【佳學(xué)基因檢測(cè)】通過外顯子組測(cè)序鑒定常見癌癥的易感基因：以家族性乳腺癌為例
腫瘤易感基因鑒定及腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因檢測(cè)導(dǎo)讀
乳腺癌易感性的遺傳成分在很大程度上是由基因決定的。候選基因病例對(duì)照重測(cè)序已經(jīng)確定了以罕見的蛋白質(zhì)截短突變?yōu)樘卣鞯囊赘谢?，這些突變具有中等的疾病風(fēng)險(xiǎn)。理論上，外顯子組測(cè)序應(yīng)該會(huì)產(chǎn)生更多此類基因。在這里，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組探討了這種方法的可行性和設(shè)計(jì)考慮。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組對(duì) 50 名家族性乳腺癌患者進(jìn)行了外顯子組測(cè)序，應(yīng)用頻率和蛋白質(zhì)功能過濾器來識(shí)別賊有可能致病的變異。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組確定了通過篩選符進(jìn)入t質(zhì)量過濾器的 867,378 個(gè)基因突變，其中 1,296 個(gè)基因突變通過了頻率和蛋白質(zhì)截?cái)噙^濾器。在已知基因中存在和不存在突變的個(gè)體中，經(jīng)過驗(yàn)證的、罕見的蛋白質(zhì)截短基因突變 (PTV) 的中位數(shù)為 10。兩組中突變基因的功能候選者相似。如果沒有基因解碼技術(shù)先驗(yàn)知識(shí)，這些基因基因?qū)⒉粫?huì)被識(shí)別為乳腺癌易感基因。每個(gè)人都攜帶多種可能與疾病有關(guān)的罕見突變。
腫瘤易感基因鑒定及腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因檢測(cè)關(guān)鍵詞
乳腺癌易感性，外顯子組測(cè)序，常見疾病遺傳學(xué)，缺失遺傳力外顯子組測(cè)序基因檢測(cè)與腫瘤風(fēng)險(xiǎn)判定
外顯子組測(cè)序已被證明在鑒定導(dǎo)致罕見孟德爾疾病的基因方面非常成功。在這種情況下，潛在的遺傳模型通常是已知的，并且突變譜是獨(dú)特的，并且很容易與未受影響個(gè)體的模式區(qū)分開來（在 Ku 等人 中進(jìn)行了評(píng)論）。事實(shí)證明，識(shí)別導(dǎo)致常見疾病的罕見遺傳變異更具挑戰(zhàn)性。潛在的遺傳結(jié)構(gòu)通常很復(fù)雜，而且通常知之甚少，外顯率可能是適度的和/或不完整的，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組強(qiáng)有力地預(yù)測(cè)遺傳變異對(duì)基因功能和疾病因果關(guān)系的影響的能力仍然有限。然而，許多常見疾病的遺傳力缺失的一個(gè)組成部分可能存在于中/低外顯率的罕見基因變異中，這些變異可能通過外顯子組測(cè)序來處理。
乳腺癌是少數(shù)已發(fā)現(xiàn)此類變異的常見疾病之一。使用候選基因病例對(duì)照重測(cè)序，DNA 修復(fù)基因如CHEK2、PALB2、BRIP1和ATM已被證明是乳腺癌易感基因 。這些基因的特點(diǎn)是與中等疾病風(fēng)險(xiǎn)（RR 2-4）相關(guān)的多個(gè)非常罕見的失活（主要是截?cái)啵┩蛔?。與高外顯率基因和低外顯率變異體一起，這些中等外顯率基因估計(jì)僅占乳腺癌家族風(fēng)險(xiǎn)的約 35% 。因此，很大一部分遺傳對(duì)乳腺癌的貢獻(xiàn)仍然無法解釋。
鑒于少數(shù)候選基因研究已經(jīng)在乳腺癌中產(chǎn)生了罕見的中等外顯率易感基因，因此極有可能存在此類其他基因。這些基因不能通過連鎖分析（風(fēng)險(xiǎn)不夠高）或全基因組關(guān)聯(lián)研究（突變不夠常見）來識(shí)別，但應(yīng)該可以通過適當(dāng)?shù)耐怙@子組測(cè)序研究來檢測(cè)。外顯子組測(cè)序提供了應(yīng)用不可知論而不是候選基因方法來發(fā)現(xiàn)它們的潛力，因此是一種極具吸引力的策略。然而，查詢生成的大量數(shù)據(jù)集以提供給定基因與乳腺癌關(guān)聯(lián)的有力證據(jù)是令人生畏的。探討利用外顯子組測(cè)序鑒定乳腺癌易感基因的可行性，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組對(duì) 50 名家族性乳腺癌患者的外顯子組進(jìn)行了測(cè)序?；诂F(xiàn)有的范例，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組應(yīng)用頻率和蛋白質(zhì)截?cái)噙^濾器來優(yōu)先考慮賊有可能充當(dāng)中等外顯率乳腺癌易感性等位基因的基因突變。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組在四個(gè)個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了已知乳腺癌易感基因的突變，證明了這種方法在已經(jīng)建立的易感基因中檢測(cè)突變的實(shí)用性。然后，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組將這些病例中的突變譜與已知基因中沒有突變的 8 個(gè)個(gè)體進(jìn)行了比較，以研究在發(fā)現(xiàn)新的疾病易感基因方面的效用。
