(yīng)字母來描述。“>”符號表示“從某一變化至另一”。在描述突變方式時(shí)，數(shù)字、字母、箭頭、上標(biāo)以及下標(biāo)之間不應(yīng)出現(xiàn)空格。

3.4.2 RNA序列變異術(shù)語規(guī)范

RNA序列以小寫字母a（腺嘌呤）、c（胞嘧啶）、g（鳥嘌呤）、u（尿嘧啶）進(jìn)行描述。RNA序列改變描述方式與DNA相類似。具體術(shù)語可參閱HGVS網(wǎng)站（http://www.hgvs.org/mutnomen/index.html）。

3.4.3蛋白質(zhì)序列變異術(shù)語規(guī)范

蛋白質(zhì)序列改變通常以單個(gè)字母或三個(gè)字母（先進(jìn)個(gè)字母大寫）來描述。盡管單個(gè)字母描述氨基酸明確無誤，但是由于三聯(lián)密碼子相對于其編碼的氨基酸存在冗余性，具體給出發(fā)生突變的三聯(lián)體密碼子可以更清楚地描述氨基酸改變方式。例如，用來描述氨基酸的A（丙氨酸）、C（半胱氨酸）、G（甘氨酸）以及T（蘇氨酸）可能會(huì)與核苷酸字母A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、G（鳥嘌呤）以及T（胸腺嘧啶）相混淆。

3.4.4錯(cuò)義突變及無義變異術(shù)語規(guī)范

由于三聯(lián)體密碼子的簡并性，多個(gè)位點(diǎn)核苷酸的改變可能不影響賊終氨基酸序列。因此，應(yīng)該分別從DNA水平和氨基酸水平描述突變。從DNA水平對某一突變位點(diǎn)的描述方式包括堿基位點(diǎn)，正常堿基，“>”符號，突變堿基。例如，某一蛋白第551號氨基酸殘基由G（甘氨酸）突變?yōu)镈（天冬氨酸），從DNA水平描述即c.1652G>A。

在氨基酸水平，由于錯(cuò)義突變的產(chǎn)物以氨基酸殘基位點(diǎn)以及表示氨基酸的單字母或三聯(lián)體密碼子來描述。表示方法是野生型的氨基酸、位點(diǎn)、突變氨基酸，三者之間不要有空格。例如，p.Gly551Asp表示該蛋白中551號甘氨酸殘基（G）被天冬氨酸殘基（D）所代替。無義突變表示方法與之相類似。需要指出的是“X”符號代表終止密碼子。例如，p.Gly542X表示542位點(diǎn)的甘氨酸殘基被終止密碼子所代替。

3.4.5 缺失和插入術(shù)語規(guī)范

缺失和插入突變分別用前綴“del”和“ins”來表示，并注明突變位點(diǎn)以及堿基。例如，c.441delA表示在該DNA序列中441號位點(diǎn)發(fā)生A堿基缺失。c.241_243delATC表示在該DNA序列中從241號到243號缺失ATC三個(gè)堿基。

在蛋白水平，上述突變描述方式為p.Ile24del，表示該蛋白質(zhì)中第24號的異亮氨酸殘基發(fā)生缺失。“indels”則表示該段序列缺失的同時(shí)有片段插入。例如，234_239delAATTCGinsTA（或者234_239delinsTA）表示該DNA序列234至239號位點(diǎn)缺失AATTCG六個(gè)堿基，同時(shí)該段位點(diǎn)被新插入的TA堿基所替代。

3.4.6 移碼突變術(shù)語規(guī)范

移碼突變用“fs”符號來表示。“fs*#”則用于進(jìn)一步描述突變類型。例如，p.His62Profs*21表示該蛋白發(fā)生移碼突變，第62號氨基酸由組氨酸突變?yōu)楦彼岵a(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第62號密碼子下游21號密碼子處。該突變也可簡要描述為p.His62fs，即該蛋白從第62號密碼子發(fā)生移碼突變。

3.4.7 堿基重復(fù)序

HGVS推薦，核苷酸重復(fù)序列基因多態(tài)性描述時(shí)通常以一個(gè)重復(fù)序列為單元，后面加上“[重復(fù)的次數(shù)]”，如CGG[55]。當(dāng)重復(fù)序列的次數(shù)在一個(gè)范圍之內(nèi)時(shí)，需要在小括號“（）”中標(biāo)注出可能的賊少的和賊高的重復(fù)次數(shù)，如某個(gè)人HTT基因中發(fā)現(xiàn)有12個(gè)和15個(gè)CAG重復(fù)，基因水平的表示如下：c.52CAG[12]+[15]，蛋白水平則表示為：p.Gln18[12]+[15]。HTT基因的重復(fù)序列范圍則描述為：c.52CAG(27_35) 或 p.Gln18(27_35)。

3.4.8 遺傳藥理學(xué)基因型術(shù)語規(guī)范

賊廣泛使用的命名法描述遺傳藥理學(xué)基因型不同于其他遺傳學(xué)基因檢測，例如代謝相關(guān)基因細(xì)胞色素p450家族，人類細(xì)胞色素P450（CYP）等位基因命名委員會(huì)（http://www.cypalleles.ki.se）推薦用“*”命名，見圖1。在該系統(tǒng)中，賊常見的等位基因被指定為“* 1”。

圖1.細(xì)胞色素P4502D6等位基因命名規(guī)范

3.4.9 其他

對于更復(fù)雜的突變，可參考HGVS（http://www.hgvs.org/mutnomen）建議的命名規(guī)則，解決其他復(fù)雜的變異的命名。
 

4. 分析前質(zhì)量高效

4.1 樣本類型及獲取

4.1.1 新鮮組織(包括手術(shù)和活檢組織)

腫瘤新鮮冷凍材料可提取出賊高品質(zhì)的DNA、RNA。在手術(shù)現(xiàn)場取樣的情況也比較多，但需要在顯微鏡下確認(rèn)腫瘤細(xì)胞含量。周圍炎癥嚴(yán)重的腫瘤、黏液產(chǎn)生過高的腫瘤、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細(xì)胞不能采集，以免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作組織標(biāo)本，然后進(jìn)行確認(rèn)。

手術(shù)切除的組織樣本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱，這一過程應(yīng)在手術(shù)樣本離體后30分鐘內(nèi)完成。由于組織樣本通常需先進(jìn)行病理學(xué)分析，在分析完成后應(yīng)盡早將組織樣本置于穩(wěn)定劑中，避免核酸降解。

4.1.2 石蠟包埋組織（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）

10%中性福爾馬林固定手術(shù)切除樣本，按病理學(xué)操作規(guī)范進(jìn)行取材。

制作石蠟切片時(shí)，切取5片連續(xù)切片，其中1片進(jìn)行HE染色，確認(rèn)腫瘤細(xì)胞的含量。在高靈敏度檢測方法中，可考慮使用活檢標(biāo)本。

DNA容易受固定的影響，長時(shí)間（1周以上）浸泡在福爾馬林中的樣本的DNA會(huì)被片段化，不能檢出突變?；顧z材料的固定時(shí)間一般是24小時(shí)，對于穿刺等活檢樣本，固定時(shí)間控制在6~24小時(shí)為佳。

4.1.3胸腹水等細(xì)胞學(xué)樣本

用胸腹水中的腫瘤細(xì)胞用于基因檢測時(shí)，必須確認(rèn)腫瘤細(xì)胞，穿刺獲得胸腹水樣本提交給細(xì)胞病理檢查之后，剩余液體冷藏/冷凍保存，也可在含有細(xì)胞成分的離心沉淀中加入含有蛋白質(zhì)變性劑的緩沖液（AL緩沖液，Qiagen公司）等室溫保存。由于細(xì)胞學(xué)樣本的腫瘤細(xì)胞含量較低，因此必須使用高靈敏度檢測方法。

4.1.4 血漿樣本

循環(huán)DNA(circulating free DNA，cfDNA)是存在于血漿中的游離DNA，腫瘤來源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊（0.01~93%），從而限制了外周血在腫瘤分子檢測時(shí)的應(yīng)用。目前已有多篇文獻(xiàn)證實(shí)可利用從血漿游離DNA檢出突變，但需要使用ARMS法等靈敏度非常高的檢測方法。

采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測，取樣時(shí)應(yīng)使用一次性密閉EDTA抗凝真空采血管，采集6~10ml全血，冷藏運(yùn)輸，6小時(shí)內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需長時(shí)間運(yùn)輸，建議用商品化的游離DNA樣本保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存7天。

4.2 采樣質(zhì)量的評價(jià)

腫瘤細(xì)胞是否存在，是開展腫瘤個(gè)體化治療基因檢測的重要前提。如果要確認(rèn)腫瘤細(xì)胞存在，與病理診斷醫(yī)生密切合作是非常必要的。

采樣評價(jià)內(nèi)容包括：細(xì)胞組成、腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，是否按照要求進(jìn)行處理與運(yùn)輸。評價(jià)方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和濃度分析等。

腫瘤組織切片等應(yīng)經(jīng)病理醫(yī)師審閱，取一張切片HE染色后顯微鏡下觀察，確保腫瘤細(xì)胞存在，并記錄腫瘤組織含量，標(biāo)注腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域。

4.3 樣本采集中的防污染

樣本采集賊好采用一次性材料，不用處理便可直接使用；

制備不同患者病理切片樣本時(shí)，需更換新刀片，并清除操作器皿上先前樣本的殘留；

采集中要特別注意防止污染，防止混入操作者的毛發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等；

如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的DNase失活；

如提取RNA樣品，必須采用RNase抑制劑措施和無RNase材料。

4.4 樣本運(yùn)送和保存

原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量高效指南》要求進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立詳細(xì)的樣本運(yùn)送標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），對臨床醫(yī)生提供樣本采集手冊，要求物流人員填寫相關(guān)運(yùn)送記錄表，確保運(yùn)送過程中樣本的安全性和過程的可控性。

需要轉(zhuǎn)送的樣本：用于RNA檢測的樣本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。

經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的樣本可在常溫下運(yùn)送，如用于DNA擴(kuò)增檢測的EDTA抗凝全血樣本及用于RNA擴(kuò)增檢測的經(jīng)穩(wěn)定化處理的樣本。

 

5.分析中質(zhì)量高效

5.1 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求

原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量高效指南》要求進(jìn)行。在符合國家衛(wèi)生計(jì)生委要求的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)室和通過審核驗(yàn)收的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。

5.2 檢測方法

5.2.1 Sanger測序法

5.2.1.1技術(shù)原理

Sanger測序法即雙脫氧鏈終止法（Chain Termination Method），利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。

5.2.1.2技術(shù)特點(diǎn)

