【佳學基因檢測】AhR 和癌癥：從基因檢測分析到靶向治療

腫瘤基因檢測與靶向用藥導讀

芳烴受體 (AhR) 是一種配體激活的轉錄因子，已被證明是維持身體重要功能所需的廣譜生物活動的重要調(diào)節(jié)劑。AhR 在腫瘤發(fā)生中也起關鍵作用。它在癌癥中的作用是復雜的，包括促腫瘤和抗腫瘤活性。它的表達和活性水平對每個腫瘤和患者都是特定的，增加了理解芳烴受體配體的激活或抑制作用的難度。婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組使用基因組數(shù)據(jù)集探索了芳烴受體在腫瘤細胞系和患者中的作用，并討論了芳烴受體在多大程度上可以被視為治療靶點。

關鍵詞： AhR轉錄因子，表達，癌癥，靶向治療

1.簡介

芳烴受體 (AhR) 是一種配體激活的轉錄因子，具有多種關鍵的細胞功能 。它屬于基本的 helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim (bHLH/PAS) 家族，廣泛分布于組織和物種間 。脊椎動物分支中受體的進化導致其能夠與多種結構不同的配體結合。事實上，AhR 與內(nèi)源性（FICZ、犬尿氨酸等）和外源性（TCDD、BaP 等）低分子量平面配體結合，可表現(xiàn)出組織特異性激動劑或拮抗劑活性。在沒有配體的情況下，AhR 構成細胞溶質(zhì)多蛋白復合物的一部分，由 c-Src 激酶、Hsp90 以及伴侶蛋白 p23 和 XAP2組成。配體與芳烴受體的結合誘導構象變化，導致蛋白質(zhì)復合物的解離和芳烴受體的核轉位。在細胞核中，AhR 與其伴侶蛋白芳烴受體核轉運蛋白 (ARNT) 二聚化，并與靶基因調(diào)控區(qū)域中的外源性反應元件 (XRE) 結合，誘導其轉錄 。

自 90 年代初以來，AhR 已被定義為一種重要的環(huán)境傳感器，它能夠以細胞類型和特定環(huán)境的方式響應廣譜的配體激活或抑制細胞通路 。賊近，它在癌癥發(fā)展中的作用已得到證實，其中它可以作為致癌作用的正調(diào)節(jié)劑或負調(diào)節(jié)劑。

在這里，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組根據(jù)之前的研究和對一組遺傳和基因組數(shù)據(jù)庫的分析，總結了芳烴受體在癌癥機制中的作用。然后，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組討論將芳烴受體視為治療靶點所需的條件。

2. 結果

2.1. 癌癥中的芳烴受體突變、表達水平和激活

只有一種體細胞點突變在膀胱癌中具有高頻率。這種位于 PAS-B 結構域（配體結合結構域）下游的突變（Q383H）尚未在功能上進行表征（圖1A，底部）。盡管癌癥中沒有反復性遺傳異常，但相對于健康組織，幾乎 70% 的各種腫瘤類型中的AhR mRNA 水平升高(圖1B)。事實上，AhR mRNA 在乳腺癌 、肺癌 、甲狀腺癌  和口腔鱗狀細胞癌 (OSCC)  中過度表達。在胰腺癌 、子宮內(nèi)膜癌  和腦膜瘤  中也報告了高水平的芳烴受體蛋白。AhR的中位表達似乎從 I 期開始升高，與腫瘤類型無關，這表明這種增加的表達是許多癌癥的早期事件(圖1C）。因此，AhR表達與膠質(zhì)瘤預后不良有關 。相反，原發(fā)性外周血慢性髓性白血病 (CML) 細胞中的AhR表達明顯低于健康對照組，這支持了芳烴受體細胞特異性功能的概念 。

圖1:芳烴受體 (AhR) 轉錄因子在癌癥中的狀態(tài)。( A ) 在來自癌癥基因組學的 cBioPortal ( http://www.cbioportal ) 的患者或癌細胞系的所有遺傳和基因組數(shù)據(jù)中分析了芳烴受體轉錄因子的改變頻率（頂部）和突變狀態(tài)（底部） 。組織）。AhR基因改變包括突變、擴增和深度缺失。( B )使用 GEPIA 2 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia2.cancer-pku.cn )分析來自 TCGA 的所有癌癥與正常組織中的AhR表達。( C ) AhR分析根據(jù) 1B 中描述的腫瘤分期表達。

除了AhR mRNA和蛋白質(zhì)的過表達外，已發(fā)現(xiàn)受體的活性在各種類型的癌癥中顯著升高。例如，已在乳頭狀甲狀腺癌 (PTC) 、原發(fā)性乳腺癌  和皮膚鱗狀細胞癌 中觀察到芳烴受體的表達和活性均升高。此外，AhR 的核定位與高級別間變性腦膜瘤  或卵巢癌 患者的預后較差有關。在這種情況下，Kolluri 等人。廣泛描述了各種芳烴受體配體在癌細胞表型控制和腫瘤發(fā)展中的作用 ?？傮w而言，很難在芳烴受體配體與其在控制增殖、遷移和腫瘤細胞侵襲中的作用之間建立明確的關系。事實上，腫瘤進展的后果似乎有效不同，這取決于腫瘤類型、配體的功能（AhR 激動劑或拮抗劑）以及細胞和蛋白質(zhì)環(huán)境。卞等人。表明ITE（2-（1'H-吲哚-3'-羰基）-噻唑-4-羧酸甲酯）是一種內(nèi)源性AhR配體，可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和遷移。金等人。表明奧美拉唑和 2,3,7,8-四氯二苯并二惡英 (TCDD) 均能抑制乳腺癌細胞的侵襲，但只有奧美拉唑能抑制 Panc1 胰腺癌細胞的侵襲 。與此相反，一些研究表明，內(nèi)源性或外源性配體激活芳烴受體會導致乳腺癌 [ 28、29 ]和暴露于犬尿氨酸 和苯并 (a)的肺癌細胞系中腫瘤細胞遷移和侵襲性增加芘 (BaP) 。雖然很難描述芳烴受體表達對致癌作用的影響，但不同配體的激活和各種輔因子的作用對于確定芳烴受體如何影響腫瘤發(fā)展和表型非常重要。AhR 配體在控制其活性方面的作用很難解釋，因為單一配體 (TCDD) 的激活會引起基因表達的物種特異性變化。事實上，盡管物種之間的芳烴受體保守性相對較高（人類、小鼠和大鼠之間高達 73%），但其功能在小鼠中存在顯著差異，對其配體 (TCDD) 具有更高的親和力 。總體而言，必須以組織和物種特異性的方式研究芳烴受體配體在致癌作用中的作用。

