【佳學基因檢測】血漿DNA的外顯子組測序揭示了哌柏西 palbociclib加氟維司群治療后的基因變化

在參加 PALOMA-3 研究的 521 名患者中，有 459 名患者有可用的基線（治療第 1 天）血漿樣本，其中 287 名患者具有匹配的治療結束（EOT）。 與整個 PALOMA-3 研究人群相比，來自該組的配對樣本患者具有相似的 palbociclib 益處。 在沒有可用的匹配治療結束樣本的患者 (n = 172) 中，94 例沒有進展 (94/172, 54.6%)，而匹配組中有 74 例 (74/287, 25.8%)。 腫瘤基因解碼首先確定配對的第 1 天和 EOT 樣本用于血漿 DNA 外顯子組測序，以實現對 palbociclib 加氟維司群的進展遺傳事件的綜合評估（圖 1A）。 為了鑒定具有足夠腫瘤純度的配對血漿樣本用于外顯子組測序，我們開發(fā)了一種新的拷貝數和純度靶向測序策略，使用靶向擴增子組，該組包括乳腺癌中常見缺失區(qū)域的大約 1000 個單核苷酸多態(tài)性 (SNP)（參見材料和 方法)，并將其與 PIK3CA 和 ESR1 突變的數字 PCR 數據相結合 (13)。 使用這種方法，乳腺癌靶向藥物基因檢測確定了 16 名接受 palbociclib 加氟維司群治療的患者，他們在第 1 天和 EOT 時血漿中具有高腫瘤 DNA 純度（>10% 腫瘤純度），具有足夠的外顯子組文庫制備材料。 其中，9/16 (56.3%) 在第 1 天的 ctDNA 中有 PIK3CA 突變，6/16 (37.5%) 有 ESR1 突變。 五名患者具有匹配的種系 DNA，另外 3 個不匹配的種系 DNA 樣本也被測序以擴大種系面板以過濾測序噪音。 由于只有來自氟維司群加安慰劑組的 6 名患者具有符合質量控制標準的匹配樣本，因此未對這些患者進行測序。

圖1：配對的循環(huán)腫瘤 DNA (ctDNA) 外顯子組測序揭示了氟維司群和哌柏西利的頻繁克隆選擇

A – 使用液滴數字 PCR 和靶向 SNP 測序方法篩選來自 PALOMA-3 試驗的第 1 天和治療結束時的血漿樣本，以確定來自 palbociclib 加氟維司群組的患者，這些患者的血漿樣本具有足夠的腫瘤純度（>10% ) 用于血漿外顯子組測序。

 

B – 對 390 號患者進行的配對 ctDNA 外顯子組測序分析了克隆組成。 在 EOT 處檢測到新出現的 RB1 突變克隆，其中包含兩個失活的 RB1 突變。

 

C – 來自 ctDNA 的患者 390 的乳腺癌系統發(fā)育樹推斷。 黃色 - 存在于所有癌細胞中的軀干突變； 第 1 天出現的紫色亞克隆隨后在治療中消退：灰色 - 一種新出現的抗性克隆，其特征在于兩個 RB1 突變，分別產生于紫色亞克隆。

 

D – 在患者 390 的每個亞克隆中識別的突變特征的表示。原始數據顯示在補充表 3 中。

 

E – 在患者 390 的抗治療亞克隆中鑒定的兩個 RB1 突變 Q257X 和 N519fs 的數字 PCR 驗證。顯示第 1 天和 EOT 的結果，Y 軸突變體探針幅度和 X 軸野生型探針幅度。

 

F – 患者 253 的配對 ctDNA 外顯子組測序分析了克隆組成。 在 EOT 檢測到在第 1 天檢測不到的新 FGFR2 突變體克隆。

 

G——從 ctDNA 中推斷出的來自患者 253 的乳腺癌系統發(fā)育樹。 黃色 - 存在于所有癌細胞中的軀干突變； 紫色 - 以第 1 天出現的 ESR1 D538G 突變?yōu)樘卣鞯膩喛寺?，隨后在治療中消退； 橙色——以 FGFR2 激酶結構域突變?yōu)樘卣鞯男鲁霈F的抗性克隆，與紫色亞克隆分開產生； 灰色——由以 Q75E ESR1 突變?yōu)樘卣鞯?FGFR2 突變亞克隆產生的亞克隆。