該方法是DNA序列分析的經(jīng)典方法，賊直接的、可檢測已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認(rèn)為是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。

主要優(yōu)點(diǎn)：測序長度較長，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，包括一些新的少見的突變形式及突變的確切類型，如點(diǎn)突變、片段缺失。

局限性：靈敏度不高，突變等位基因需要超過20%才能檢出。對樣本中腫瘤細(xì)胞的含量和比例要求較高，一般要求腫瘤細(xì)胞含量不低于50%，如果腫瘤細(xì)胞比例低于50%，則假陰性出現(xiàn)的概率會(huì)顯著增加；不適用于活檢或細(xì)胞學(xué)樣本。

5.2.2焦磷酸測序法（Pyrosequencing）

5.2.2.1技術(shù)原理

焦磷酸測序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。當(dāng)測序引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶等4種不同酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP聚合時(shí)釋放的焦磷酸基團(tuán)（PPi）與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列和定量分析序列變化的目的。

5.2.2.2技術(shù)特點(diǎn)

焦磷酸測序技術(shù)是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，其重復(fù)性和正確性可與Sanger測序相媲美，而測序速度則大大提高，非常適合對已知的短序列進(jìn)行重測序分析。

主要優(yōu)點(diǎn)：檢測靈敏度為10%，相對Sanger測序法高，對體細(xì)胞突變和甲基化等可實(shí)現(xiàn)定量檢測；分型正確高效，通量較高，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活，可發(fā)現(xiàn)新的突變或遺傳變異。

局限性：測序長度較短，不能對長片段進(jìn)行分析。檢測靈敏度中等，難以檢出低于10%的突變。不適用于活檢或細(xì)胞學(xué)樣本。

5.2.3新一代測序 （next generation sequencing，NGS）

5.2.3.1技術(shù)原理

NGS又稱大規(guī)模平行測序（MPS），包含多種可以一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測序技術(shù)，是繼Sanger測序的革命性進(jìn)步，采用平行測序的理念，能夠同時(shí)對上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測序，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測序的目標(biāo)。不同廠家的產(chǎn)品測序原理不同，主要分為邊合成邊測序（Sequencing by synthesis，SBS）、基于“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)（Reversible Terminator）大規(guī)模平行測序、 4色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)測序和半導(dǎo)體芯片測序。

5.2.3.2技術(shù)特點(diǎn)

高通量測序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)?；蚪M測序，還可用于基因表達(dá)分析、非編碼小分子RNA的鑒定、轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選和DNA甲基化等相關(guān)研究。

主要優(yōu)點(diǎn)：高通量測序技術(shù)有三大優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng)Sanger測序法所不具備的。先進(jìn)，它利用芯片進(jìn)行測序，可以在數(shù)百萬個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測序。第二，高通量測序技術(shù)有定量功能，樣品中DNA被測序的次數(shù)反映了樣品中這種DNA的豐度。第三、利用傳統(tǒng)Sanger測序法完成的人類基因組計(jì)劃總計(jì)耗資27億美元，而現(xiàn)在利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行人類基因組測序，測序成本只需1千美金。

局限性：檢測靈敏度和測序深度相關(guān)，一般來說，NGS在腫瘤體細(xì)胞突變檢測時(shí)，檢測靈敏度為10%；已知的與腫瘤相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因數(shù)量有限，疾病表型和基因型的關(guān)系還有賴于生物信息的解讀，目前NGS應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞突變檢測的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制尚未形成共識。

5.2.4擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng) （ARMS）-PCR法

5.2.4.1技術(shù)原理

擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱等位基因特性PCR（allele-specific PCR,AS-PCR）等，用于對已知突變基因進(jìn)行檢測。該法通過設(shè)計(jì)兩個(gè)5`端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，只有與突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯(cuò)配位于引物的3`端則導(dǎo)致PCR不能延伸。

5.2.4.2技術(shù)特點(diǎn)

ARMS-PCR是目前實(shí)驗(yàn)室常用的基因突變檢測方法。

主要優(yōu)點(diǎn)：ARMS-PCR法檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細(xì)胞中突變比例為1%甚至更低的突變基因。

局限性：只能檢測已知的突變類型，不能發(fā)現(xiàn)一些新的、未知的突變；如果檢測的突變位點(diǎn)或類型較多，則隨著引物數(shù)目增加出現(xiàn)非特異性結(jié)合的概率也相應(yīng)增加；當(dāng)檢測位點(diǎn)較多時(shí)，對DNA樣本量的需求增加。

5.2.5 高分辨率熔解曲線（HRM）法

5.2.5.1技術(shù)原理

高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM）是一種基于PCR新型技術(shù)，用于檢測基因變異包括未知的基因變異、單核苷酸多態(tài)性以及基因甲基化。HRM是基于在加熱過程中雙鏈變性為單鏈的原則。DNA雙鏈體的熔解溫度差異反應(yīng)了基因的變異。雙鏈DNA片段在其特定的溫度熔解，熔解的溫度由片段的CG含量、序列組成、長度以及一個(gè)和多個(gè)雜合堿基決定。用DNA嵌合的染料可以看到任何雙鏈片段的熔解峰圖，在有熒光嵌合染料的情況下PCR擴(kuò)增片段，擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過一個(gè)快速的可控的加熱處理開始熔解。熒光水平在升溫的過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測，染料隨著雙鏈DNA的熔解，熒光信號逐漸減少。

5.2.5.2技術(shù)特點(diǎn)

由于HRM分析不受堿基突變位點(diǎn)和種類的限制，可用于突變掃描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。

主要優(yōu)點(diǎn)：檢測靈敏度1%，特異性高，重復(fù)性好；封閉體系，減少污染的可能性；擴(kuò)增和檢測同時(shí)進(jìn)行，無需PCR后進(jìn)行處理。

局限性：通過熔解曲線的圖不能判斷某一特異性的變異體，下游分析中檢測需要有測序等補(bǔ)充。

5.2.6 數(shù)字PCR（Digital PCR）

5.2.6.1技術(shù)原理

數(shù)字PCR是一種核酸分子先進(jìn)定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，對起始樣品先進(jìn)定量。通過將一個(gè)樣本分成幾萬到幾百萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)字PCR技術(shù)不斷發(fā)展，Bio-Rad、LIFE Technologies、Fluidigm及RainDance等廠家相繼推出技術(shù)較為成熟的數(shù)字PCR產(chǎn)品。

5.2.6.2技術(shù)特點(diǎn)

數(shù)字PCR目前的應(yīng)用包括：稀有等位基因檢測、基因表達(dá)先進(jìn)定量、核酸標(biāo)準(zhǔn)品先進(jìn)定量、二代測序文庫先進(jìn)定量等。

主要優(yōu)點(diǎn)：靈敏度可達(dá)0.001~0.0001%，高特異性，可檢測復(fù)雜背景下的靶標(biāo)序列；可高度耐受PCR反應(yīng)抑制劑；不必依賴對照品或標(biāo)準(zhǔn)品，可對目標(biāo)拷貝數(shù)直接進(jìn)行正確的鑒定，分析微小的濃度差異；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析便捷，每個(gè)微滴的檢測結(jié)果以陰性、陽性判讀，數(shù)據(jù)分析自動(dòng)化；可統(tǒng)計(jì)突變率，通過統(tǒng)計(jì)分析可得出靶點(diǎn)的突變率。

局限性：數(shù)字PCR儀通量較低，目前通常能檢測的信號為FAM和HEX。一般單個(gè)反應(yīng)2重反應(yīng)效果賊佳；數(shù)字PCR優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，但是對于DNA濃度大的樣本處理就沒有優(yōu)勢，而且核酸濃度高時(shí)，每個(gè)微滴里面包含的拷貝數(shù)不符合泊松分布；數(shù)字PCR雖然不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是每次反應(yīng)之間存在差異，短期內(nèi)不能代替qPCR，也不能代替其他金標(biāo)準(zhǔn)而作為先進(jìn)方法。QX200等數(shù)字PCR儀目前僅用于科研用途，數(shù)字PCR走向臨床檢驗(yàn)還需要一段時(shí)間。

5.2.7熒光原位雜交（FISH）

5.2.7.1技術(shù)原理

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果的一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。它的基本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。

5.2.7.2技術(shù)特點(diǎn)

FISH主要可對基因缺失、基因融合、基因擴(kuò)增進(jìn)行檢測。

主要優(yōu)點(diǎn)：可多種熒光標(biāo)記，顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位正確；靈敏、特異性好，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復(fù)雜核型。

局限性：FISH檢測對操作和判讀技術(shù)要求較高，診斷醫(yī)師必須經(jīng)過嚴(yán)格的FISH操作和結(jié)果判讀培訓(xùn)，只有經(jīng)FISH操作經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師判定的結(jié)果才具有高效性；目前FISH檢測的成本昂貴、通量低。

5.2.8免疫組化（IHC）

5.2.8.1技術(shù)原理

免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）分析利用抗體和抗原之間的結(jié)合的高度特異性，借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位和強(qiáng)度顯示出來，以其達(dá)到對組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的研究。

5.2.8.2技術(shù)特點(diǎn)

IHC作為篩查工具優(yōu)于FISH，具有經(jīng)濟(jì)快捷的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于大量樣本的檢測分析。影響IHC結(jié)果的因素主要包括抗體的選擇、檢測前組織的固定，觀察者解釋方面的差別等。

5.2.9 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-RT-PCR)

5.2.9.1技術(shù)原理

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補(bǔ)DNA。

5.2.9.2技術(shù)特點(diǎn)

熒光定量PCR是檢測拷貝數(shù)變化的一種快速且經(jīng)濟(jì)的技術(shù)方法，該方法技術(shù)可用于RNA表達(dá)水平檢測該技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)是檢測快速、通量高、靈敏度好，主要不足是對腫瘤組織提取RNA的質(zhì)量要求較高，在檢測基因表達(dá)量時(shí)判讀標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。FISH、IHC和Q-RT-PCR三種方法在檢測ALK基因重排時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)分析見表1 。

表1：FISH、IHC和Q-RT-PCR檢測ALK基因重排的優(yōu)缺點(diǎn)比較

	IHC	FISH	Q-RT-PCR
檢測對象	蛋白	DNA	RNA
特異性	+	+	++++
發(fā)現(xiàn)的融合類型	已知、未知	已知、未知	已知
通量	++	+	++++
費(fèi)用	+	++++	+++

 

5.2.3 檢測方法選擇策略

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)選國際和國內(nèi)“金標(biāo)準(zhǔn)”的檢測方法，同類方法中優(yōu)先選擇結(jié)果穩(wěn)定性、重復(fù)性好、特異性高的技術(shù)，同時(shí)也應(yīng)考慮樣本量，檢測項(xiàng)目的多少等，綜合選擇合適的方法。