在識別其同源 XRE 結合基序后，AhR 參與了許多基因的轉錄控制 。該基序在整個基因組中具有高度代表性，并且在物種之間是保守的 。楊等。使用 ChIP-seq 分析在 TCDD 誘導之前和之后對人類乳腺癌細胞中的芳烴受體結合位點進行全基因組定位和分析，并確定了多達 4000 個芳烴受體結合區(qū)域 。除了芳烴受體直接靶基因外，預計共調(diào)節(jié)的芳烴受體基因也參與芳烴受體反應。在這種情況下，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組分析了表達與AhR顯著相關的基因，無論是正相關還是負相關。圖 2A。大量基因的表達與腫瘤類型的AhR mRNA 水平顯著相關（ p < 0.001），特別是肺和腦中的腫瘤類型(圖 2A。正如預期的那樣，它們因癌癥類型而異。重要的是，在患者腫瘤樣本 (TCGA) 中也觀察到在細胞系 (GDSC 數(shù)據(jù)庫) 中鑒定的AhR相關特征(圖 2B)。

圖 2:鑒定各種癌癥中的芳烴受體相關基因特征。( A ) 火山圖顯示GDSC 數(shù)據(jù)庫（藥物敏感性基因組學）中各種癌細胞系（肺、腦-CNS（中樞神經(jīng)系統(tǒng)）、乳房、皮膚）中表達與AhR mRNA 水平（A ）顯著相關的基因在癌癥中）（https://discover.nci.nih.gov/cellminercdb）。( B )芳烴受體mRNA 水平與先前確定的基因之間的表達 ( Spearman )相關性與肺癌細胞系 ( A) 在來自 TCGA 的兩個數(shù)據(jù)集中，肺鱗狀細胞癌 (LUSC) 腫瘤患者 ( n = 486) 與正常組織 ( n = 50) ( http://gepia2.cancer-pku.cn )。

2.2.芳烴受體的矛盾作用：致癌基因還是腫瘤抑制因子？

如前所述（圖1A)，癌癥中沒有反復性的芳烴受體改變。然而，它在致癌過程中的作用已被明確確定，許多研究描述了它在幾種癌癥中的促腫瘤或抗腫瘤功能 [ 10 , 26 , 39 ]。這表明，AhR 表達水平和特定配體對其活性的調(diào)節(jié)可能會驅動腫瘤發(fā)生或抑制腫瘤發(fā)展。迄今為止，尚不清楚位于腫瘤微環(huán)境中的AhR配體是否可以將AhR活性調(diào)節(jié)到影響腫瘤發(fā)展的程度。幾年前，AhR 的促腫瘤和抗腫瘤作用得到了廣泛的評價 [ 10 , 26 , 39]，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組將只關注賊新數(shù)據(jù)，以解決在這種復雜性背景下的芳烴受體活動。

2.2.1。AhR 作為癌基因

AhR 通過直接調(diào)節(jié)癌細胞的侵襲特性發(fā)揮促腫瘤因子的作用。已顯示AhR的轉錄抑制可誘導腫瘤抑制基因E-鈣粘蛋白( CDH1 ) 的表達，從而降低乳腺癌細胞系的間充質(zhì)特性。相應地，AhR表達被證明與侵入性轉錄組特征相關，并且芳烴受體抑制降低了斑馬魚中乳腺癌細胞的轉移潛力 。

奧皮茨等人。確定犬尿氨酸 (Kyn) 是一種色氨酸分解代謝物，可以結合并激活芳烴受體。犬尿氨酸被證明是一種內(nèi)源性癌代謝物，可誘導結腸  和肺癌細胞  中生長控制基因的表達。在甲狀腺腫瘤樣本中，AhR 靶基因CYP1A1和CYP1B1相對于相關的健康組織被上調(diào) ，Kyn 刺激甲狀腺癌細胞系再次促進了 EMT 程序的獲得（減少 E-鈣粘蛋白，增加 SLUG，ñ-鈣粘蛋白和纖連蛋白水平）。這導致增加的細胞運動和細胞侵襲。已知三種酶可催化色氨酸分解為 Kyn，即色氨酸-2,3-雙加氧酶 (TDO)、吲哚胺-2,3-雙加氧酶-1 (IDO1) 和吲哚胺-2,3-雙加氧酶-2 (IDO2) . IDO1比IDO2更廣泛地表達并且具有顯著更高的酶活性率，而TDO具有與IDO不同的分布。在膠質(zhì)瘤中，IDO1/TDO 被證明通過水通道蛋白 4 (AQP4)  的表達來解釋 Kyn 釋放和隨后的芳烴受體激活介導的細胞運動。

