多重?zé)晒舛?PCR 技術(shù)

1.1 基于熒光探針的多重 PCR 技術(shù)

1.2 基于探針編碼的多重 PCR 技術(shù)

1.3 基于熒光染料的多重 PCR 技術(shù)

1.4 基于熒光探針熔解曲線的多重 PCR 技術(shù)

02

膜層析技術(shù) (Membrane chromatography) 是在柱層析技術(shù)上發(fā)展而來的一項技術(shù)，以膜介質(zhì)為基質(zhì)，偶聯(lián)相應(yīng)的離子交換、親和、疏水等化學(xué)基團，制作而成的一種新型的層析介質(zhì)。膜層析技術(shù)具有簡單快速并且能夠自動分離液體混合物的優(yōu)點，而多重 PCR 技術(shù)具有有效富集目的片段的優(yōu)點，將這兩種技術(shù)有機地結(jié)合在一起能夠形成一種靈敏度高、特異性好、成本低、簡便快速的多重核酸檢測方法。

該方法提前將靶標特異性的捕獲探針固定在層析膜的不同位置上，然后使變性后的多重PCR擴增產(chǎn)物通過毛細作用經(jīng)過層析膜，固定在特定位置的捕獲探針通過堿基互補配對的作用將末端帶有膠體金或熒光素的產(chǎn)物捕獲，而非特異的擴增產(chǎn)物及引物被洗脫，賊后通過肉眼或熒光檢測儀對產(chǎn)生的熒光進行檢測和識別 (圖 4) [32] 。

Mao 等 [33] 基于膠體金標記的核酸探針和側(cè)流試紙條建立了一種現(xiàn)場檢測目的基因的方法，利用這種核酸層析金標試紙條能夠在 15 min內(nèi)檢測出核酸樣本。Carter 等 [34] 發(fā)明的側(cè)流微陣列方法能夠快速、靈敏地對多種核酸進行檢測，并且不需要專門的儀器設(shè)備，這種方法以微型側(cè)流設(shè)備為基礎(chǔ)，利用核酸雜交介導(dǎo)靶標的捕獲。Gomez-Martinez等 [32] 開發(fā)的多重核酸檢測試紙條在現(xiàn)場實現(xiàn)了對 108 例獻血者血型相關(guān)基因型的正確鑒定。

基于膜層析的多重檢測技術(shù)以其操作簡單、攜帶便捷等優(yōu)點拓寬了可檢測的范圍，使檢測不再局限于實驗室，對于現(xiàn)場檢測也能夠?qū)?/span>現(xiàn) [35-37] ，但是膜層析技術(shù)中樣品的阻滯、非特異性雜交等問題仍然是今后需要解決的問題。

液相芯片技術(shù) (Liquid chip technology) 被稱為后基因組時代的芯片技術(shù)，也被稱為 xMAP 技術(shù)。它可以同時對 1 份標本中的 100 種不同目的分子進行檢測，并能在 30 min 內(nèi)檢測 96 個不同的樣本。

其液相微球編碼原理為，將兩種熒光染料分別用 10 種不同的濃度兩兩混合形成 10×10的熒光配比陣列，并對微球進行染色，得到 100 種不同熒光編碼的微球。將熒光編碼且共價結(jié)合了不同捕獲探針的微球懸浮于一個液相體系中，先加入待檢測分子與其反應(yīng)，再加入帶有熒光標記的報告分子，從而形成“微球-捕獲探針-靶標-報告分子”復(fù)合物。

檢測時，該復(fù)合物在鞘液的作用下將逐個通過檢測通道，接受兩束不同波長的激發(fā)光照射并對相應(yīng)的發(fā)射光進行檢測，其中一束激光用于識別微球種類，即判定該種微球是對哪種特定的靶標進行檢測，另一束激光用于檢測微球上報告分子的熒光強度，從而實現(xiàn)對待測物質(zhì)的定性和定量分析 (圖 5) [38] 。

Sherry 等 [39] 利用 Luminex液相芯片技術(shù)實現(xiàn)了對沙門氏菌和其他病原菌的檢測和鑒定。Rajeswari 等 [40] 利用 Luminex 液相芯片技術(shù)和液滴生成技術(shù)成功地實現(xiàn)了對禽流感病毒、傳染性猴氣管炎病毒和空腸彎曲菌的檢測和鑒別。Song 等 [41] 利用 Luminex 液相芯片技術(shù)同時對 11 種不同的突變型進行檢測和分型。

雖然基于Luminex 液相芯片技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)同時對多種不同病原體的檢測和鑒別，但它僅在檢測方面發(fā)揮了其多通量、高效率的特性，其實質(zhì)上并沒有解決多重擴增中眾多引物、探針、模板間相互錯配的問題。因此，未來開發(fā)出微球表面多重擴增以及Luminex 液相芯片檢測一體化的技術(shù)是核酸多重檢測的重要研究方向。

MPCR 技術(shù)的優(yōu)勢在于它的高效性，通過一次擴增反應(yīng)即可實現(xiàn)對多種病原體進行檢測和鑒別，相較多個單重檢測而言成本顯著降低。

MPCR 有著廣泛的應(yīng)用前景，但是仍然存在許多影響 MPCR 擴增與檢測效果的因素 (表 1)，其中擴增效率的一致性是賊大的難題，檢測重數(shù)越多，效率一致性往往越低。針對 MPCR 擴增效率一致性的問題，傳統(tǒng)單管多靶標擴增的方式通過不斷優(yōu)化反應(yīng)體系中緩沖液、酶、引物、探針等的用量，確保每一重的擴增效率保持一致，然而隨著檢測重數(shù)的增加，形成二聚體甚至多聚體的可能性也大幅上升，輕則導(dǎo)致非特異性擴增的出現(xiàn)，靶標擴增效率下降，檢測靈敏度和特異性降低，重則導(dǎo)致非特異性擴增占據(jù)主導(dǎo)，靶標擴增失敗，造成假陽性和/或假陰性，影響檢測正確性。

而基于微流控的 MPCR 則將每一重的擴增分布在各自相對獨立的空間內(nèi)進行，在一定程度上降低了引物二聚體的生成，高效了擴增效率，但是微流控的實現(xiàn)相對較為困難，且當(dāng)模板濃度較低時，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

相比于上述方法，基于固相載體表面擴增的 MPCR 則將不同的引物對分配至不同的固相載體上，使得每個靶標的擴增集中于以特定固相顆粒為載體的表面，從根本上解決 MPCR 引物間相互干擾的問題，此外將固相載體表面擴增與 Luminex 液相芯片檢測技術(shù)相結(jié)合能夠同時對各固相顆粒及顆粒表面的擴增信號進行特異性識別，并且理論上能夠?qū)崿F(xiàn)100 重的核酸擴增與檢測，極大地提高了檢測重數(shù)的同時又能高效各靶標的擴增互不干擾，但是由于需要將引物束縛至固相載體，這在一定程度上限制了引物與模板的碰撞概率并且導(dǎo)致其擴增效率降低，那么如何提高固相載體表面的擴增效率值得深入思考。

針對上述問題，可通過將反應(yīng)體系分隔成微小液滴，或結(jié)合管式對流 PCR技術(shù)使反應(yīng)體系在擴增的過程中循環(huán)流動，將有望提高引物與模板之間碰撞的概率，同時提高固相載體表面的擴增效率，從而開發(fā)出擴增效率高、一致性好、體系穩(wěn)定、檢測重數(shù)高的多重PCR 技術(shù)。