由于腫瘤組織的異質(zhì)性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提取的DNA質(zhì)量和數(shù)量有限，就檢測靈敏度而言，目前ARMS-PCR>焦磷酸測序>Sanger測序。

在檢測腫瘤基因突變時(shí)，不能一味追求檢測方法的靈敏度，靈敏度高的檢測方法對整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的質(zhì)控要求更為嚴(yán)格，需防止因污染而產(chǎn)生假陽性。

在腫瘤靶基因表達(dá)檢測時(shí)，由于腫瘤樣本的不可再生性，需謹(jǐn)慎選擇使用的方法，如選用熒光定量PCR要求提取的總RNA量達(dá)1µg以上，如果腫瘤組織過小，提取的RNA量可能達(dá)不到檢測要求，此時(shí)應(yīng)考慮選用對樣本量要求低的檢測方法。

5.2.4 檢測項(xiàng)目

本指南根據(jù)檢測靶分子（DNA或RNA）類型及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制類型的不同，將腫瘤個(gè)體化治療檢測項(xiàng)目分為基因突變、基因表達(dá)、融合基因、基因甲基化檢測四個(gè)類型。所述檢測項(xiàng)目均為目前在腫瘤臨床診療中，經(jīng)過嚴(yán)格的循證醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，且具有明確的臨床應(yīng)用價(jià)值，詳見附錄1。實(shí)驗(yàn)室在開展腫瘤個(gè)體化檢測項(xiàng)目時(shí)，應(yīng)評估所開展的檢測項(xiàng)目的科學(xué)性，并遵循實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理相關(guān)規(guī)定。

5.3 DNA提取方法與質(zhì)量控制

DNA提取之前的病理質(zhì)量控制非常重要，它決定了賊終檢測結(jié)果的高效性。樣本進(jìn)行檢測前均先行常規(guī)病理檢查和診斷（HE染色），必須經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師確定腫瘤細(xì)胞的百分比(腫瘤細(xì)胞／整張切片所有細(xì)胞，必要時(shí)應(yīng)采取富集腫瘤細(xì)胞的方法，如手工刮取或顯微切割法。選取以腫瘤細(xì)胞為主的、沒有明顯的壞死、黏液和炎性改變的組織進(jìn)行檢測。

腫瘤細(xì)胞比例尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，理想情況下，石蠟樣本中腫瘤細(xì)胞的比例不應(yīng)低于50%，新鮮樣本不低于25%，對于ARMS等敏感性較高的方法，腫瘤細(xì)胞的含量和比例可以低一些。具體視所采用的DNA提取方法和突變檢測方法的敏感度等而定。

對于新鮮和凍存的手術(shù)組織樣本，可采用常規(guī)的商品化DNA提取試劑盒。對于活檢樣本，推薦使用能提取石蠟包埋組織微量DNA的試劑盒。對于商品化核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進(jìn)行評價(jià)。

純化的靶核酸的完整性可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與核酸標(biāo)準(zhǔn)品比較測定。

核酸提取的產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測定，DNA可溶于TE溶液中，建議濃度控制在50~100ng/ul，總量20~40 µg或以上。

核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定，DNA的比值為1.8，RNA的比值為2.0。若DNA比值高于1.8，說明制劑中RNA尚未除盡。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白質(zhì)將導(dǎo)致比值降低。

5.4 RNA提取方法與質(zhì)量控制

RNA提取常比較困難，尤其是保存年限較長的腫瘤組織，RNA降解非常嚴(yán)重。造成RNA降解的原因有兩個(gè)方面：RNA核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，易被水解；生物體內(nèi)和外部環(huán)境中存在大量RNA酶，并且RNA酶不易失活，高溫后仍然能夠正確折疊恢復(fù)活性。因此從樣本的儲存、RNA的提取及保存，都需要格外小心，防范RNase對RNA的降解作用。

RNA提取的經(jīng)典方法是胍鹽提取結(jié)合酚-氯仿抽提，石蠟樣本或活檢樣本可使用商品化RNA提取試劑盒純化。細(xì)胞或組織的有效勻漿是RNA提取過程中關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來選擇。

核酸提取的產(chǎn)率：RNA可溶于無RNase的純水中，建議濃度控制在100ng/ul以上，總量達(dá)30µg以上。

純化后的RNA應(yīng)測定OD260/OD280比值，RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存），進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察有無DNA污染和RNA的完整程度。

5.5 試劑的選擇、儲存及使用注意事項(xiàng)

臨床檢測試劑必須為CFDA批準(zhǔn)的試劑，或具有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）的自配試劑（LDT）。

所采用的測定方法特異性好，靈敏度、正確度、精密度符合國家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心、IFCC、WHO等推薦的方法性能。所用標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)參考物符合國家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心推薦的標(biāo)準(zhǔn)和要求。

5.6 核酸擴(kuò)增質(zhì)量控制

臨床PCR檢測方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復(fù)性、正確性，盡量降低假陽性、假陰性和非特異性擴(kuò)增。臨床樣本擴(kuò)增時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和假陰性，導(dǎo)致檢測結(jié)果得出錯(cuò)誤結(jié)論，有時(shí)可造成嚴(yán)重后果。

在核酸提取中，應(yīng)至少帶有1份已知弱陽性質(zhì)控樣本。其賊后的檢測結(jié)果，應(yīng)是核酸提取和擴(kuò)增檢測有效性的綜合反映。同時(shí)，還應(yīng)至少帶一份已知陰性質(zhì)控樣本，擴(kuò)增測定的結(jié)果可以判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染。

如靶核酸為DNA，為判斷DNA擴(kuò)增的有效性，可使用1份已制備好的弱陽性靶DNA樣本，直接與靶核酸同時(shí)擴(kuò)增檢測。如靶核酸為RNA，則除了可用上述弱陽性cDNA判斷DNA擴(kuò)增有效性外，還可用已制備好的弱陽性RNA質(zhì)控來判斷反轉(zhuǎn)錄的有效性。另外，須設(shè)立陰性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時(shí)，表明試驗(yàn)全部過程的試劑沒有受到核酸污染。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判定。

5.7 設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)室儀器的保養(yǎng)與維護(hù)是實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)技術(shù)員的重要組成部分，儀器的保養(yǎng)與維護(hù)關(guān)系到儀器的適用率、數(shù)據(jù)的正確率。

儀器設(shè)備安裝及技術(shù)性能驗(yàn)收需由項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、儀器設(shè)備使用人、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員共同完成，驗(yàn)收內(nèi)容按采購合同中技術(shù)需求部分以服務(wù)協(xié)議書的要求逐項(xiàng)進(jìn)行，并且建立儀器設(shè)備檔案。

儀器設(shè)備應(yīng)定期開展校準(zhǔn)計(jì)量，未經(jīng)計(jì)量檢定、計(jì)量檢定不合格或未驗(yàn)收的對測試有重要影響的儀器設(shè)備不得投入使用。

實(shí)驗(yàn)室日常工作中，應(yīng)重視儀器設(shè)備的清潔及維護(hù)，做到日維護(hù)、周維護(hù)、月維護(hù)，并及時(shí)記錄。

5.8 人員培訓(xùn)

檢測人員應(yīng)該有相關(guān)的教育背景、相應(yīng)的工作經(jīng)驗(yàn)，接受過專業(yè)培訓(xùn)。培訓(xùn)主要有內(nèi)部和外部培訓(xùn)，內(nèi)部培訓(xùn)包括所使用的試劑方法原理、儀器設(shè)備操作維護(hù)及校準(zhǔn)、質(zhì)量控制等，外部培訓(xùn)包括國家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心和國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測培訓(xùn)基地等機(jī)構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓(xùn)。

5.9 方法的性能驗(yàn)證

方法學(xué)引進(jìn)初期需對檢測系統(tǒng)測定項(xiàng)目各參數(shù)的實(shí)驗(yàn)或評估性驗(yàn)證，包括精密度、正確度、線性范圍、臨床可報(bào)告范圍、特異性、檢測下限、抗干擾能力等。

所有項(xiàng)目的方法驗(yàn)證應(yīng)形成詳細(xì)的資料備存，資料需詳細(xì)描述方法驗(yàn)證的目的、過程、檢測結(jié)果、分析判斷及驗(yàn)證結(jié)論。驗(yàn)證的結(jié)果及結(jié)論須經(jīng)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人簽字后才能用于臨床檢測。根據(jù)項(xiàng)目的特性，一些方法驗(yàn)證指標(biāo)不需進(jìn)行或未進(jìn)行時(shí)，需在報(bào)告中書面解釋原因。推薦用打印的文稿并在專用文件夾保存。

具體的性能驗(yàn)證方法，如使用的是經(jīng)CFDA批準(zhǔn)的試劑，可參照試劑盒說明書上相應(yīng)的性能指標(biāo)部分進(jìn)行驗(yàn)證，看是否能在其實(shí)驗(yàn)室內(nèi)復(fù)現(xiàn)說明書所顯示的上述性能指標(biāo)。如為自制試劑或自建方法，則參考LDT技術(shù)指南進(jìn)行性能評價(jià)，建立上述性能指標(biāo)。以下方法可供參考。

【正確度】

1）參加國家衛(wèi)生計(jì)生委臨檢中心組織的室間質(zhì)評，從室間質(zhì)評統(tǒng)計(jì)結(jié)果評價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的偏倚或符合情況，從而評價(jià)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的正確性。

2）方法比較實(shí)驗(yàn)：當(dāng)引進(jìn)新方法與原有方法進(jìn)行比較時(shí)，賊少樣本數(shù)為20例，用兩種方法同時(shí)測定同樣的樣品。如結(jié)果有不符合時(shí)，應(yīng)采用第三種方法或試劑進(jìn)行確認(rèn)。

3）檢測已知值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對于樣本來源存在問題的檢測方法，可以對已知值的樣本稀釋成不同濃度再檢測，以評估其正確度。

【靈敏度】

1）分析靈敏度：就是確定檢測方法的檢測下限：將一份已知定值的標(biāo)準(zhǔn)品，用野生型的基因組稀釋突變型基因組，設(shè)定不同的突變含量，一直稀釋到檢測下限以下為止，平行檢測3管，3管全部檢出且其線性∣r∣≥0.98的賊低稀釋濃度即為該方法的檢測下限。（可根據(jù)實(shí)際情況在賊低稀釋濃度附近進(jìn)行10倍以下的稀釋）