除了依賴于 Kyn 的途徑外，皮膚色氨酸光產(chǎn)物 FICZ (6-formyllindolo [3,2-b]carbazole) 對芳烴受體的激活可促進 TNFα 依賴性炎癥并誘導黑色素瘤細胞分化和轉移的發(fā)展。BaP 對芳烴受體的激活也被證明通過調(diào)節(jié)非小細胞肺癌 (NSCLC) 中的長鏈非編碼 RNA 來影響 EMT 。同樣，AhR 可以通過調(diào)節(jié) TGF-β 信號傳導重新激活乳腺癌中因 DNA 甲基化而沉默的 LINE-1 逆轉錄轉座子，從而促進腫瘤發(fā)生和疾病進展 。

除了上述 IDO/TDO-Kyn-AhR 通路在癌癥發(fā)展中的作用外，許多研究表明，AhR 的犬尿氨酸激活可誘導免疫抑制作用，產(chǎn)生免疫耐受樹突狀細胞 (DC) 和調(diào)節(jié)性 T細胞。在 DC 中誘導IDO表達也需要芳烴受體?？偟膩碚f，這促進了腫瘤微環(huán)境的獲得，該微環(huán)境在識別和治好癌細胞方面存在缺陷。

總體而言，這一非詳盡的研究集合表明，AhR 激活促進了各種癌癥的腫瘤進展，并且犬尿氨酸激活的芳烴受體的免疫抑制特性構成了癌癥治療的一個非常有希望的軸 。

2.2.2. AhR 作為腫瘤抑制劑

盡管其作為癌基因的作用，AhR 在與腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、消化系統(tǒng)、皮膚（黑色素瘤）和生殖道相關的許多癌癥中充當腫瘤抑制因子。使用消除了芳烴受體表達的工程化小鼠模型（AhR -/-小鼠）發(fā)現(xiàn)了這種抑制作用。在該模型中，肝臟腫瘤的形成和生長顯著高于對照小鼠，AhR -/-肝細胞顯示出顯著更高數(shù)量的 4N 細胞、增殖標志物的表達增加以及腫瘤抑制基因的抑制。因此，該模型中的AhR沉默與癌癥進展有關 。

在結腸癌的背景下也獲得了類似的結果。通過使用腸道特異性AhR -/-小鼠模型，Garcia-Villatoro 等人。證明在腸上皮細胞中表達AhR是減少癌前結腸癌病變形成所必需的。此外，高脂肪飲食加上腸上皮細胞中芳烴受體的丟失影響了結直腸癌的發(fā)展 。Shiizaki 等人。表明AhR激活誘導β-連環(huán)蛋白泛素化和隨后的蛋白體降解。因此，由于異常的 β-連環(huán)蛋白積累，AhR -/-小鼠自發(fā)地發(fā)展出盲腸腫瘤 。同樣，用 TCDD (0.1–100 nM) 治療可減少人結腸直腸癌細胞的集落形成和增殖 。

據(jù)報道，犬尿氨酸激活芳烴受體可抑制腫瘤細胞的生長，促進細胞分化，并通過激活腫瘤抑制基因KISS1  減少小鼠肝和肺轉移瘤的形成。

AhR 也被提出在黑色素瘤中具有腫瘤抑制功能，因為它的敲低促進了小鼠原發(fā)性黑色素瘤的腫瘤發(fā)生和肺轉移。在這種情況下，AhR 可能會拮抗 Aldh1a1 的促腫瘤作用。因此，AhR低/Aldh1a1高表型可能表明黑色素瘤的預后不佳 。

薩里奇等人。通過控制 TGFβ/SMAD3 信號軸抑制增殖和促進癌癥增殖細胞 (CPC)（能夠腫瘤再生和治療后反復的細胞庫）的分化，將芳烴受體鑒定為 SHH 髓母細胞瘤小鼠模型中的有效腫瘤抑制因子。

在膠質(zhì)母細胞瘤中，AhR 的抑制與 CXCL12-CXCR4-MMP9 信號通路的激活有關，參與細胞生長、侵襲遷移和細胞增殖 。在兒童神經(jīng)母細胞瘤中，AhR 起著保護作用，因為它的表達與更好的結果相關。垂體腺瘤 (PA) 細胞中芳烴受體的過度表達揭示了潛在的腫瘤抑制活性，與 BaP 的外源性配體激活無關 。

賊后，AhR 已被證明可以通過調(diào)節(jié)乳腺癌 、前列腺癌  和子宮內(nèi)膜惡性腫瘤  中的幾種腫瘤抑制 miRNA (microRNA) 來預防腫瘤發(fā)展。

總體而言，這些研究強調(diào)了芳烴受體作為腫瘤抑制因子的作用。然而，應該注意的是，這種腫瘤抑制功能主要在小鼠中描述，強調(diào)了物種間芳烴受體功能的特異性。

2.3. 在腫瘤疾病中靶向芳烴受體的治療機會

如上所述，AhR 在癌癥發(fā)展中的作用是復雜的（癌基因或腫瘤抑制基因）。盡管如此，它構成了一個有前途的藥物靶點。靶向芳烴受體必須是患者和腫瘤特異性的，并且依賴于芳烴受體的表達和激活。需要解決三個主要問題以有效調(diào)節(jié)芳烴受體活性以治療腫瘤疾病。他們是：

(a) 鑒定芳烴受體配體的激動劑或拮抗劑功能。此類配體可以在膳食分子（類黃酮）或 FDA 批準的藥物中找到。

(b) 防止致癌芳烴受體激活劑的產(chǎn)生（內(nèi)源性）或攝入（外源性）。

(c) 使用拮抗劑防止致癌配體和芳烴受體之間的相互作用。

也可以考慮替代的芳烴受體靶向策略，例如將芳烴受體作為補充目標以提高癌癥治療的效率或抵消耐藥機制的手段。

2.3.1。AhR 作為直接藥物靶點

在將芳烴受體作為癌癥一線治療的背景下，已經(jīng)研究了許多策略。當腫瘤具有致癌功能時，已經(jīng)測試了各種拮抗劑以降低腫瘤中的AhR表達水平。相反，其他研究旨在通過在轉錄因子作為腫瘤抑制因子時使用激動劑來促進芳烴受體的激活。

