【佳學(xué)基因靶向藥物基因檢測(cè)】使用噬菌體選擇肽的高通量測(cè)序鑒定癌癥特異性受體突變 EGFRvIII 的新型肽配體

神奇藥檢測(cè)基因兩萬(wàn)有必要嗎——標(biāo)準(zhǔn)

與專家交流選擇如何有效的藥物治療知道《Sci Rep》在 2022 Dec 1;12(1):20725.發(fā)表了一篇題目為《使用噬菌體選擇肽的高通量測(cè)序鑒定癌癥特異性受體突變 EGFRvIII 的新型肽配體》腫瘤靶向藥物治療基因檢測(cè)臨床研究文章。該研究由Sourour Mansour, Indranil Adhya, Coralie Lebleu, Rama Dumpati, Ahmed Rehan, Santu Chall, Jingqi Dai, Gauthier Errasti, Thomas Delacroix, Raj Chakrabarti等完成。

癌細(xì)胞通常顯示出大量的某些細(xì)胞表面分子，例如腫瘤相關(guān)抗原或特異性受體，這些分子很少出現(xiàn)在正常組織中，代表了腫瘤診斷和治療的潛在目標(biāo)。 EGFRvIII 存在于許多人類惡性腫瘤中：卵巢癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，但從未在正常組織中發(fā)現(xiàn)過(guò)。因此，突變受體是開(kāi)發(fā)新的癌癥特異性配體的明顯選擇。因此，篩選和鑒定特異性結(jié)合EGFRvIII受體的肽將有助于開(kāi)發(fā)用于癌癥檢測(cè)和治療的新型探針。為此，腫瘤靶向藥物研究團(tuán)隊(duì)使用 12 聚體噬菌體展示肽庫(kù)來(lái)獲得特異性結(jié)合 EGFRvIII 受體的肽。考慮到最終目標(biāo)是在靶向藥物遞送系統(tǒng)中使用 EGFRvIII 特異性肽，佳學(xué)基因檢測(cè)提出的關(guān)鍵參數(shù)是靶向細(xì)胞的特異性。構(gòu)象表位靶向是無(wú)正常組織毒性的特異性靶向的關(guān)鍵概念。事實(shí)上，溶液中的 EGF 受體在未受刺激的條件下主要作為單體存在。 EGFR 激活過(guò)程包括多個(gè)步驟：配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化和 EGFR 二聚化導(dǎo)致酪氨酸殘基的反式磷酸化和自身磷酸化。這允許暴露某些稱為構(gòu)象表位的表位。 EGFR 的激活通常是由配體的結(jié)合引起的。然而，由于 EGFR 過(guò)表達(dá)，允許該表位暴露的條件優(yōu)先發(fā)生在腫瘤特異性條件下。

最常見(jiàn)的篩選策略包括使用純化的特異性靶標(biāo)，將其吸收到固相中，然后通過(guò) ELISA 篩選結(jié)合。使用這種方法，使用純化的重組蛋白選擇的肽可能無(wú)法進(jìn)入活細(xì)胞中的靶標(biāo)。此外，由于成本和時(shí)間相關(guān)因素，測(cè)序通常只在最后一輪進(jìn)行，掩蓋了不同肽命中的分析和隨后的多輪富集。為了最大限度地降低這種風(fēng)險(xiǎn)，腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)基因解碼對(duì) EGFRvIII 的細(xì)胞外活性形式采用了直接捕獲淘選，因此構(gòu)象表位也在溶液中瞬時(shí)顯示。對(duì)于從洗脫的噬菌體中選擇肽，使用高通量測(cè)序來(lái)分析分離肽的豐度和多樣性，以及識(shí)別目標(biāo)結(jié)合肽基序。因此，佳學(xué)基因靶向藥物研究團(tuán)隊(duì)能夠選擇與這種瞬時(shí)構(gòu)象結(jié)合的肽。科學(xué) 家團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步證實(shí)了在穩(wěn)定表達(dá) EGFRvIII 受體的完整和活細(xì)胞上使用噬菌體展示肽作為靶細(xì)胞的結(jié)合，這確保了更具體的靶標(biāo)和可以特異性結(jié)合表達(dá) EGFRvIII 受體的細(xì)胞的肽的分離。