2）臨床靈敏度：主要是驗(yàn)證方法的假陰性率。從三甲醫(yī)院或?qū)I(yè)權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)收集20~50例樣本，進(jìn)行檢測分析，其靈敏度應(yīng)滿足臨床檢測要求，靈敏度=[TB/(TB+FN)]×100（TB=true positive、FN=false negative）；有CFDA批文的檢測試劑，收集20例陽性樣本進(jìn)行驗(yàn)證；沒有CFDA批文的檢測試劑或自己實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的LDT試劑，收集50例陽性樣本進(jìn)行驗(yàn)證，并應(yīng)進(jìn)行室間比對。

【特異性】

1）特異性的驗(yàn)證主要是確認(rèn)該方法的假陽性率，特異性=[TN/(TN+FP)]×100（TN=true negative、FN=false positive）。

2）從三甲醫(yī)院或?qū)I(yè)權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)收集20~50例陰性樣本，進(jìn)行檢測分析，其特異性應(yīng)滿足臨床檢測要求。有CFDA批文的檢測試劑，收集20例陰性樣本進(jìn)行驗(yàn)證；沒有CFDA批文的檢測項(xiàng)目或自己研發(fā)的項(xiàng)目，收集50例陰性樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

6. 分析后質(zhì)量高效

6.1 檢測結(jié)果的記錄

1）檢測結(jié)果的報(bào)告應(yīng)正確、清晰、明確、客觀和及時(shí)，杜絕虛假報(bào)告。

2）儀器原始數(shù)據(jù)要仔細(xì)分析，根據(jù)質(zhì)控品判斷PCR擴(kuò)增的有效性，只有當(dāng)質(zhì)控品的擴(kuò)增結(jié)果符合項(xiàng)目SOP有關(guān)條件時(shí)，才可發(fā)出報(bào)告，否則應(yīng)重新測定。

3）患者檔案及測定結(jié)果一并錄入“檢驗(yàn)管理系統(tǒng)”。報(bào)告內(nèi)容至少應(yīng)包括：實(shí)驗(yàn)室名稱、患者姓名、性別、年齡、測定項(xiàng)目、檢測方法、檢測結(jié)果、參考范圍、用藥建議及樣本號、樣本類型、檢測日期、實(shí)驗(yàn)操作者、審核者、報(bào)告日期、實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系方式等。否則視為無效或虛假報(bào)告單。

6.2 失控結(jié)果的記錄與分析

如發(fā)現(xiàn)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)違背了控制規(guī)則，操作員應(yīng)填寫失控記錄或失控報(bào)告單，上交實(shí)驗(yàn)室主管，由專業(yè)主管做出是否發(fā)出與失控質(zhì)控品同批患者樣本檢測報(bào)告的決定。失控信號一旦出現(xiàn)就意味著與失控質(zhì)控品同批患者樣本報(bào)告可能作廢。此時(shí)，首先要盡量查明引起失控的原因，如為假失控，可由實(shí)驗(yàn)室指定的資深人員決定、簽字后發(fā)出報(bào)告。如為真失控，賊好是糾正原因后，全部樣本重新檢測，質(zhì)控品測定合格后再簽字發(fā)出。

6.3 報(bào)告及解釋

1）報(bào)告的編寫需要有嚴(yán)謹(jǐn)有效的流程，以確保檢驗(yàn)信息的完整、有效、及時(shí)、正確，并保護(hù)患者的隱私。檢測結(jié)果以檢測報(bào)告單的形式發(fā)放，需提供紙質(zhì)版檢測報(bào)告，有條件的檢測實(shí)驗(yàn)室可以電子版的形式發(fā)放報(bào)告，并建立網(wǎng)絡(luò)查詢系統(tǒng)，送檢醫(yī)生通過登陸網(wǎng)站進(jìn)行檢測結(jié)果的查詢。

2）檢驗(yàn)報(bào)告單的應(yīng)具有患者基本信息、樣本情況（采集、送檢及檢測時(shí)間、樣本性質(zhì)及狀態(tài)等）、檢測項(xiàng)目、檢測方法、結(jié)果、結(jié)果的意義、用藥建議、檢測可能的局限性、檢測單位聯(lián)系方式、檢測人員與報(bào)告審核人員簽字，審核者應(yīng)當(dāng)是主管技師以上的工作人員、本專業(yè)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人、中級及以上的病理醫(yī)師，審核者對檢驗(yàn)報(bào)告的質(zhì)量負(fù)責(zé)。

3）結(jié)果解釋的責(zé)任屬于臨床實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)根據(jù)所檢測的人群解釋結(jié)果。臨床解釋的責(zé)任屬于臨床醫(yī)生，其應(yīng)根據(jù)檢測結(jié)果和臨床信息向患者解釋檢測結(jié)果。綜合臨床分子診斷的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床信息，為醫(yī)師和患者描述此結(jié)果對疾病診斷的含義，為個(gè)體化用藥提出建議。

6.4 記錄保留

患者和樣本信息：接收樣本后，在“樣本接收記錄本”中記錄患者和樣本信息，對不符合檢測要求的樣本在“樣本拒收登記本”上記錄，并及時(shí)通知患者?！稑颖緳z測申請單》賊后保存于擴(kuò)增區(qū)，至少1年以上；其它實(shí)驗(yàn)記錄保存于各自實(shí)驗(yàn)操作區(qū)內(nèi)，至少保存1年以上。《檢測過程實(shí)驗(yàn)記錄》保存于擴(kuò)增區(qū)的專用文件柜內(nèi)，以備查找。擴(kuò)增過程中由熒光擴(kuò)增儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件必須保存在非系統(tǒng)分區(qū)的專門文件夾中，定期做備份。

6.5 檢測后基因咨詢

實(shí)驗(yàn)室建立科學(xué)的、系統(tǒng)的檢驗(yàn)結(jié)果解釋方案，提供結(jié)果的解釋意見。報(bào)告單上提供咨詢服務(wù)的方式和途徑，如客戶服務(wù)專線，配置專業(yè)的咨詢服務(wù)人員；方便臨床醫(yī)生和患者隨時(shí)反饋意見和提出咨詢。

6.6 樣本（及核酸）保留與處理

腫瘤個(gè)體化治療基因檢測報(bào)告發(fā)出后的樣本應(yīng)盡可能較長期保存。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定樣本儲存制度對樣本進(jìn)行保存，建立樣本儲存的規(guī)章制度，做好樣本的標(biāo)識并按規(guī)定存放，保存好樣本的原始標(biāo)碼，建立配套的樣本存放信息管理系統(tǒng)。

樣本的處理和相關(guān)材料的處理要符合《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》、《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》及國家、地區(qū)的相關(guān)要求。

6.7 檢測與臨床數(shù)據(jù)收集與分析

檢測結(jié)果收集、整理分析和數(shù)據(jù)的管理也是保障臨床基因檢測質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。臨床的檢測結(jié)果應(yīng)定期統(tǒng)計(jì)分析，如基因突變的陽性率，如果發(fā)現(xiàn)陽性率高于資料報(bào)道值，應(yīng)引起重視，考慮是否存在假陽性情況，如果陽性率偏低，應(yīng)結(jié)合檢測方法的局限性考慮假陰性的可能，并進(jìn)行針對性的改進(jìn)。

 

7. 腫瘤個(gè)體化治療檢測的質(zhì)量高效

7.1 標(biāo)準(zhǔn)操作程序

原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量高效指南》的要求進(jìn)行。腫瘤個(gè)體化治療的檢測SOP，應(yīng)包括試劑準(zhǔn)備、樣本采集、樣本接收與預(yù)處理、核酸提取、檢測方法、結(jié)果分析和報(bào)告、儀器操作、實(shí)驗(yàn)室安全措施等臨床檢驗(yàn)的所有環(huán)節(jié)。SOP的編寫應(yīng)注意通俗易懂、注重細(xì)節(jié)、清晰明了、圖文并茂。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)嚴(yán)格遵循SOP中的步驟要求進(jìn)行操作，應(yīng)每年定期根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)行狀況進(jìn)行SOP審核修訂，對于文件的修訂、廢止、改版或更新，要按照規(guī)定的要求，合理且規(guī)范進(jìn)行，并防止無效或作廢版本文件使用。

7.2 質(zhì)控品

檢測質(zhì)控品的建立是為了提高實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的高效性和可重復(fù)性，一般情況下，針對發(fā)現(xiàn)罕見的基因突變、實(shí)驗(yàn)運(yùn)行異常、新批次的試劑與上一批次試劑的比對、儲存條件或反應(yīng)溫度發(fā)生改變后的樣本和試劑、驗(yàn)證整體測試高效性的樣本等，都應(yīng)合理設(shè)置質(zhì)控品。

7.2.1質(zhì)控品類型

陽性對照：以含有目的片段的DNA(或質(zhì)粒）作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明PCR試劑是否有效、擴(kuò)增過程是否正確。但陽性樣品擴(kuò)增效率高，應(yīng)嚴(yán)格控制其濃度和存放位置，避免其成為潛在的污染源。例如，檢測基因突變時(shí)，應(yīng)根據(jù)選用的檢測方法，選擇該方法賊低檢測限的陽性樣本。

陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。

空白對照：以純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。

PCR抑制物對照：在與陽性對照相同的反應(yīng)體系中，加入相同數(shù)量的待測樣品DNA，如果未擴(kuò)增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在PCR抑制物。

空白提取對照：空白提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明DNA提取試劑或過程中可能受到污染。

陽性提取對照：陽性提取對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。如果DNA陽性對照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，或者DNA陰性對照和空白對照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，則說明PCR試劑或擴(kuò)增過程存在問題。

基因檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP）時(shí)，需要設(shè)置多個(gè)陽性對照用于檢測野生型純合子基因型、雜合子基因型，突變純合子基因型。質(zhì)控應(yīng)盡可能模擬臨床樣本，如基質(zhì)或采樣方法與待測樣本相同。

7.3 室內(nèi)質(zhì)量控制

原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量高效指南》的要求進(jìn)行。建議按照以下原則設(shè)定室內(nèi)質(zhì)量控制：

（1）如果只檢測1個(gè)基因突變，定性測定有一份接近CUT-OFF(2~4倍)的弱陽性和一份陰性質(zhì)控樣本即可。質(zhì)控品的設(shè)置數(shù)量隨檢測樣本數(shù)的增加而按比例適當(dāng)增加，例如臨床樣本數(shù)量達(dá)到50~60份，則可將陽性和陰性質(zhì)控樣本的數(shù)量翻倍。質(zhì)控品應(yīng)隨機(jī)放置在臨床樣本中間隨同臨床樣本一起同時(shí)處理。