2.3.2. 通過芳烴受體激活限制腫瘤進展

使用有效的芳烴受體激動劑可以增強芳烴受體的活性，但相關的毒性可能是一個重要的缺點。事實上，TCDD 是一種劇毒的芳烴受體激動劑，盡管它通過破壞 CXCR4/CXCL12 通路  或卵巢癌細胞 對乳腺癌有積極作用，但它不能用于臨床特異性靶向芳烴受體。因此，大多數(shù)研究調(diào)查了內(nèi)源性或外源性分子抑制腫瘤進展的能力。

在賊有希望的分子中，ITE 是一種內(nèi)源性芳烴受體激動劑，通過下調(diào) JAG1-NOTCH1 信號傳導來降低三陰性乳腺癌 (TNBC) 的侵襲性 。ITE 在體外抑制子宮內(nèi)膜癌 (EC) 細胞的增殖和遷移以及 EC 異種移植物在小鼠體內(nèi)的生長 。它還抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移。FICZ 還被證明對 LNCaP 細胞具有抗增殖和抗遷移特性，LNCaP 細胞是一種源自雄激素敏感的人前列腺腺癌細胞的細胞系 。賊后，F(xiàn)ICZ 顯著降低了慢性粒細胞白血病 (CML) 中 CD34 陽性細胞的克隆形成潛力。

外源性芳烴受體激活劑 5F 203 (2-(4-amino-3-methylphenyl)-5-fluorobenzothiazole) 已在幾種癌癥中顯示出積極作用。5F 203 誘導TNBC中推定的腫瘤抑制基因細胞紅蛋白 ( CYGB ) 的表達 。它可減少胃癌 、人腎癌細胞  和卵巢癌細胞  的體外和體內(nèi)細胞增殖。1998 年批準用于治療類風濕性關節(jié)炎的抗炎藥來氟米特已被證明是一種芳烴受體激動劑 。這種分子在癌癥治療中顯示出前景，尤其是黑色素瘤 、膀胱癌 ] 和口腔鱗狀細胞癌 。Indirubins E804 (indirubin-3'-(2,3 dihydroxypropyl)-oximether) 和 7BIO (7-Bromoindirubin-3'-oxime) 是天然靛玉紅的合成衍生物，可激活芳烴受體并抑制重要的促炎細胞因子的合成，例如如 IL-6 和癌基因 STAT3。因此，它們可以構成有希望的膠質(zhì)母細胞瘤新療法 。

2.3.3。通過抑制芳烴受體限制腫瘤進展

當芳烴受體具有致癌活性或過表達時，賊明顯的策略是使用拮抗劑。已經(jīng)使用化合物 3',4'-二甲氧基黃酮 (3',4'-DMF) 對乳腺癌細胞實現(xiàn)了芳烴受體的藥理抑制，從而阻斷了核芳烴受體復合物的形成 。相比之下，特異性拮抗劑 CH-223191 通過控制 TGFβ 通路來降低膠質(zhì)瘤細胞的克隆形成存活率和侵襲性 。自從發(fā)現(xiàn)芳烴受體抑制的益處以來，許多研究旨在開發(fā)新的芳烴受體拮抗劑，例如使用原始體內(nèi)（斑馬魚）模型  和計算機篩選 。在已鑒定的化合物中，CB7993113  和 GNF351  顯示出有希望的抗癌活性。然而，在進入臨床試驗之前，它們佳學基因檢測正在進行進一步評估。

天然物質(zhì)，如膳食類黃酮、多酚，主要存在于水果、蔬菜和其他植物來源中 [ 84、85 ] ，它們通過控制AhR活性在抑制腫瘤發(fā)展中的有益作用已被大量研究[ 86、87、88 ]。類黃酮可誘導細胞凋亡和細胞周期停滯、代謝酶（特別是細胞色素 P450）的抑制、活性氧 (ROS) 的形成以及血管生成的促進 。已經(jīng)對結腸直腸 、乳腺  和前列腺  進行了幾項使用類黃酮治療癌癥的 II 期臨床試驗] 癌癥和黑色素瘤 。然而，由于固有的限制，它們的臨床應用受到限制，包括它們的分離/純化和藥代動力學挑戰(zhàn)（例如，生物利用度、藥物-藥物相互作用和代謝不穩(wěn)定性）。

尿石素 (UroA) 是天然多酚鞣花酸的腸道微生物群衍生代謝物，已被證明可拮抗芳烴受體 并誘導人類結腸癌細胞  和前列腺癌  衰老。賊后，用于治療癌癥以外目的的各種藥物顯示出AhR拮抗劑活性。因此，這些 FDA 批準的分子可以重新用于癌癥治療。例如，抗麻風藥物氯法齊明已顯示出對多發(fā)性骨髓瘤患者的臨床益處 。

可以通過靶向 HSP90/p23/XAP2/AhR 胞質(zhì)復合物來破壞芳烴受體活性。HSP90 抑制劑（XL888 或 ganetespib）誘導其客戶蛋白（包括 AhR）的降解。增加劑量的 HSP90 抑制劑與 BRAF 抑制劑 (vemurafenib) 聯(lián)合使用可提高 BRAF V600E 突變黑色素瘤患者的總體存活率 。由于 HSP90 抑制劑顯示出非常廣譜的作用 ，因此可以通過靶向輔助伴侶蛋白 p23 來優(yōu)化芳烴受體的降解。p23 蛋白的下調(diào)會觸發(fā)芳烴受體 的泛素化，并且 p23（苦艾酮）的特異性抑制在體外顯示出重要的抗癌作用 。