患者和方法
補(bǔ)充材料中提供了樣品和方法的全部詳細(xì)信息。簡(jiǎn)而言之，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組對(duì)招募到家族性乳腺癌研究 (FBCS) 的 50 名個(gè)體進(jìn)行了外顯子組測(cè)序。這些家族的特征總結(jié)在表格1。所有個(gè)體都患有乳腺癌并且BRCA1和BRCA2突變均為陰性（通過 Sanger 測(cè)序和/或異源雙鏈分析和 MLPA）。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組在 30 個(gè)個(gè)體中使用了市售的 38 Mb 外顯子組陣列，在 20 個(gè)個(gè)體中使用了 47.9 Mb 定制的 GENCODE 外顯子組陣列 。在 Illumina Genome Analyzer IIx 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組使用 NextGENe 軟件（2.10 版）進(jìn)行讀取映射和變異分析，并應(yīng)用調(diào)用質(zhì)量、頻率和蛋白質(zhì)截?cái)噙^濾器來優(yōu)先考慮變異以供進(jìn)一步考慮。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組選擇了12個(gè)案例進(jìn)行詳細(xì)分析；四個(gè)已知乳腺癌易感基因發(fā)生突變，八個(gè)沒有。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組通過 Sanger 測(cè)序?qū)?12 個(gè)樣本中的所有優(yōu)先基因突變進(jìn)行了驗(yàn)證分析。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組使用 ToppGene Suite 進(jìn)行了基因列表富集分析。表格1：家族性乳腺癌外顯子組研究先證者總結(jié)
| 乳腺癌病例的特征 | |
| 案例總數(shù) | 50 |
| 雙邊案例 | 42 |
| 單方面案件 | 8 |
| 中位診斷年齡 | |
| 先進(jìn)個(gè)乳腺癌 | 53 |
| 第二乳腺癌 | 60 |
| 中位家族史分?jǐn)?shù)* (FHS) | 3 |
*患有雙側(cè)乳腺癌的個(gè)體和兩個(gè)患有乳腺癌的一級(jí)親屬（或同等學(xué)歷）的 FHS = 3
結(jié)果
外顯子組測(cè)序
總體而言，每個(gè)樣本平均產(chǎn)生 5350 萬條讀數(shù)，通常 99% 的讀數(shù)映射到參考基因組。目標(biāo)區(qū)域內(nèi) 83%（范圍 41%-88%）堿基的中位數(shù)覆蓋率≥15/樣本（在線補(bǔ)充表 2）。由于使用了兩個(gè)不同的外顯子組陣列并且測(cè)序進(jìn)行了幾個(gè)月，因此存在相當(dāng)大的樣本間差異?？傮w而言，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組在 NextGENe 默認(rèn)設(shè)置下的 50 個(gè)外顯子組中確定了 1,592,412 個(gè)基因突變。在腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組排除所有讀取覆蓋率 <15 讀取的變異、具有突基因突變的堿基替換：野生型讀取百分比 <30%、內(nèi)含子變異（剪接點(diǎn)處的變異除外）和同義變異后，仍有 353,948 個(gè)變異。為了進(jìn)一步優(yōu)先考慮賊有可能導(dǎo)致疾病的變異，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組應(yīng)用過濾器來檢測(cè)導(dǎo)致蛋白質(zhì)截?cái)嗟男蛄凶儺?，如前所?。這確定了所有預(yù)測(cè)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)過早截?cái)嗟幕蛲蛔儯阂拼a插入和缺失、無義突變和共有剪接殘基處的突變。該腳本還刪除了具有 5 個(gè)或更多不同截?cái)嗷蛲蛔兊幕蛑械幕蛲蛔儯ㄒ驗(yàn)檫@些很可能是假基因或耐受單倍體不足而不引起疾?。?。該過濾器識(shí)別了 15,784 個(gè)截?cái)嗷蛲蛔儭榱藢?duì)后續(xù)變異進(jìn)行優(yōu)先排序，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組接下來應(yīng)用了頻率過濾器來識(shí)別 50 例家族性乳腺癌病例中的 1 例中存在的變異，這與已知乳腺癌易感基因的突變流行率一致 。在此過濾器之后，剩下 1,296 個(gè)基因突變。12 個(gè)外顯子組的變異驗(yàn)證