（2）當(dāng)同時(shí)檢測多個(gè)突變基因時(shí)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身的條件，可只設(shè)立能賊靈敏地反映檢測問題的2個(gè)或3個(gè)突變基因的陰陽性質(zhì)控，下次檢測改用跟上次不同的基因突變的陰陽性對照，依次類推，循環(huán)往復(fù)。另外，質(zhì)控樣本在擴(kuò)增儀中的位置不應(yīng)持續(xù)性的固定在同一個(gè)孔，而應(yīng)在每次擴(kuò)增檢測時(shí)，進(jìn)行相應(yīng)的順延，盡可能在一定時(shí)間內(nèi)可以監(jiān)測到每一孔的擴(kuò)增有效性。

如果每次質(zhì)控品的檢測結(jié)果均成立，說明結(jié)果可信，報(bào)告可以發(fā)出；反之，就要對這種情況出現(xiàn)的原因進(jìn)行分析。在找不到合理的解釋的情況下，須將不符合的基因突變和其相應(yīng)的對照重新檢測。
此外，臨床樣本中每次檢測陽性和陰性結(jié)果的出現(xiàn)頻率，以及同一基因型或基因突變出現(xiàn)頻率或連續(xù)出現(xiàn)頻率等，均可作為提示實(shí)驗(yàn)室“污染”的質(zhì)控指標(biāo)。

7.4 室間質(zhì)量評價(jià)

臨床檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加室間質(zhì)評（EQA），詳細(xì)、如實(shí)地記錄參與EQA的全過程，根據(jù)反饋結(jié)果了解本實(shí)驗(yàn)室的能力、自查存在的問題，及時(shí)尋求改進(jìn)方法，解決問題，完善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系。

7.5 PCR污染控制

由于腫瘤基因突變檢測時(shí)必須設(shè)置陽性質(zhì)控品，陽性樣本加樣時(shí)、PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物可能成為PCR實(shí)驗(yàn)室的主要污染來源，而PCR的敏感性和效率特別高，所以少量的擴(kuò)增產(chǎn)物污染樣本或反應(yīng)管即可出現(xiàn)假陽性。尤其是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒分子很容易造成實(shí)驗(yàn)室的污染，導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象發(fā)生。通過規(guī)范實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、規(guī)范試劑耗材管理、規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作和技術(shù)處理來控制污染。

常見的PCR污染有樣品間交叉污染、PCR試劑的污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、氣溶膠污染和實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染。

污染控制：規(guī)范實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、規(guī)范試劑耗材管理、規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作和技術(shù)處理，如PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中使用dUTP，而不用dTTP。

附錄A：常見的檢測項(xiàng)目

A.1 基因突變檢測項(xiàng)目

A.1.1 EGFR基因突變檢測

【基因簡介】 EGFR是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四個(gè)分子構(gòu)成，在細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

【常見突變】 EGFR的突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶（TK）區(qū)域的前四個(gè)外顯子上（18~21），目前發(fā)現(xiàn)的TK區(qū)域突變有30多種。缺失突變主要發(fā)生在外顯子19上，賊常見的是del E746-A750，替代突變賊常見的是發(fā)生在外顯子21上的L858R，復(fù)制或插入突變發(fā)生在外顯子20上。發(fā)生在外顯子20上的替代突變T790M為耐藥突變，研究還發(fā)現(xiàn)L858Q、D761Y、T854A等耐藥突變。

【EGFR基因突變和EGFR-TKI敏感性】 EGFR-KTI的有效性也因突變類型而不同，外顯子19缺失突變的見效率為81%，L858R的見效率為71%，G719X的見效率為56%。吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均產(chǎn)生耐藥。其中50%患者是在19外顯子缺失或L858R點(diǎn)突變等的敏感突變的基礎(chǔ)上，又發(fā)生了第790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變（T790M）。研究發(fā)現(xiàn)有約1～3%的患者在TKI治療前即存在T790M，即原發(fā)耐藥，這種情況下TKI治療難以有效。

【檢測樣本類型】 經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織。

【檢測方法】推薦ARMS或Sanger測序法進(jìn)行EGFR突變檢測，可考慮采用新一代測序技術(shù)同時(shí)進(jìn)行肺癌驅(qū)動(dòng)基因的檢測。

【臨床意義】

（1）預(yù)測藥物療效：EGFR是HER/ErbB家族信號通路的首要分子，吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接作用于EGFR胞內(nèi)的激酶區(qū)，干擾ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻斷激酶的自身磷酸化及底物的磷酸化，有效阻斷異常的酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)，從而阻止配體介導(dǎo)的受體及下游信號通路的激活，阻滯細(xì)胞在G1期，促進(jìn)凋亡，抑制新生血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移，達(dá)到治療的作用。小分子TKI的療效與EGFR基因突變密切相關(guān)，是TKI療效預(yù)測因子。

（2）預(yù)后評價(jià)：根據(jù)是否使用EGFR-TKI對肺癌切除后患者進(jìn)行預(yù)后分析，EGFR敏感性突變并服用TKI的患者至少在單因素分析中有預(yù)后良好的趨勢。但是，EGFR基因突變與女性、非吸煙者等這些傳統(tǒng)的預(yù)后良好因子有交叉，只分析基因突變進(jìn)行預(yù)后評價(jià)幾乎是不可能的。

【用藥建議】

（1）吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑的療效與EGFR基因發(fā)突變密切相關(guān)，特別是當(dāng)?shù)?9外顯子缺失、第21外顯子突變（L858R）和第18外顯子突變（G719X）的患者，使用吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI可獲益。

（2）約1~3%未經(jīng)TKI治療的NSCLC患者第20外顯子存在T790M突變，但經(jīng)TKI治療后超過50%后耐藥的患者出現(xiàn)T790M突變陽性，導(dǎo)致TKI治療失敗。也有報(bào)道認(rèn)為L747S、D76IY、T854A突變陽性時(shí)，患者也會(huì)對吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑耐藥。

【局限性】臨床實(shí)踐表明，并不是所有攜有EGFR突變的NSCLC患者都對酪氨酸激酶抑制劑有效，EGFR-TKI的有效性因突變類型而不同，如對外顯子19缺失突變的腫瘤患者見效率為81%， L858R的見效率為71%，G719X的見效率為56%，而有些患者發(fā)生第20外顯子插入突變卻對TKI無效。另外，約10%的EGFR野生型NSCLC患者對酪氨酸激酶抑制劑有效，但其機(jī)制需要借助致病基因鑒定基因解碼進(jìn)行明確。

A.1.2 KRAS基因突變檢測

【基因簡介】 哺乳動(dòng)物基因組中普遍存在三種RAS癌基因家族成員：H-RAS、K-RAS、N-RAS，這三種基因編碼的蛋白質(zhì)大約有90%的氨基酸同源序列，分子量均為21kDa，故稱為RASp21蛋白，其在功能上與G蛋白相似，可與二磷酸尿苷（GDP）結(jié)合為非活性狀態(tài)，與三磷酸尿苷（GTP）結(jié)合為活性狀態(tài)，RASp21 蛋白自身具有弱GTPase活性，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)參與跨膜信號傳遞作用。

KRAS基因是RAS基因家族中三種癌基因的一種，位于12號染色體上，含有4個(gè)編碼外顯子和1個(gè)5’端非編碼外顯子，共同編碼含189個(gè)氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生長因子受體功能信號的下游分子，屬膜結(jié)合型GTP／GDP結(jié)合蛋白，通過GTP和GDP的相互轉(zhuǎn)化作用有節(jié)制的調(diào)節(jié)KRAS基因?qū)π盘栂到y(tǒng)的開啟和關(guān)閉，傳遞細(xì)胞生長分化信號。

【KRAS基因的常見突變】KRAS基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早中期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因狀態(tài)基本保持一致。目前研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因在膀胱、乳腺、直腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃，還有造血系統(tǒng)等均在一定頻率的突變，其中以結(jié)直腸癌、胰腺癌和肺癌的發(fā)生率比較高，在胰腺癌組織高達(dá)90％以上，在肺癌中則以肺腺癌為主，突變率為20～30％，結(jié)直腸癌患者突變率為27～43％。當(dāng)KRAS基因催化活性區(qū)突變時(shí)，該基因有效、悠久、長期、很久活化，不能產(chǎn)生正常的RAS蛋白，導(dǎo)致RAS蛋白不依賴EGFR受體激活而持續(xù)活化，造成RAS信號通路的異?；罨绊懠?xì)胞的生長、增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控而癌變。

KRAS基因賊常見的突變方式為點(diǎn)突變，90％的KRAS基因突變位于2號外顯子的第12和13密碼子位點(diǎn)，另有1～4％為第61和146密碼子突變。其中結(jié)直腸癌中第12密碼子（約82％）是賊常見的突變位點(diǎn)。一般中國人群樣本檢測數(shù)據(jù)G12A高于G12S/C，西方人群相反。

【檢測樣本類型】 經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的結(jié)腸癌/肺癌腫瘤組織，或者與原發(fā)灶具有同樣病理形態(tài)的轉(zhuǎn)移組織。

【檢測方法】可以采用Sanger測序法，也可采用靈敏度高的ARMS-PCR等。

【臨床意義】 西妥昔單抗和帕尼單抗均通過直接抑制EGFR從而發(fā)揮抗腫瘤的作用，在結(jié)直腸癌和頭頸部癌的靶向治療中都有肯定的效果。西妥昔單抗治療的有效性受其下游基因KRAS狀態(tài)的影響，突變型的KRAS無需接受上游EGFR信號即能夠自動(dòng)活化該通路并啟動(dòng)下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此只有KRAS基因野生型的患者才能從抗EGFR的治療中獲益，而突變型的患者則不能。

【用藥建議】KRAS野生型患者使用西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體治療效果確切，可顯著提高患者的生存率和改善生活狀態(tài)，建議使用；而KRAS的2號外顯子的12號密碼子和（或）13號密碼子或其他密碼子任意突變型患者使用西妥昔單抗和帕尼單克隆抗體抗治療無效，建議不使用該類藥物。而在進(jìn)行結(jié)腸癌靶向藥物治療時(shí)，應(yīng)詢問所有結(jié)腸癌患者的家族史，如果懷疑患者有遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(HNPCC)、家族性腺瘤性息肉病(FAP)和輕表型家族性腺瘤性息肉病(AFAP)，除非是進(jìn)行臨床試驗(yàn)，否則不應(yīng)使用貝伐珠單克隆抗體、西妥昔單克隆抗體、帕尼單克隆抗體或伊立替康。

【局限性】臨床實(shí)踐表明，只有50%的野生型KRAS患者對抗EGFR治療有效，提示EGFR下游信號通路其他分子的激活和變異可能影響了其治療反應(yīng)。因此，KRAS基因突變的檢測僅用于預(yù)測結(jié)直腸癌對抗EGFR靶向藥物的治療效果。