賊后，IDO 抑制劑在癌癥治療中的可能用途受到了廣泛關注 。盡管此類治療不直接針對 AhR，但它們可能會減少犬尿氨酸的產(chǎn)生，從而降低對免疫檢查點抑制劑的抵抗力 。

迄今為止，僅啟動了兩項 1 期臨床試驗來測試癌癥中芳烴受體的直接調(diào)節(jié)。先進項是由拜耳 (Leverkusen, Germany) 進行的非隨機臨床試驗，旨在評估芳烴受體抑制劑BAY2416964對 114 名晚期實體瘤患者（肺癌、頭部和頸癌和結直腸癌）（NCT04069026）。Ikena Oncology ®（前身為 Kyn Therapeutics ®）（波士頓，馬薩諸塞州 02210，美國）也于 2019 年 12 月開始了 1 期非隨機、開放標簽、臨床試驗，以確定 KYN-175（一種芳烴受體抑制劑）的耐受性和毒性， 53例晚期實體瘤患者（NCT04200963）。這兩項臨床試驗的首批結果預計將在 2022 年底取得。這些試驗強調(diào)了將芳烴受體視為下一代癌癥治療的重要性。同樣值得考慮將芳烴受體作為一種補充療法，與目前使用的療法（即靶向療法和免疫療法）相結合。

2.3.4。改進芳烴受體靶向治療的芳烴受體相關基因特征

由于AhR在癌癥中的作用很復雜，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組建議通過考慮AhR表達水平（高/低）來定制AhR治療策略（（圖1B) 及其特定于腫瘤類型的相關基因特征 (圖 2A) 和患者 (圖 3A。例如，AhR 高特征與不良預后相關，而芳烴受體低相關特征與肺鱗狀細胞癌 (LUSC) 的良好預后相關(圖 3A，B)。正如預期的那樣，肺特異性芳烴受體相關特征在其他腫瘤患者的生存方面沒有區(qū)別，例如皮膚皮膚黑色素瘤 (SKCM)(圖 3C），或可轉座到所有腫瘤（圖 3D)。因此，可以根據(jù)芳烴受體特異性相關基因特征和患者結果選擇拮抗或激活 AhR。

圖 3:LUSC中的AhR相關基因特征。( A ) 表達熱圖顯示鱗狀細胞肺癌患者中幾個芳烴受體相關基因的表達 ( n = 486)。在整個群組中具有相似表達譜的基因和簇在網(wǎng)格中彼此靠近放置。( B - D ) LUSC 癌癥患者 ( B )、皮膚黑色素瘤 (SKCM) 患者 ( C ) 和來自 TCGA ( D ) 的所有癌癥患者的無病生存曲線，取決于與先前確定的基因相對應的芳烴受體特征作為肺癌細胞系中賊正和負相關（n = 48）。

2.3.5。AhR 作為選擇賊有效靶向治療的預后標志物

另一種可能的策略是考慮將AhR表達水平及其活性（相關基因的表達）作為新推定癌癥療法的替代標記。

婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組通過建立來自GDSC數(shù)據(jù)庫（癌癥藥物敏感性基因組學，圖 4A。婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組觀察到藥物效率 (IC50) 和AhR mRNA 水平之間存在顯著相關性 ( p < 0.001)。這種相關性對每種腫瘤都是特定的，在肺癌細胞系中相關性賊高（圖 4A。這種相關性分析使得在已經(jīng)可用的分子中識別出那些根據(jù)AhR水平適應腫瘤類型的分子成為可能。例如，靶向凋亡抑制劑 Bcl-2  的 ABT-263 (Navitoclax) 在弱表達AhR的肺癌細胞系中更有效（左圖圖 4A。MEK 抑制劑曲美替尼對強烈表達AhR的肺癌細胞更有效（右圖）圖 4A。重要的是，與芳烴受體調(diào)節(jié)因子 ( AhRR )的表達沒有相關性(圖 4B）。

圖 4:用于識別各種癌細胞系中治療策略的芳烴受體特征。( A ) 火山圖顯示來自 GDSC 數(shù)據(jù)庫（癌癥藥物敏感性基因組學， https://discover.nci）的各種癌細胞系（肺、腦-CNS、乳腺、皮膚）中藥物效率 (IC50) 的相關性。 nih.gov/cellminercdb）具有標準化水平的AhR mRNA（RNAseq 數(shù)據(jù)）。當AhR水平低時賊有效的藥物顯示在左側，而當AhR水平高時賊有效的藥物顯示在右側。（乙) 火山圖顯示來自 GDSC 數(shù)據(jù)庫（癌癥藥物敏感性基因組學， https://discover.nci.nih）的各種癌細胞系（肺、腦-CNS、乳腺、皮膚）中藥物效率 (IC50) 的相關性。 gov/cellminercdb ) 與芳烴受體調(diào)節(jié)因子 ( AhRR) mRNA 的水平。（C，D）表達熱圖顯示肺癌細胞系（C）和皮膚黑色素瘤細胞系（D）中與AhR賊相關（正或負）的基因的表達，就選擇的治療而言效率與AhR水平相關表達。在整個群組中具有相似表達譜的基因和簇在網(wǎng)格中彼此靠近放置。