在 1,296 個(gè)基因突變中，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組確定了已知易感基因中的四個(gè)突變，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組通過 Sanger 測(cè)序證實(shí)了這些突變；三個(gè)位于中等外顯率基因CHEK2（n = 2）和ATM（n = 1）中。第四個(gè)是BRCA2中的剪接突變，它逃避了異源雙鏈分析的檢測(cè)，這被認(rèn)為降低了對(duì)堿基取代的敏感性（表 2）。表 2：在已知乳腺癌易感基因中存在突變的家族性乳腺癌先證者中確認(rèn)的雜合截?cái)嗷蛲蛔儭?/h3>
| ID | 基因 | 截?cái)嗤蛔?/td> | 疾病相關(guān)性 |
| 1 | BRCA2 | c.7977-1G>C | 乳腺癌+卵巢癌（單等位基因），F(xiàn)A-D1（雙等位基因） |
| BRIX1 | c.793-2_793-1insA | ||
| CASP5 | c.1135+1C>T | ||
| CXCL6 | c.239_240insT | ||
| FILIP1 | c.303delG | ||
| HEATR7B | c.2214+5A>G | ||
| IGSF22 | c.479-2T>A | ||
| MLL4 | c.3059_3060dupG | ||
| PTCHD3 | c.923_924dupG | ||
| SLAMF6 | c.321G>C, p.Y107X | ||
| SMARCD2 | c.574G>A，p.R136X | ||
| SSX9 | c.110delC | ||
| TNFAIP6 | c.90G>A，p.W30X | ||
| 2 | CHEK2 | c.1100delC | 乳腺癌（單等位基因） |
| C2orf63 | c.1384+2A>T | ||
| CFHR5 | c.486_487insA | 膜增生性腎小球腎炎，II型 | |
| PPEF2 | c.1960G>A, p.R654X | ||
| SERPINI2 | c.628_629delAC | ||
| 3 | CHEK2 | c.658T>A, p.K220X | 乳腺癌（單等位基因） |
| ABCC11 | c.2813C>G, p.S938X | ||
| DNMT3A | c.1025_1026insC | AML | |
| EPS8L1 | c.1514_1515dupT | ||
| FTMT | c.436A>T，p.K146X | ||
| LOC64702 | c.303_304delAT | ||
| MCAT | c.729+1G>T | ||
| NOD2 | c.3019_3020dupC | 克羅恩病（單等位基因） | |
| PRMT7 | c.1056-1G>T | ||
| PRSS7 | c.2042_2043dupT | 腸激酶缺乏癥（雙等位基因） | |
| VPS13B | c.6732+1G>A | 科恩綜合征（雙等位基因） | |
| WRN | c.1230_1231insA | Werner 綜合征（雙等位基因） | |
| ZNF451 | c.488G>G/A, p.W163X | ||
| ZNF582 | c.136+1G>T | ||
| 4 | ATM | c.4396C>T, p.R1466X | 乳腺癌（單等位基因）、共濟(jì)失調(diào)性遠(yuǎn)端血管擴(kuò)張癥（雙等位基因） |
| FETUB | c.127_128insCA | ||
| KIAA1919 | c.614delT | ||
| SLC26A10 | c.1483C>T, p.R495X | ||
| TAOK1 | c.2544+5A>G | ||
| ZIM2 | c.1513C>T, p.R505X |
腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組對(duì) 292 個(gè)擴(kuò)增子中的 12 個(gè)樣本（4 個(gè)具有已知基因突變，8 個(gè)沒有）中通過所有過濾器的所有 316 個(gè)基因突變進(jìn)行了 Sanger 測(cè)序評(píng)估。241 個(gè)擴(kuò)增子的測(cè)序成功。51 個(gè)擴(kuò)增子未能通過自動(dòng)化設(shè)計(jì)和測(cè)序過程。確認(rèn)了 127 個(gè)基因突變（68 個(gè)堿基替換，59 個(gè)插入缺失），盡管對(duì)于三個(gè)基因突變，Sanger 測(cè)序顯示缺失是框內(nèi)的。這些從賊終分析中刪除，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)導(dǎo)致過早的蛋白質(zhì)截?cái)?。在剩余?114 個(gè)擴(kuò)增子中未檢測(cè)到變異，即這些是假陽性調(diào)用（23 個(gè)堿基替換，91 個(gè)插入缺失）。