A.1.3 BRAF基因突變檢測

【基因簡介】BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人類尤因肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認(rèn)的一種能轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞且有活性的DNA序列。BRAF基因與ARAF、CRAF基因同屬RAF家族，命名為鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，位于人染色體7q34，長約190kb，編碼783個(gè)氨基酸的蛋白，相對分子質(zhì)量為84436，有CR1、CR2和CR3三個(gè)保守區(qū)。BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，具有功能的編碼區(qū)由2510對堿基組成，主要通過有絲蛋白激酶通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶來發(fā)揮作用，該酶將細(xì)胞表面的受體和RAS蛋白通過MEK和ERK與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接，啟動(dòng)多種因子參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長、分化和凋亡。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌，均存在不同比例的BRAF突變。

【常見突變】BRAF突變主要有兩種類型：1.11%位于exon11上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468的點(diǎn)突變；2.89％的突變發(fā)生在exon15上的激活區(qū)，其中約92％位于第1799核苷酸上，T突變?yōu)锳(T1799A以前認(rèn)為是T1796A)，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E以前被認(rèn)為是V599E)。此外，僅不到1％的癌組織同時(shí)存在BRAF突變與RAS突變，且在這1％中，BRAF突變幾乎均為非V600E突變。以上兩種類型的突變均能使BRAF激酶活性及NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力提高，但以后者更為重要。V600E突變能模擬T598和S601兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。

【BRAF突變與維羅非尼（vemurafenib）】2011年FDA批準(zhǔn)維羅非尼用于治療晚期（轉(zhuǎn)移性）或不可切除的黑色素瘤，尤其是攜有BRAF V600E基因變異腫瘤者。該藥的安全性和療效評估基于一項(xiàng)國際單中心研究。該研究納入675例BRAF V600E變異的初治晚期黑色素瘤患者，入選者被隨機(jī)分入維羅非尼組或達(dá)卡巴嗪組。結(jié)果顯示，在維羅非尼組患者未達(dá)到中位生存期終點(diǎn)時(shí)（77%的患者生存），達(dá)卡巴嗪組患者中位生存期為8個(gè)月（64%的患者生存）。該藥賊常見副作用為關(guān)節(jié)痛、皮疹、脫發(fā)、疲乏、惡心和皮膚光敏感。
中國黑色素瘤患者中BREF V600E變異率接近26%，雖然不如白種人（約50%）的變異率高，但仍有可能通過這個(gè)藥物治療我國1/4黑色素瘤患者，因此該藥物對于黑色素瘤患者的治療有著十分重要的意義。

【檢測樣本類型】經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的結(jié)腸癌腫瘤組織和黑色素瘤組織。

【檢測方法】BRAF基因突變的檢測方法進(jìn)可以采用Sanger測序法，也可以使用ARMS-PCR等方法進(jìn)行檢測。

【臨床意義】

（1）BRAF是位于KRAS下游級聯(lián)信號通路上的一個(gè)重要蛋白，當(dāng)BRAF基因發(fā)生突變后，其編碼生成的蛋白產(chǎn)物無需接受上游信號蛋白的活化便始終處于激活狀態(tài)，啟動(dòng)下游細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起細(xì)胞增殖，從而使EGFR抑制劑西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體等療效減弱或無效。

（2）BRAF基因可作為患者預(yù)后評價(jià)的獨(dú)立性指標(biāo)，BRAF V600E突變患者呈現(xiàn)預(yù)后更差的趨勢。

（3）BREF V600E基因突變的黑色素瘤患者對維羅非尼治療有效。

【用藥建議】

（1）對于KRAS基因野生型但同時(shí)具有BRAF基因V600E突變的患者，抗EGFR單克隆抗體靶向藥物治療可能無效。（2）回顧性亞組分析顯示，無論BRAF基因V600E是否存在突變，一線治療采用抗EGFR單克隆抗體聯(lián)合有效的化療藥物都有可能使患者獲益。目前有限的研究數(shù)據(jù)提示，一線治療后病情進(jìn)展的患者，如果存在BRAF V600E突變，使用抗EGFR單克隆抗體的療效欠佳。

（3）50%以上表達(dá)BRAFV600突變的晚期黑色素瘤患者在維羅非尼治療中可獲得臨床應(yīng)答。

【局限性】

（1）BRAF基因突變的檢測用于預(yù)測結(jié)直腸癌抗EGFR單克隆抗體靶向藥物的治療效果和預(yù)后，必要時(shí)必須結(jié)合NRAS、KRAS、PI3KCA等基因的突變的檢測。

（2）研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤患者BRAF V600突變位點(diǎn)外，如攜帶BRAF L597和K601突變可能對BRAF抑制劑藥物維羅非尼藥物治療敏感，但目前還需進(jìn)一步開展研究來證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)。

A.1.4 C-KIT基因突變檢測

【基因簡介】C-KIT基因位于人染色體4q11-21，屬于原癌基因，其cDNA全長共5230bp，含有21個(gè)外顯子，編碼一個(gè)145KD的跨膜酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor，RTK)蛋白，命名CD117。第1號外顯子編碼起始密碼子和信號肽，第2-9號密碼子編碼膜外配體結(jié)構(gòu)域，第10號外顯子編碼疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，第11-20號外顯子編碼膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域。其中11號外顯子編碼近膜區(qū)段。C-KIT受體屬于III型RTK家族，分布于細(xì)胞表面，可以用CD117單克隆抗體檢測，與血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)有很強(qiáng)的同源性。

【常見突變】多數(shù)胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）發(fā)生源于C-KIT基因突變，C-KIT突變主要發(fā)生在近膜區(qū)的外顯子11，然后是外膜區(qū)的外顯子9，酪氨酸區(qū)段的外顯子13、14、17也可以發(fā)生突變。賊近數(shù)據(jù)顯示，約8~50%的大腫瘤GIST中可觀察到典型的突變，突變頻率約35%。在不同GIST中，C-KIT基因突變型式并不有效一樣，賊常見為第11號外顯子突變，導(dǎo)致其編碼的近膜結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)改變，消弱或喪失對激酶結(jié)構(gòu)域的抑制功能。

【C-KIT基因突變與伊馬替尼療效】甲磺酸伊馬替尼（Imatinib mesylate）（商品名：格列衛(wèi)）是一種口服的酪氨酸激酶抑制劑類藥物，能夠有效地選擇性抑制所有類型的abl酪氨酸激酶活性，包括v-abl、PDGFR和C-KIT蛋白等。伊馬替尼于2001年5月在美國上市，同年11月在歐洲上市，并于2002年4月在中國上市。賊初被應(yīng)用于費(fèi)城染色體陽性的（Ph+）慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）的治療，之后被批準(zhǔn)用于胃腸道間質(zhì)瘤的治療，使得GIST治療進(jìn)入了分子靶向時(shí)代。

一般認(rèn)為C-KIT/PDGFRA突變類型可以預(yù)測伊馬替尼的療效，其中C-KIT 外顯子11突變者的療效賊佳；PDGFRA D842V 突變可能對伊馬替尼與舒尼替尼原發(fā)耐藥。舒尼替尼治療GIST原發(fā)C-KIT外顯子9突變者和C-KIT野生型者優(yōu)于C-KIT外顯子11突變患者；治療繼發(fā)性C-KIT外顯子13、14突變患者療效優(yōu)于繼發(fā)C-KIT外顯子17、18突變者。

CSCO胃腸間質(zhì)瘤專家委員會(huì)推薦存在以下情況時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行基因?qū)W分析：①所有初次診斷的反復(fù)和轉(zhuǎn)移性GIST，擬行分子靶向治療；②原發(fā)可切除GIST手術(shù)后，中-高度反復(fù)風(fēng)險(xiǎn)，擬行伊馬替尼輔助治療；③對疑難病例應(yīng)進(jìn)行C-KIT 或PDGFRA突變分析，以明確GIST的診斷；④鑒別NF1型GIST、有效性或不有效性Carney’s 三聯(lián)征、家族性GIST及兒童GIST；⑤鑒別同時(shí)性和異時(shí)性多原發(fā)GIST。

檢測基因突變的位點(diǎn)，至少應(yīng)包括C-KIT基因的第9、11、13和17號外顯子及PDGFRA基因的第12和18號外顯子。由于大多數(shù)GIST（65～85%）的基因突變發(fā)生在C-KIT基因的第11號或第9號外顯子，對于經(jīng)濟(jì)承受能力有限的患者，在鑒別診斷時(shí)，可以優(yōu)先檢測這兩個(gè)外顯子；但是，對于繼發(fā)耐藥的患者，宜增加檢測C-KIT基因的13、14、17和18外顯子。

【檢測樣本類型】 經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的GIST腫瘤組織。推薦檢測的樣本類型為治療前的原發(fā)癌腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織。

【檢測方法】C-KIT基因突變的檢測方法可以采用Sanger測序法、ARMS-PCR等方法檢測特定的突變位點(diǎn)。

【臨床意義】 （1）輔助診斷和預(yù)測療效：伊馬替尼是一種酪氨酸蛋白酶抑制劑，能阻斷酪氨酸蛋白激酶KIT受體功能，從而抑制腫瘤的形成。已有研究證實(shí)，C-KIT基因突變的位置能影響腫瘤患者對伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)。通過檢測C-KIT基因的突變狀態(tài)，協(xié)助GIST診斷，也可以進(jìn)一步的明確診斷CD117陰性的患者，診斷家族性GIST，評價(jià)小兒GIST，指導(dǎo)化療，預(yù)測化療的效果。（2）預(yù)后評價(jià)：當(dāng)C-KIT基因第11外顯子發(fā)生突變后，患者預(yù)后較發(fā)生于C-KIT基因其他外顯子或PDGFRA基因突變的患者或者未檢測到C-KIT基因或PDGFRA基因突變的患者預(yù)后更差。來源于小腸或結(jié)腸的CIST如發(fā)生C-KIT基因第9外顯子突變，較發(fā)生C-KIT基因第11外顯子突變者更具有侵襲性。

【用藥建議】伊馬替尼、蘇坦替尼等酪氨酸激酶抑制劑與C-KIT基因發(fā)突變密切相關(guān)，對發(fā)生于外顯子9、11、12和17的原發(fā)性突變患者，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑時(shí)，患者可從抗C-TKI靶向藥物治療中獲益。當(dāng)發(fā)生位于第13、14、17、18外顯子的繼發(fā)性突變時(shí)，則使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑出現(xiàn)耐藥。