除了AhR表達水平之外，還可以考慮芳烴受體相關特征來評估治療的潛在有效性。事實上，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組發(fā)現(xiàn)這些基因特征與之前在圖 4A 在肺癌細胞系 (LUSC) (圖 4C）。用黑色素瘤細胞系獲得了可比的結果（圖 4D)。婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組進行了額外的體外研究，以驗證與芳烴受體水平密切相關的抑制劑的有效性（圖 4）。因此，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組在存在或不存在芳烴受體轉錄因子（CRISPR-Cas9 沉默）的情況下，在黑色素瘤系 SKMel28 上測試了 ABT-263、SB505124、阿法替尼和 CHIR-99021_1241（圖 5A）。簡而言之，SKMel28 和 SKMel28芳烴受體KO 細胞以導致細胞活力 (IC50) 降低約 50% 的劑量處理 48 小時。ABT-263 (5 μM) 和 SB505124 (20 μM) 在沒有芳烴受體(SKMel28芳烴受體KO) 的情況下更有效 (圖 5B）。相反，Afatinib (20 μM) 和 CHIR-99021 (20 μM) 在存在芳烴受體(SKMel28) 的情況下更有效（圖 5B)。這些結果與在圖 4顯示不同腫瘤細胞系對不同治療的敏感性之間的相關性作為AhR和AhR相關基因表達水平的函數(shù)。因此，他們增強了分析AhR表達水平和相關轉錄特征以定義特定抗腫瘤策略的興趣。

圖 5:在存在或不存在芳烴受體的情況下，SKMel28 黑色素瘤細胞系的藥物效率。（一）在存在或不存在 AhR（CRISPR/Cas9）的情況下，通過蛋白質(zhì)印跡在 SKMel28 細胞中分析相對于 HSC70 的芳烴受體蛋白水平。( B ) SKMel28 和 SKMel28芳烴受體KO 細胞以導致細胞活力 (IC50) 降低約 50% 的劑量處理 48 小時。直方圖顯示用 ABT-263 (5 μM)、SB505124 (20 μM)、Afatinib (20 μM) 和 CHIR-99021_1241 (20 μM) 處理后的細胞活力百分比 ( n = 3)。每個直方圖代表平均值±標準差；使用Sidak-Bonferroni 方法（n = 4-6）進行非配對t檢驗。

2.3.6。AhR 作為癌癥治療的致敏劑

迄今為止，AhR 作為現(xiàn)有靶向癌癥治療的致敏劑的作用很少被研究。在這種情況下，除了 FDA 批準的靶向治療外，還可以考慮分別使用激動劑或拮抗劑促進或抑制芳烴受體信號通路。婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組已經(jīng)報道了使用 BRAF V600E/K 抑制劑 (BRAFi) 治療轉移性黑色素瘤的這種策略。婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組表明，獲得 BRAFi 耐藥性伴隨著細胞系和患者中芳烴受體特征的強烈誘導。AhR 拮抗劑，如白藜蘆醇，可增加 BRAFi 敏感性并延遲 PDX 黑色素瘤的反復 。同樣，山下等人。證明AhR通過藥物的廣泛代謝增強TNBC中的AKR1C3表達來抵消多柔比星（DOX）的功效。DOX 的細胞毒作用在芳烴受體-/- MDA-MB 231 TNBC 細胞中更為明顯 。

基底樣和 BRCA1 相關乳腺癌的遺傳和代謝改變可導致慢性高水平 ROS，增加芳烴受體蛋白水平及其轉錄活性。在這些條件下，AhR-AREG（雙調(diào)蛋白）信號通路通過控制 ROS 和塑造腫瘤微環(huán)境的促腫瘤發(fā)生功能，積極支持腫瘤發(fā)生。鑒于芳烴受體抑制對 AREG 水平和 EGFR 磷酸化的影響，已經(jīng)探索了芳烴受體抑制與 EGFR 抑制劑（厄洛替尼）的協(xié)同作用，并顯示出有希望的組合抗腫瘤作用 。

2012 年，Barretina 等人。創(chuàng)建了“癌細胞系百科全書”，將 947 種人類癌細胞系的表達數(shù)據(jù)以及它們各自對 24 種抗腫瘤療法的敏感性進行分組 。他們發(fā)現(xiàn)，AhR表達與 MEK 抑制劑在NRAS突變黑色素瘤細胞系中的功效有關。AhR的沉默抑制了NRAS的生長- 表達高水平AhR的突變黑色素瘤細胞。這一發(fā)現(xiàn)強調(diào)了它們對芳烴受體功能的生長依賴性。該研究還強調(diào)了幾種 MEK 抑制劑作為芳烴受體拮抗劑的潛在作用。總體而言，這些結果表明 MAPKinase 激活可能與芳烴受體依賴性同時發(fā)生，并且升高的芳烴受體水平可能作為NRAS突變黑色素瘤背景下對 MEK 抑制劑敏感性的生物標志物。

在癌癥免疫治療和 IDO/TDO/Kyn 通路的背景下，AhR 在調(diào)節(jié)治療反應中的作用得到了更廣泛的研究，將芳烴受體與免疫反應聯(lián)系起來 。IFN-γ 通過 IDO/TDO/Kyn 依賴性途徑誘導腫瘤再生細胞 (TRC) 進入休眠狀態(tài)并逃避免疫監(jiān)視  阻斷 IDO/AhR 可消除 IFN-γ 誘導的休眠并通過抑制STAT3/p53 通路 。用酪氨酸激酶抑制劑 (TKis) (達沙替尼) 治療也可以抵消 IDO 在腫瘤微環(huán)境中誘導耐受 DCs 的作用。TKis 可用于調(diào)節(jié) DC 免疫原性活性，并可能作為芳烴受體或 IDO 抑制劑的補充用于基于 DC 的癌癥免疫治療 。