這種相對(duì)較高的誤報(bào)率反映了腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組故意降低插入和刪除基因突變的調(diào)用質(zhì)量過濾器設(shè)置；此類基因突變與疾病相關(guān)的先驗(yàn)可能性很高，但很難調(diào)用短讀數(shù)據(jù)。在具有已知基因突變（中位數(shù) = 10，范圍 5-13）和沒有（中位數(shù) = 10，范圍 7-15，p = 0.55）的樣本中看到的截?cái)嗷蛲蛔償?shù)量之間沒有差異。只有兩個(gè)基因包含兩個(gè)截?cái)嗷蛲蛔?；CHEK2和USP45，其余 122 個(gè)截短基因突變出現(xiàn)在不同的基因中。
驗(yàn)證截?cái)嗷蛲蛔兊幕蛄斜砀患治?/h3>
腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組使用 ToppGene Suite ToppFun 軟件 對(duì)所有 122 個(gè)基因進(jìn)行了基因富集分析，其中腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組鑒定了截?cái)嘧儺愺w，以及 85 個(gè)已知基因沒有突變的病例中存在截?cái)嗤蛔兊?85 個(gè)基因的子集。在任一分析中，在 Bonferroni 校正下，在P值截止值為 0.05 時(shí)，沒有基因本體術(shù)語被確定為顯著。
通過外顯子組測(cè)序鑒定腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因的技術(shù)應(yīng)用討論
外顯子組測(cè)序正在有效改變腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組識(shí)別易患疾病的罕見遺傳變異的能力。然而，在罕見的孟德爾綜合征背景之外對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)的詢問和解釋是非常具有挑戰(zhàn)性的。在這里，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組在家族性乳腺癌中進(jìn)行了外顯子組測(cè)序，這是少數(shù)有令人信服的證據(jù)表明罕見的中/低外顯率易感基因的疾病之一。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組使用了許多策略來增強(qiáng)分析能力。首先，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組使用了富含遺傳易感因素的病例，特別是患有雙側(cè)乳腺癌和/或乳腺癌家族史的個(gè)體。如前所述，這顯著提高了基因發(fā)現(xiàn)的能力。在疾病基因鑒定研究中經(jīng)?？紤]的另一種方法是優(yōu)先考慮遠(yuǎn)親受影響個(gè)體共享的基因突變以進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。這種策略在識(shí)別罕見條件下的高滲透突變方面賊有效。在常見的情況下，如乳腺癌，表型率通常很高，易感突變的外顯率通常是中/低，這兩者都會(huì)降低這種策略的效用。
其次，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組使用了一種數(shù)據(jù)過濾策略，允許對(duì)罕見的蛋白質(zhì)截?cái)嗤蛔冞M(jìn)行優(yōu)先排序；這類突變具有疾病關(guān)聯(lián)的強(qiáng)有力的先前證據(jù)，特別是在乳腺癌中。此外，對(duì)復(fù)雜疾病中的 NGS 數(shù)據(jù)過濾的基于模擬的分析支持對(duì)預(yù)測(cè)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)過早截?cái)嗟幕蛲蛔冞M(jìn)行優(yōu)先排序，作為疾病基因鑒定的有用策略 。即使經(jīng)過嚴(yán)格篩選，在 50 個(gè)病例中仍識(shí)別出 1,296 個(gè) PTV。這包括已知乳腺癌易感基因中的四個(gè)突變，進(jìn)一步證明了外顯子組測(cè)序在識(shí)別疾病相關(guān)突變方面的實(shí)用性。
為了探索識(shí)別新型乳腺癌易感基因的可行性，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組首先在 50 例中的?? 12 例中進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以確定哪些 PTV 是真實(shí)的。腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組總共確認(rèn)了 12 個(gè)樣本中的 124 個(gè) PTV。在已知基因發(fā)生突變和不發(fā)生突變的情況下，PTV 的中位數(shù)相似，這表明僅識(shí)別罕見的 PTV 不足以證明因果關(guān)系，正如一些論文所暗示的那樣 ；需要額外的證據(jù)。