在這項(xiàng)研究中，使用高通量測(cè)序分析根據(jù)多輪富集確定的熱門命中，從第三輪生物淘選中選擇了五種肽。在細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)之前對(duì)選定的肽進(jìn)行了肽克隆和測(cè)序驗(yàn)證。隨后，使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步測(cè)試了五種噬菌體展示的肽，以確認(rèn)它們與 EGFRvIII 細(xì)胞的特異性結(jié)合。為了減少選擇用于結(jié)合確認(rèn)的每個(gè)噬菌體展示肽的非特異性結(jié)合，在與 EGFR WT 和 EGFRvIII 細(xì)胞孵育之前，將擴(kuò)增的噬菌體與吸收親本 HEK 細(xì)胞混合。在這五種噬菌體展示的肽中，與 EGFR WT 和親本細(xì)胞相比，VLGREEWSTSYW 似乎顯示出與 EGFRvIII 細(xì)胞的特異性結(jié)合，這讓人相信噬菌體與其各自靶抗原的細(xì)胞表面暴露區(qū)域結(jié)合。因此，選擇該肽進(jìn)行進(jìn)一步研究。多序列比對(duì)顯示該序列與各種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中任何特征蛋白質(zhì)的序列沒(méi)有表現(xiàn)出同源性。這一發(fā)現(xiàn)表明 VLGREEWSTSYW 是一種新型肽，可以模擬復(fù)雜的表位，這可以解釋為什么它不存在于任何數(shù)據(jù)庫(kù)中。

對(duì)接結(jié)果表明，鑒定出的肽靶向人類癌癥特異性 EGFRvIII。 EGFRvIII 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)通過(guò)同源建模進(jìn)行建模。肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)被預(yù)測(cè)并?？吭?EGFRvIII 的活性位點(diǎn)上。

通過(guò)這一靶向藥物基因檢測(cè)對(duì)藥物開(kāi)發(fā)的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用過(guò)表達(dá) EGFRvIII 或 EGFR WT 的細(xì)胞時(shí)，與 FALGEA（這是迄今為止報(bào)道的唯一 EGFRvIII 選擇性肽）相比，VLGREEWSTSYW 肽對(duì) EGFRvIII 細(xì)胞的選擇性優(yōu)于對(duì) EGFR WT 細(xì)胞的選擇性。流式細(xì)胞術(shù)和 MST 實(shí)驗(yàn)表明，盡管在溶液中結(jié)合較弱，但 VLGREEWSTSYW 在細(xì)胞表面結(jié)合實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更大的親和力，并證明兩種肽都與 EGFRvIII 結(jié)合，而它們?cè)谌芤褐芯惶禺愋越Y(jié)合 EGFR WT

腫瘤基因檢測(cè)及靶向藥物治療研究關(guān)鍵詞：

癌癥,特異性,表皮生長(zhǎng)因子,酪氨酸激酶,受體,突變變體 III,EGFRvIII,噬菌體展示，新型肽配體

腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)的臨床前研究結(jié)果

腫瘤靶向藥物的研究性發(fā)現(xiàn)在此報(bào)告了使用針對(duì)癌癥特異性表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶受體突變變體 III (EGFRvIII) 的噬菌體展示的新型肽配體的選擇和表征。這種受體在幾種癌癥中表達(dá)：卵巢癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，但在正常組織中不表達(dá)。針對(duì) EGFRvIII 篩選了一個(gè) 12 聚體隨機(jī)肽文庫(kù)。噬菌體選擇的肽通過(guò)下一代測(cè)序 (NGS) 進(jìn)行高通量測(cè)序，并研究了它們的多樣性以鑒定預(yù)計(jì)與 EGFRvIII 具有最高親和力的高豐度克隆。對(duì)富集的肽進(jìn)行了表征，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)了它們對(duì)表達(dá) EGFRvIII、EGFR 野生型 (EGFR WT) 或低內(nèi)源水平 EGFR WT 的穩(wěn)定細(xì)胞系的結(jié)合能力。合成了最佳候選肽 VLGREEWSTSYW，并在體外驗(yàn)證了其對(duì) EGFRvIII 的結(jié)合特異性。此外，計(jì)算對(duì)接分析表明，所鑒定的肽選擇性地結(jié)合 EGFRvIII。因此，新型 VLGREEWSTSYW 肽是一種很有前途的 EGFRvIII 靶向劑，可用于未來(lái)的癌癥診斷和治療應(yīng)用。

腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)研究的重要意義：

表皮生長(zhǎng)因子 (EGF) 酪氨酸激酶受體突變變體 III (EGFRvIII)1 是為數(shù)不多的已知癌癥特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物之一。與野生型 EGF 受體 (EGFR WT) 相比，突變受體在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中缺少氨基酸殘基 6-273，并且刪除這 268 個(gè)氨基酸會(huì)在氨基酸 5 和 2742 之間產(chǎn)生一個(gè)具有新甘氨酸殘基的連接位點(diǎn)。 EGFRvIII 不包含配體結(jié)合域并且具有組成型活性。