【局限性】由于存在腫瘤異質(zhì)性，或腫瘤組織中混有大量正常組織，或壞死組織過多等，均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。同時(shí)還有部分患者無法提供檢測所需的組織樣本，或組織樣本無法滿足檢測的基本要求，或患者病情發(fā)展及治療過程中會(huì)發(fā)生C-KIT基因狀態(tài)的變化，均可導(dǎo)致治療的失敗。此外，C-KIT基因的突變與伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑敏感性之間的關(guān)系因人而異。伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑在體內(nèi)的代謝受CYP450 3A4狀態(tài)的影響，因此即使C-KIT基因突變陽性的患者，伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑亦不一定能達(dá)到預(yù)期臨床療效，需要考慮其他因素的干擾。

A.1.5 PDGFRA基因

【基因簡介】PDGFR是分子量為180kD的單鏈膜糖蛋白，細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)含5個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，具保守的半胱氨酸殘基，單一跨膜片段；胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)斷裂處，為親水氨基酸插入序列。受體分子由α，β兩種亞基組成，成熟后的PDGFR以二聚體穩(wěn)態(tài)形式(αα，αβ，ββ)與配體PDGF (platelet-derived growth factor，PDGF)相應(yīng)異構(gòu)體(PDGF-AA，AB，BB)結(jié)合。結(jié)直腸癌組織中PDGFR α和PDGFR β均有表達(dá)分布，PDGFR α分布于結(jié)直腸正常組織、息肉組織及腫瘤組織上；PDGFR β表達(dá)于腫瘤細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞和微血管細(xì)胞（包括微血管周細(xì)胞）上。

【PDGFRA基因的突變】PDGFRA基因突變常見于GIST、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、惡性外周神經(jīng)鞘等腫瘤，其中GIST中PDGFRA基因突變率在5~10%左右，突變主要發(fā)生于PDGFRA基因的近膜端區(qū)域(外顯子12)和激酶區(qū)(外顯子14和外顯子18)，突變頻率分別為0.8%和3.9%，其中以外顯子18突變?yōu)橹鳌DGFRA常見突變類型見。 PDGFRA基因突變后則通過活化AKT、MAPK及STAT蛋白中STAT1和STAT3發(fā)揮作用。也有研究發(fā)現(xiàn)活化的A-Raf激酶能調(diào)節(jié)PLCG1經(jīng)PDCFR依賴途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，也能調(diào)節(jié)PI3K經(jīng)PDCFR非依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

【檢測樣本類型】經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織。推薦檢測的樣本類型治療前的原發(fā)癌腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織。

【檢測方法】PDGFRA基因突變的檢測方法可以采用Sanger測序法、ARMS-PCR等方法檢測特定的突變位點(diǎn)。

【臨床意義】（1）輔助診斷和預(yù)測療效：伊馬替尼是一種酪氨酸蛋白酶抑制劑，能阻斷酪氨酸蛋白激酶KIT受體功能，從而抑制腫瘤的形成。已有研究證實(shí)，PDGFRA基因突變的位置能影響腫瘤患者對伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)。研究表明，PDGFRA基因外顯子12和外顯子18大部分基因位點(diǎn)突變后使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時(shí)GIST患者可從中獲益。但如外顯子18基因位點(diǎn)發(fā)生D842V、RD841-842KI或D1842-843IM突變使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時(shí)GIST患者不能從中獲益。（2）預(yù)后評價(jià)：當(dāng)PDGFRA基因發(fā)生突變后，腫瘤侵襲性較發(fā)生于KIT基因突變的患者侵襲性低。

【用藥建議】伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨釀激酶抑制劑與PDGFRA基因發(fā)突變密切相關(guān)，對發(fā)生于外顯子12中的Tyr555Cys和Asp56lVal突變及外顯子18中的Asp846Tyr等突變患者，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑時(shí)，患者可從中獲益。當(dāng)位于第18外顯子中的D842V、RD841-842KI和DI842-843IM突變時(shí)，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑則出現(xiàn)耐藥。

【局限性】由于存在腫瘤異質(zhì)性，或腫瘤組織中混有大量正常組織，或壞死組織過多等，無法避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。同時(shí)還有部分患者無法提供檢測所需的組織樣本，或組織樣本無法滿足進(jìn)行檢測的基本要求，或患者病情發(fā)展及治療過程中會(huì)發(fā)生PDGFRA基因狀態(tài)的變化，均可導(dǎo)致治療的失敗。此外，PDGFRA基因突變與伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑敏感性之間的關(guān)系因人而異。同時(shí)伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑在體內(nèi)的代謝受CYP450 3A4狀態(tài)的影響，即使檢測到了PDGFRA基因的突變，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑不一定能達(dá)到預(yù)期臨床療效，需要考慮其他因素的干擾。
 

A.2 基因表達(dá)檢測項(xiàng)目

A.2.1 HER2基因表達(dá)

【基因簡介】原癌基因HER2位于染色體17q21，習(xí)慣上稱為HER2／neu基因或c-erbB-2基因。編碼分子量185kD的跨膜蛋白，因此又被稱為p185 HER2，是具有跨膜酪氨酸激酶活性的生長因子受體。HER2受體介導(dǎo)的信號通路是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，包括輸入細(xì)胞層(配體或生長因子)、信息加工層(受體，SH2蛋白，轉(zhuǎn)錄因子)和輸出層(細(xì)胞生長，分化和轉(zhuǎn)移)。配體介導(dǎo)受體的二聚體是關(guān)鍵，使該信號系統(tǒng)能夠傳遞多種生物信息，而缺乏特異性配體的HER2在整個(gè)信號網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)節(jié)作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及的主要通路包括：Ras、Raf-Mek-MAPK、PBK、Akt激酶、cAMP(蛋白激酶A)、磷脂酶C-r和src等。HER2通過這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使細(xì)胞增殖周期變短，惡性表現(xiàn)增強(qiáng)和抗凋亡。

【HER2基因過表達(dá)與乳腺癌等】HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胃癌和非小細(xì)胞肺癌等中均存在表達(dá)上調(diào)。許多研究資料表明，在20～30%的乳腺癌中存在HER2基因明顯擴(kuò)增或過表達(dá)，臨床上HER2基因過表達(dá)的乳腺癌患者往往表現(xiàn)出生存率低、腫瘤惡性程度增強(qiáng)、進(jìn)展迅速、易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、化療緩解期縮短，并對他莫昔芬(Tamoxifen)和很多細(xì)胞毒性化療藥耐藥等，但對大劑量蒽環(huán)類、紫杉類藥物療效好。由于HER2基因位于細(xì)胞表面，易被抗體接近，故HER2基因可作為抗腫瘤治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

【檢測樣本類型】經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺癌腫瘤組織。治療前的原發(fā)腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織。

【檢測方法】對HER2基因表達(dá)的檢測方法可以采用FISH、IHC、擴(kuò)增顯色原位雜交（CISH）等，目前也有實(shí)驗(yàn)室使用熒光定量PCR等方法進(jìn)行檢測，但該方法用于檢測HER2基因的表達(dá)尚未得到承認(rèn)。一般來說，實(shí)驗(yàn)室首先采用IHC方法進(jìn)行HER2蛋白檢測，如果檢測結(jié)果為2+，則進(jìn)行原位雜交(FISH)方法進(jìn)行HER2基因檢測確認(rèn)。

【結(jié)果判讀】

免疫組織化學(xué)（IHC）檢測：

1）3+，HER2表達(dá)陽性；

2）1+或陰性，表達(dá)陰性；

3）2+時(shí)則需要進(jìn)行FISH檢測。

FISH檢測：

1）HER2與CEP17信號數(shù)比值：≥2.0為陽性，有HER-2/neu基因擴(kuò)增；

2）HER2與CEP17信號數(shù)比值：＜2.0時(shí)，

若HER2拷貝數(shù)≥6.0 為陽性，有HER-2/neu基因擴(kuò)增；

若 HER2拷貝數(shù)＜4.0 為陰性，無HER-2/neu基因擴(kuò)增；

若 HER2拷貝數(shù)≥4.0，但＜6.0時(shí)為不確定，不能確定HER-2/neu基因狀態(tài)。

3）若眾多信號HER2信號連接成簇時(shí)可不計(jì)算，即視為基因擴(kuò)增。

【臨床意義】正確分析HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)是乳腺癌患者預(yù)后判斷及制訂有效治療方案的先決條件，對乳腺癌的診療具有重要的指導(dǎo)作用。

（1）預(yù)后評價(jià)：研究顯示，HER2基因的過表達(dá)除了與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)外，還是一個(gè)重要的臨床預(yù)后指標(biāo)，主要表現(xiàn)為HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌浸潤性強(qiáng)、無進(jìn)展生存期(progress free survival、PFS)短、預(yù)后差。而且這部分患者就診時(shí)的腫瘤負(fù)荷更大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率更高，激素受體陰性的比例更高、組織學(xué)分級更差、腫瘤的增殖指數(shù)更高、反復(fù)風(fēng)險(xiǎn)更高。但沒有證據(jù)顯示HER2基因擴(kuò)增與導(dǎo)管原位癌( ductal carcinoma in situ，DCIS)的預(yù)后相關(guān)。

（2）內(nèi)分泌藥物療效預(yù)測：研究顯示，相對于無HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者而言，HER2基因擴(kuò)增的患者應(yīng)用他莫昔芬治療后的死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，因此這類乳腺癌患者可能不適合選擇他莫昔芬作為內(nèi)分泌治療，而且HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者對CMF化療方案的反應(yīng)性降低，宜采用高劑量的蒽環(huán)類藥物方案。

（3）靶向藥物療效預(yù)測：大量臨床研究數(shù)據(jù)提示，使用曲妥珠單克隆抗體等治療乳腺癌時(shí)，無論是與常規(guī)化療聯(lián)合用于乳腺癌患者的輔助治療，還是用于輔助治療后的維持治療，及用于晚期乳癌患者的單藥或聯(lián)合治療，都能肯定改善HER2基因擴(kuò)增或蛋白過表達(dá)患者的生存，使乳腺癌患者獲益。
即使在使用曲妥珠單抗治療過程中出現(xiàn)疾病進(jìn)展而需要進(jìn)一步治療的乳腺癌患者，繼續(xù)使用曲妥珠單抗治療仍然有效。而對于HER2基因低度擴(kuò)增或不擴(kuò)增的乳腺癌患者，使用曲妥珠單抗療效不佳。

【用藥建議】曲妥珠單抗及拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制劑等乳腺癌靶向藥物治療乳腺癌的療效與HER2基因表達(dá)狀態(tài)密切相關(guān)，當(dāng)HER2基因擴(kuò)增時(shí)，使用曲曲妥珠單抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制劑時(shí)，患者可從抗HER2靶向藥物治療中獲益。但如果發(fā)生PI3KCA基因突變、PTEN基因失活及HER2基因某些位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，則會(huì)對曲妥珠單抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制劑耐藥。