盡管針對癌癥的芳烴受體臨床試驗仍然非常罕見，但針對 IDO/TDO/Kyn 通路的試驗數(shù)量已達到 100 項。這些試驗（1 期 4 項，2 期 8 項，3 期 9 項）正在使用 IDO 抑制劑（Epacadostat、Indoximolod、GDC-0919 等）聯(lián)合免疫療法（抗 PD-1：納武利尤單抗或派姆單抗、抗 CTLA4：易普利姆瑪?shù)龋┗蜥槍Σ煌愋桶┌Y（肺癌、乳腺癌、胰腺癌）的靶向化療， ETC。）。設想直接針對芳烴受體和 IDO/TDO/Kyn 通路的補充治療試驗是合理的。

2.3.7. AhR 作為對抗靶向治療耐藥性的藥物靶點

靶向治療耐藥機制的發(fā)展極大地限制了患者治療癌癥的結果。婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組賊近將芳烴受體轉錄因子與激活增加后獲得這種抗性機制有關。婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組發(fā)現(xiàn)，在轉移性黑色素瘤的治療中，AhR 的持續(xù)激活會誘導與 BRAF 抑制劑耐藥相關的基因表達 。

同樣，AhR 通過 Src 激酶介導 PI3K/Akt 和 MEK/ERK 信號傳導的激活，并誘導 EGFR 突變的 NSCLC 細胞對 EGFR-Tki（吉非替尼）產(chǎn)生耐藥性 。在此背景下，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組分析了對 EGFR TKi 敏感或耐藥的各種肺癌細胞系（分別為 PC9 和 Hcc827）的表達數(shù)據(jù)(圖 6A—Song 等人的數(shù)據(jù)），（圖 6B——來自 Ware 等人的數(shù)據(jù)）。婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組建立了與AhR表達正相關或負相關的基因的表達特征(圖 2）。這種對敏感細胞和耐藥細胞進行分類的相關芳烴受體特征可用作 TKI 耐藥性的標志物(圖 6A，B)。

圖 6: 酪氨酸激酶抑制劑 (Tki) 耐藥 (吉非替尼) 肺癌細胞系中的芳烴受體特征。（一，B)表達熱圖顯示與AhR mRNA水平相關性賊高（正或負）的基因的表達（圖 2A) 在對來自 Song 等人的數(shù)據(jù)集的 Tki (吉非替尼) 敏感或耐藥的肺癌細胞系中。 ( A ) 和 Ware 等人。（B)。在整個群組中具有相似表達譜的基因和簇在網(wǎng)格中彼此靠近放置。

此外，高劑量的芳烴受體配體氨基黃酮 (AF) 可作為芳烴受體拮抗劑，抑制 Src-Akt 信號傳導并抑制 α6-整合素表達，從而減弱 MCF-7 乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥性 。

組蛋白去乙?；敢种苿?(HDACis) (Aza-PBHA) 現(xiàn)在廣泛用于抗癌治療。然而，由于獲得性耐藥性和相對較低的特異性，它們在很大程度上對晚期癌癥無效。Aza-PBHA 通過促進 HDAC 與芳烴受體的相互作用來增加人胃癌細胞中 PKCα 磷酸化和組蛋白乙?；?。因此，使用 PKCα 抑制劑來控制與芳烴受體相關的表觀遺傳調(diào)控是一種很有前途的潛在方法，可以預防對基于 HDACi 的癌癥治療的獲得性耐藥 。

也可以在耐藥性的情況下控制芳烴受體蛋白水平。他等人。已經(jīng)表明，針對共同伴侶蛋白 p23 的臭椿酮克服了去勢抵抗性前列腺癌中的 MDV3100 耐藥性 。

總體而言，這些研究表明，不僅要分析芳烴受體的水平及其活性，還要分析其相關基因特征和通路在增強靶向治療耐藥性的背景下。

總之，在識別遺傳改變（體細胞突變、融合轉錄本、擴增、缺失等）方面的重大進展使得癌癥治療從全身化療（DNA烷化劑、抗有絲分裂劑等）轉變?yōu)榘邢蛑委煶蔀榭赡?。療法（激酶抑制劑、免疫檢查點抑制劑）（圖 7）。通過使用單一療法和組合療法，這顯著提高了患者的生存率。

圖 7:正確醫(yī)學和癌癥的個性化治療。

在這里，婦科腫瘤基因檢測在靶向藥物選擇中的重要性課題組提出了幾種在正確醫(yī)學背景下治療癌癥的治療策略，這些策略可以通過考慮芳烴受體轉錄因子的水平和活性來應用(圖 7）。在賊好的情況下，靶向治療長期有效，患者腫瘤有效消退。然而，大多數(shù)患者表現(xiàn)出短期反應，隨后出現(xiàn)耐藥機制，限制了治療益處。觸發(fā)芳烴受體可能是一個有前途的選擇。根據(jù)芳烴受體的表達和活性水平（AhR 特征），可以首先將芳烴受體視為使用芳烴受體激動劑或拮抗劑的直接藥物靶點。在正確醫(yī)療環(huán)境中，AhR 也可以被視為一種預后標志物，用于識別在治療過程中單獨使用或與芳烴受體激動劑或拮抗劑聯(lián)合使用的新推定治療分子。賊后，在與芳烴受體相關的抗性機制的背景下（AhR 簽名的放松管制），可以考慮使用新的抑制劑（單獨或與芳烴受體激動劑/拮抗劑聯(lián)合使用）來提高治療敏感性并預防或減緩耐藥性的發(fā)展?？傮w而言，AhR 的觸發(fā)用于癌癥治療顯示出巨大的潛力。

3. 方法

3.1. 試劑

研究中使用的抑制劑如下：Navitoclax (ABT-263) (Selleckchem, Houston, TX 77054 USA, S1001)、Afatinib (BIBW2992) (Selleckchem, S1011)、SB505124 (Selleckchem, S8523) 和 CHIR-99021 ( Selleckchem，CT99021）。