盡管 EGFRvIII 的激酶活性比配體激活的 EGFR WT 弱得多，但發(fā)現(xiàn)它足以賦予腫瘤生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。 EGFRvIII 存在于許多人類惡性腫瘤中，例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌和乳腺癌。 EGFRvIII 是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中最常見(jiàn)的 EGFR 突變，在 20-50% 的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)。 EGFR WT9 過(guò)表達(dá)腫瘤患者的患病率最高，EGFRvIII 被認(rèn)為發(fā)生在 EGFR WT11 擴(kuò)增后。然而，與在大多數(shù)小鼠和人類健康細(xì)胞中表達(dá)的 EGFR WT 不同，EGFRvIII 從未在正常組織中被發(fā)現(xiàn)。因此，EGFRvIII 可用作癌癥診斷和治療的靶點(diǎn)，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

腫瘤靶向配體如肽和抗體可以有效地幫助將某些細(xì)胞毒劑（生物或合成的）遞送至腫瘤細(xì)胞，從而提高治療效果，同時(shí)限制正常組織暴露于細(xì)胞毒劑。治療方法包括使用非武裝單克隆抗體 (MAb) 放射性標(biāo)記的 MAb15、與免疫毒素偶聯(lián)的 MAb 或硼化樹(shù)枝狀聚合物。 EGFRvIII 特異的單鏈可變片段 (scFv) 被發(fā)現(xiàn)并整合到串聯(lián)抗體 (TandAb) 構(gòu)建體中。選擇性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的小肽 (< 5 kDa) 優(yōu)于 MAb (150 kDa)、TandAb (100 kDa) 和 scFvs (20–30 kDa)，因?yàn)樗鼈冇捎诔叽缧〉枚喽子诤铣珊托揎棧哂?更高的細(xì)胞膜穿透力，并具有較低的免疫原性。即使與抗體和片段相比，肽的結(jié)合親和力較低，但在開(kāi)發(fā)腫瘤靶向遞送系統(tǒng)時(shí)，可以通過(guò)在納米結(jié)構(gòu)表面摻入多個(gè)肽拷貝來(lái)提高親合力。

關(guān)于腫瘤成像應(yīng)用，迄今為止，只有 12 種癌癥突變特異性示蹤劑獲得 FDA 批準(zhǔn)，沒(méi)有一種用于腦腫瘤。肽示蹤劑優(yōu)于抗體示蹤劑，因?yàn)樗鼈兊拿庖咴缘颓页杀镜停ㄈ缟纤觯疫€因?yàn)樗鼈兛梢詮难汉头前薪M織中快速清除，注射到成像的時(shí)間更短，并且它們與更短的藥物相容 -活的同位素。因此，需要開(kāi)發(fā)與 EGFR WT 相比能夠以高特異性結(jié)合 EGFRvIII 的新肽，用于診斷、治療或治療應(yīng)用——作為使用放射性標(biāo)記或熒光團(tuán)標(biāo)記的顯像劑，用于肽-藥物偶聯(lián)物或靶向遞送系統(tǒng) .

現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了兩種用于靶向腫瘤細(xì)胞的EGFR的短肽。 FALGEA 肽被描述為結(jié)合 EGFR WT 和 EGFRvIII。從 GE11 肽中發(fā)現(xiàn)的 YHWYGYTPENVI 肽已被證明可與 EGFR WT 結(jié)合，但其與 EGFRvIII 的潛在結(jié)合尚不清楚。

這一具體的腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)的研究的目的是使用噬菌體展示鑒定與 EGFRvIII 結(jié)合的新型肽，這是一種廣泛用于開(kāi)發(fā)肽配體的方法。在我們的策略中，該過(guò)程涉及三輪親和力選擇和噬菌體擴(kuò)增的迭代，然后是高通量測(cè)序 (HTS)，以分析分離肽的豐度和多樣性。篩選的噬菌體展示的肽與蛋白質(zhì)靶標(biāo) EGFRvIII 的結(jié)合在細(xì)胞上進(jìn)行了測(cè)試，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了表征。僅合成潛在的命中以確認(rèn)它們的細(xì)胞結(jié)合，并通過(guò)微尺度熱泳 (MST) 和計(jì)算對(duì)接評(píng)估它們的結(jié)合親和力。