 

H – 在來自患者 253 的每個個體克隆中識別的突變特征的表示。原始數據顯示在補充表 3 中。

 

I – 來自患者 253 的 FGFR2 突變的數字 PCR 驗證顯示第 1 天和 EOT 的血漿結果。

 

EOT – 治療結束，HR – 同源重組，MMR – 錯配修復，ctDNA – 循環(huán)腫瘤 DNA

血漿 DNA 外顯子組測序的中位深度為 164X（范圍 139-212），種系 DNA 的中位深度為 47X（范圍 34-58）。 第 1 天的兩個樣品有污染證據，這些對被排除在比較、配對分析之外。 第 1 天樣本中可檢測到的非同義變異的數量在患者之間差異很大（范圍 19 – 254）。 對所有樣本的突變特征分析表明，賊普遍的是特征 1（年齡）和 3（同源重組缺陷），這與現有的乳腺癌數據一致 (16)。 第 1 天的外顯子組測序數據還揭示了除 ESR1 突變外可能與內分泌耐藥性發(fā)展相關的遺傳標記——4/14 (28.6%) 患者的 NOTCH 家族受體 NOTCH2、NOTCH3 和 NOTCH4 突變，以及 2/14 患者的 NF1 突變 (14.3%)。 大多數患者的基因組不穩(wěn)定性指數在第 1 天和治療結束之間大致穩(wěn)定，但從突變負荷來看，患者之間存在相當大的差異。

在第 1 天和 EOT 血漿中，85.7% 12/14 患者的克隆進化和選擇在 palbociclib 加氟維司群中明顯可見（圖 1）。 390 號患者有兩個 RB1 截短突變，p.Q257X 和 p.N519fs，僅在治療結束時檢測到（圖 1B）。 使用 PyClone 進行的克隆性分析 (17) 表明這些 RB1 突變存在于耐藥亞克隆中，或者可能是平行進化導致表型收斂的獨立亞克隆，進一步的治療敏感亞克隆明顯以 RUNXT1 突變?yōu)樘卣?，該突變在治療后退化（圖 1C). 由 PyClone 模型確定的每個亞克隆的突變計數為 155（簇 1）、64（簇 2）和 51（簇 3）。 抗性亞克隆中的突變主要與 APOBEC 突變特征一致（圖 1D，補充表 3）。 RB1 突變通過數字 PCR 驗證，并確認在治療開始時不存在（圖 1E）。

第二名患者，253，在使用 palbociclib 加氟維司群治療期間表現出明顯的亞克隆選擇，該亞克隆具有 FGFR2 p.K569E 酪氨酸激酶結構域中的激活突變，在第 1 天樣本中未檢測到（圖 1F）。 由 PyClone 模型確定的每個亞克隆的突變計數為 51（簇 1）、49（簇 2）、54（簇 3）和 20（簇 4）。 新的顯性抗性亞克隆，以及一個額外的 ESR1 突變體 Q75E 子克隆，取代了第 1 天 ESR1 D538G 突變體克隆，該克隆被處理負選擇（圖 1G）。 由于 Q75E 不是公認的芳香化酶抑制劑耐藥性原因，并且位于 ESR1 的配體結合域之外，因此本病例中的這些發(fā)現表明，第 1 天和 EOT 之間顯性 ESR1 突變的變化可能反映了亞克隆選擇可能與功能性無關 ESR1 突變的后果，不同的 ESR1 突變標記單個克隆而不是潛在出現的抗性克隆。 正如患者 390 中的耐藥亞克隆所見，患者 253 中新顯性 FGFR2 突變亞克隆也有很大一部分突變與 APOBEC 特征一致，次要子克隆突變以錯配修復特征為主（圖 1H） ). FGFR2 突變的選擇通過數字 PCR 驗證（圖 1I）。 在另外三名患者中，可能有證據表明在抗原呈遞途徑中選擇了緊急突變。

這些發(fā)現表明，在使用哌柏西利聯合氟維司群的乳腺癌中，克隆進化很常見，有證據表明，出現的亞克隆的基因組可塑性可以由治療開始時占主導地位的大量疾病的不同突變過程驅動。