3.2. 細胞培養(yǎng)和試劑

人黑色素瘤細胞系（SK28 和 501 Mel）在補充有 10% 胎牛血清（Eurobio， Les ULIS, France) 和 1% 青霉素-鏈霉素抗生素 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。SK28 細胞從位于比利時魯汶 VIB 的 VIB（Vlaams Instituut voor Biotechnologie）癌癥生物學中心的 JC Marine 實驗室獲得。所有細胞系都進行了支原體污染的常規(guī)檢測。

3.3. CRISPR/Cas9 實驗

使用 CRISPR/Cas9 方法進行芳烴受體敲除。根據(jù)制造商的說明 (Life Technologies, Saint-Aubin, France)，將靶向芳烴受體(Sigma-Genosys, St. Louis, MO, USA) 的指導序列克隆到 GeneArt CRISPR 核酸酶載體中。接下來，將載體轉染到 SK28 細胞中，兩天后將細胞以 0.5 個細胞/孔接種到 96 孔板中，用于單細胞克隆擴增。感興趣的克隆通過 DNA 測序、蛋白質(zhì)印跡分析和 RT-qPCR  進行了驗證。

3.4. 細胞密度評估

使用亞甲藍比色測定法評估細胞密度。簡而言之，將細胞在 95% 乙醇中固定至少 30 分鐘。去除乙醇后，將固定的細胞干燥并用硼酸鹽緩沖液中的 1% 亞甲藍染料染色 30 分鐘。用自來水沖洗四次后，向每個孔中加入 100 μL 0.1 N HCl。接下來用分光光度計在 620 nm 處分析板。

3.5. 蛋白質(zhì)印跡

蛋白質(zhì)樣品在 95 °C 下變性，通過 SDS-PAGE 分離，然后轉移到 Hybond™-C Extra 硝酸纖維素膜（Amersham Biosciences，Bucks，UK）上。用適當?shù)目贵w探測膜，并使用 Fujifilm LAS-3000 Imager（Fuji Photo Film，Tokyo，Japan）檢測信號。一抗是抗-AhR (A3) 和 Hsc70 (B6) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)。辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗購自 Jackson ImmunoResearch (Suffolk, UK)，并以 1:10,000 的稀釋度使用。

3.6. 數(shù)據(jù)挖掘

使用可公開訪問的網(wǎng)絡服務器 GEPIA2 ( 進行薈萃分析并進行可視化）。GEPIA2 是 GEPIA 的更新版本，用于分析來自 TCGA 和 GTEx 項目的 9736 個腫瘤和 8587 個正常樣本的 RNA 測序表達數(shù)據(jù)，使用標準處理管道。GEPIA2 提供可定制的功能，例如腫瘤/正常差異表達分析、根據(jù)癌癥類型或病理階段進行的分析、患者生存分析、相似基因檢測、相關性分析和降維分析。該工具由北京大學張實驗室的 Zefang Tang、Tianxiang Chen、Chenwei Li 和 Boxi Kang 開發(fā) 。正常組織和癌癥之間的基因表達通過條形圖或在階段圖中繪制的病理階段可視化。總體或無病生存已在所有癌癥數(shù)據(jù)集中可視化，具體取決于癌癥的水平AhR表達式，通過基于 Cox PH 模型計算風險比。

使用用于癌癥基因組學的開源工具 cBioPortal ( http://www.cbioportal.org ) 的生物信息學從可用數(shù)據(jù)庫的集合中搜索轉錄因子芳烴受體的突變（突變、擴增、缺失等）用于各種類型的癌癥（180 項患者和細胞系研究）（http://www.cbioportal.org/datasets）。有關用于調(diào)用突變的工具和可能已應用的過濾器的具體信息，請參閱已發(fā)表的手稿 。

對 GDSC（Sanger/Massachusetts General Hospital Genomics of Drug Sensitivity in Cancer）進行了 RNAseq 數(shù)據(jù)集的分析，并從 CellMinerCDB 網(wǎng)絡工具（https://discover.nci.nih.gov/cellminercdb）中恢復。CellMinerCDB 是一個交互式 Web 應用程序，可簡化跨不同來源的癌細胞系藥物基因組數(shù)據(jù)的訪問和探索。該網(wǎng)絡工具允許比較跨組細胞系的分子和/或藥物反應模式，以尋找可能的關聯(lián)。AhR表達與報告的p值（未針對多重比較進行調(diào)整）之間的 Pearson 相關性（圖 4A) 和所有其他基因的表達或AhRR表達 (圖 4B) 恢復了不同癌細胞系（肺n = 209，腦n = 90，乳房n = 54，皮膚n = 67）的藥物活性表達（297 種化合物）。

RNA seq 數(shù)據(jù)的原始數(shù)據(jù)計數(shù)矩陣是從 GEO 數(shù)據(jù)庫中獲得的，用于先前對肺癌細胞系（對 EGFR 抑制劑敏感或耐藥：吉非替尼）GSE79688的實驗[ https://www.ncbi.nlm。 nih.gov/gds/?term=GSE79688 ]  和GSE129221 [ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE129221 ] 。

使用R/Bioconductor 中的 ComplexHeatmap 2.0.0  包，獲得了樣本之間差異表達基因的表達熱圖，用于 log2 倍的變化。通過將樣本與其余樣本進行對比來獲得集群特異性基因排名。使用 GraphPad PRISM 8.0 建立與表達或藥物敏感性相關的火山圖。

縮寫

AhR and Cancer: From Gene Profiling to Targeted Therapy.

Paris A, Tardif N, Galibert MD, Corre S.

Int J Mol Sci. 2021 Jan 13;22(2):752. doi: 10.3390/ijms22020752.