觀察結(jié)果進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)，即已知基因突變的病例在可能與疾病相關(guān)的基因中也攜帶其他 PTV。例如，具有BRCA2突變的個(gè)體（案例 1）在凋亡調(diào)節(jié)因子 CASP5 中也攜帶PTV，以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SMARCD2和SSX9，所有這些似乎都與腫瘤發(fā)生有關(guān)（表 2）。同樣，案例 3在與多種疾病有關(guān)的其他五個(gè)基因中攜帶CHEK2突變和 PTV，包括 DNA 修復(fù)基因WRN，它會(huì)導(dǎo)致雙等位基因突變攜帶者中的 Werner 綜合征 。這些額外的突變中的一些也可能導(dǎo)致乳腺癌，實(shí)際上預(yù)計(jì)個(gè)體將具有多種遺傳變異，這些變異賦予疾病易感性，特別是中等外顯率突變的攜帶者。然而，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組僅在 12 例病例中鑒定了 122 個(gè)不同基因中的 PTV，這表明，首先，大多數(shù)突變必須與癌癥無關(guān)，其次，證明疾病關(guān)聯(lián)所需的舉證責(zé)任，即使對(duì)于罕見的截?cái)嗤蛔?，也是非常重要的。重大的。證明健康個(gè)體中罕見的 PTV 的研究進(jìn)一步支持了這一點(diǎn) 。將需要將病例數(shù)據(jù)與通過類似方法獲得的對(duì)照數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，并與覆蓋率等指標(biāo)相匹配，以高效地區(qū)分耐受單倍體不足的基因與疾病易感基因。
在基因鑒定研究中，考慮基因功能已被證明是一種有用的優(yōu)先策略。對(duì)于乳腺癌，DNA 修復(fù)基因的突變分析，特別是那些與高外顯率乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2相互作用的基因，是鑒定乳腺癌易感基因如PALB2和BRIP1 的基礎(chǔ)。然而，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組的計(jì)算機(jī)分析并未揭示在腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組進(jìn)行了全面驗(yàn)證的 12 例家族性乳腺癌病例中 PTV 基因中任何一組功能相關(guān)基因的富集。
只有兩個(gè)基因包含兩種不同的截?cái)嗷蛲蛔儯渲兄皇荂HEK2，一種有效的乳腺癌易感基因。這表明在更大的實(shí)驗(yàn)中，具有多個(gè)不同截?cái)嗤蛔兊幕蚩梢宰鳛樽R(shí)別真正易感基因的有用過濾器。這種模式對(duì)于在 1000-3000 個(gè)樣本的研究中鑒定該類別的其他基因至關(guān)重要 。外顯子組測(cè)序研究所需的樣本數(shù)量未知，并且會(huì)受到多種因素的影響，包括相關(guān)基因突變的普遍性和外顯率、分析的樣本類型（基因富集與未選擇）以及多重測(cè)試的校正。但是，很可能需要對(duì)數(shù)百/數(shù)千個(gè)樣本進(jìn)行外顯子分析。后續(xù)研究，類似于某些 GWAS 的分階段方法，可能有助于復(fù)制外顯子組的發(fā)現(xiàn)并提供基因易患疾病的明確證據(jù)。對(duì)數(shù)千個(gè)樣本中的單個(gè)基因或一小組基因進(jìn)行復(fù)制測(cè)序研究變得可行，并且可以針對(duì)例如外顯子組研究中具有多種、不同、
總之，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因列表編寫組的實(shí)驗(yàn)提供了進(jìn)一步的證據(jù)，表明外顯子組分析可以識(shí)別已知疾病相關(guān)基因中的致病突變。這項(xiàng)技術(shù)在常見、復(fù)雜條件下用于基因發(fā)現(xiàn)的潛力很高。然而，這將需要精心設(shè)計(jì)的大規(guī)模實(shí)驗(yàn)，通過明智的樣本選擇和分析優(yōu)先級(jí)排序方法，再加上復(fù)制分析，以提供疾病關(guān)聯(lián)的有力證據(jù)。
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Predisposition gene identification in common cancers by exome sequencing: insights from familial breast cancer.
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Breast Cancer Res Treat. 2012 Jul;134(1):429-33. doi: 10.1007/s10549-012-2057-x. Epub 2012 Apr 18.
PMID: 22527104
(責(zé)任編輯：佳學(xué)基因)