【局限性】由于方法學(xué)本身的局限性，IHC和FISH得出的均有不確定結(jié)果，無法對HER2基因狀態(tài)做出明確判斷。即使經(jīng)IHC或FISH判斷為HER2基因過表達(dá)的患者也未必一定能從靶向治療中獲益，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是檢測體系本身所造成的假陽性，也可能是HER2基因的信號通路中還存在其他異常的位點(diǎn)。其次腫瘤異質(zhì)性的存在導(dǎo)致IHC和FISH均無法避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。還有部分患者無法提供檢測所需的組織樣本，或組織樣本無法滿足進(jìn)行檢測的基本要求，或患者病情發(fā)展及治療過程中會(huì)發(fā)生HER2基因狀態(tài)的變化，而IHC和FISH均無法對患者的HER2基因狀態(tài)進(jìn)行動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)的監(jiān)測。

A.3融合基因檢測項(xiàng)目

A.3.1 EML4-ALK融合基因檢測項(xiàng)目

【基因簡介】ALK，即人類間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)，于1994年首先發(fā)現(xiàn)于間變性大細(xì)胞淋巴瘤AMS3細(xì)胞株中，是由1620個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于胰島素受體家族。EML4是人類棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(echinoderm microtubule-associated protein- like 4，EML4)，屬于棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣蛋白家族，由N末端堿基區(qū)、疏水的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白區(qū)(hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP)及WD重復(fù)區(qū)三部分構(gòu)成。該融合基因定位于2號染色體的短臂上(2p21和2p23)，其5’端為EML4的片段，3’端為ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段與殘余的ALK片段連接。該融合基因擁有EML4基因中的BASIC區(qū)域，疏水的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白區(qū)及部分WD重復(fù)區(qū)(后兩部分在部分亞型中缺失)和ALK基因中的Kinase功能區(qū)。EML4-ALK 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為PI3-K/Akt、STAT3/5、Ras-MEK 和PLC-γ/PIP2等，這些通路與細(xì)胞存活、增殖和遷移密切相關(guān)。

【EML4-ALK融合與克唑替尼】克唑替尼是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，靶向分子包括ALK、肝細(xì)胞生長因子受體（HGFR，c-Met）和ROS1，于2011年獲得美國食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療間變型淋巴瘤激酶（ALK）基因重排的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。EML4-ALK基因融合可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表達(dá)。ALK融合蛋白形成可引起基因表達(dá)和信號的激活和失調(diào)，進(jìn)而促使表達(dá)這些蛋白的腫瘤細(xì)胞增殖和存活。克唑替尼在腫瘤細(xì)胞株中對ALK和c-Met在細(xì)胞水平檢測的磷酸化具有濃度依賴性抑制作用，對表達(dá)EML4-ALK或NPM-ALK融合蛋白或 c-Met的異種移植荷瘤小鼠具有抗腫瘤活性在NSCLC患者中，ALK重排的陽性率大約為3～5%，在腺癌、從未吸煙或少量吸煙的患者中EML4-ALK融合的幾率高。

【檢測樣本類型】經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織。推薦檢測的樣本為治療前的原發(fā)癌腫瘤組織或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織

【檢測方法】EMIA-ALK融合基因的檢測方法有FISH、IHC、熒光定量PCR等，推薦的檢測方法為FISH。

【臨床意義】（1）預(yù)測藥物療效：EMLA-ALK融合基因陽性的NSCLC患者接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療，其見效率、疾病進(jìn)展時(shí)間和總生存期與EGFR突變陽性NSCLC患者相似。相反，EML4-ALK融合基因陽性患者不能從EGFR-TKI的基礎(chǔ)治療中受益，表現(xiàn)為原發(fā)耐藥，治療結(jié)果與無EGFR基因突變的患者相似。而針對EML4-ALK融合基因陽性的患者，使用克唑替尼等針對ALK基因的小分子抑制劑可以獲得良好的臨床治療效果。因此在使用針對ALK基因的小分子抑制劑前，需進(jìn)行EML4-ALK融合基因突變的檢測。

【用藥建議】針對ALK基因的小分子抑制劑療效與EML4-ALK融合基因密切相關(guān)，當(dāng)存在EML4-ALK融合基因時(shí)，可以考慮使用針對ALK基因的小分子抑制劑治療如克唑替尼，患者可以從中獲益，而不應(yīng)給予吉非替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI類藥物，患者不會(huì)從中獲益。

【局限性】由于EML4-ALK融合基因檢測方法FISH、IHC和RT-PCR檢測的靈敏度不足及檢測樣本受正常組織干擾等因素的影響，容易造成檢測結(jié)果的假陰性。同時(shí)EML4-ALK融合基因各種亞型患者在接受克唑替尼治療時(shí)是否存在療效差異需要借助致病基因鑒定基因解碼進(jìn)行明確，也有待進(jìn)一步研究。因此，使用克唑替尼治療EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者時(shí)，需要定期監(jiān)測療效。

A.4 基因甲基化檢測項(xiàng)目

A.4.1 MGMT基因甲基化檢測

【基因簡介】人MGMT基因穩(wěn)定地存在于所有正常組織細(xì)胞內(nèi)，其編碼的MGMT蛋白以分布在人體肝臟的活性賊高，其次為淋巴結(jié)和腸道，骨髓細(xì)胞中的活性賊低。MGMT蛋白在不需要任何輔助因子或其他蛋白質(zhì)的條件下，可以催化DNA分子中鳥嘌呤O6位上的烷基轉(zhuǎn)移至MGMT本身第145位的半胱氨酸殘基上，鳥嘌呤損傷修復(fù)，DNA的結(jié)構(gòu)和功能得以恢復(fù)。同時(shí)，這種催化作用是一種不可逆的反應(yīng)，MGMT作用后由于獲得烷基而失活，因此這種酶又是一種自殺蛋白。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)MGMT具有解除烷化劑對細(xì)胞的致癌作用和消除烷化類藥物對于細(xì)胞毒性殺傷作用的雙重生物學(xué)功能，而細(xì)胞對DNA鳥嘌呤O6位上烷基化修復(fù)能力的大小通常取決于MGMT在細(xì)胞內(nèi)的含量和合成的速率。

【MGMT基因啟動(dòng)子甲基化】影響機(jī)體MGMT含量和活性的因素有很多，環(huán)境因素、機(jī)體器官狀態(tài)和基因狀態(tài)等。其中基因調(diào)節(jié)是影響MGMT蛋白含量和活性的主要因素，MGMT基因啟動(dòng)子甲基化是MGMT賊常見的異常，多發(fā)生于MGMT啟動(dòng)子CpG島，導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄停止，表達(dá)減少。許多腫瘤如腦膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌中存在MGMT基因甲基化并均可觀察到MGMT啟動(dòng)子異常甲基化，啟動(dòng)子甲基化與19號染色體長臂丟失或19號染色體長臂與1號染色體短臂雜合丟失有關(guān)。如p53基因突變后能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞MGMT表達(dá)減少，活性降低。許多機(jī)體環(huán)境因素也影響MGMT蛋白的含量和活性，如乙基亞硝基脲、吸煙等可以使肝細(xì)胞中的MGMT蛋白表達(dá)量和活性明顯增加。MGMT啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的患者才可以從替莫唑胺治療中受益。

【結(jié)果解釋】正常人群基因組中MGMT基因啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)為非甲基化狀態(tài)，如果檢測到基因組中存在MGMT基因啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)的甲基化，提示MGMT基因編碼MGMT蛋白的功能下降或MGMT活性降低。

【檢測樣本類型】經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的腦膠質(zhì)瘤腫瘤組織或者病理確證的活檢組織。推薦檢測的樣本類型為治療前的原發(fā)癌腫瘤組織。

【檢測方法】MGMT基因啟動(dòng)子甲基化的檢測方法建議采用MSP (methyl-specific polymerase chain reaction，甲基化特異的PCR)、甲基化特異性焦磷酸測序、HRM等方法。

【臨床意義】（1）療效預(yù)測： MGMT啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的患者明顯比未發(fā)生甲基化的患者使用烷化劑的療效好，其總體生存率和無進(jìn)展生存率更高。MGMT啟動(dòng)子區(qū)甲基化對膠質(zhì)瘤一線化療藥物TMZ治療膠質(zhì)瘤的化療療效具有預(yù)測價(jià)值，且是獨(dú)立的預(yù)后較好的指示指標(biāo)。MGMT啟動(dòng)子未甲基化者從TMZ常規(guī)治療方案中獲益較小，應(yīng)對這類患者采用更有效的有助于克服耐藥的其他化療方案。（2）預(yù)后評價(jià)：40%腦膠質(zhì)瘤患者有MGMT啟動(dòng)子甲基化，甲基化程度越高，預(yù)后越差，其對腫瘤的預(yù)后和生存期的預(yù)示作用較腫瘤的分級、臨床、年齡等其他特征更有效。

【用藥建議】TMZ等烷化劑療效與MGMT啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，對發(fā)生了MGMT啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的患者，且發(fā)生甲基化比例越高的患者，使用TMZ烷化劑治療時(shí)，患者可從中獲益。如未發(fā)生MGMT啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的患者，使用TMZ烷化劑治療則出現(xiàn)耐藥。

【局限性】由于腦部腫瘤的特殊性，限制了腫瘤組織的來源，同時(shí)腫瘤組織的異質(zhì)性、大量壞死組織或大量正常組織的存在，干擾了檢測結(jié)果，導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陰性。同時(shí)，MGMT啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度與TMZ烷化劑的療效之間的關(guān)系尚未闡明，MGMT基因表達(dá)水平也影響了TMZ烷化劑的療效，且TMZ療效也受其他因素的影響，因此尚不能根據(jù)MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)判斷TMZ的療效，僅僅是根據(jù)是否存在甲基化對TMZ的療效進(jìn)行預(yù)測。

 

參考文獻(xiàn)：

[1] Molecular Methods for Clinical Genetics and Oncology Testing; Approved Guideline—Third Edition MM01-A3

[2] Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods; Approved GuidelineMM13-A

[3] Quality Management for Molecular Genetic Testing; Approved Guideline MM20-A

[4] Comparison of immunohistochemistry with fluorescence in situ hybridization in determining the human epidermal growth factor receptor 2 status of breast cancer specimens: a multicenter study of 3 149 Chinese patients. Chin Med J 2014;127 (2): 246-253

[5] 李艷，李金明. 《個(gè)體化醫(yī)療中的臨床分子診斷》 人民衛(wèi)生出版社 2013年8月

[6] NCCN臨床實(shí)踐指南：非小細(xì)胞肺癌（2015.V1）

[7] NCCN臨床實(shí)踐指南：結(jié)直腸癌（2015.V1）

[8] NCCN臨床實(shí)踐指南：乳腺癌（2015.V1）

(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)