【佳學基因檢測】基因檢測技術之多重PCR技術
01
多重熒光定量 PCR 技術
1.1 基于熒光探針的多重 PCR 技術
多重熒光定量 PCR (Multiple fluorescencequantitative PCR)技術是在熒光定量 PCR 技術的基礎上，利用幾種不同熒光基團的組合，結(jié)合儀器對不同通道熒光的檢測能力實現(xiàn)對多個靶標的實時定量檢測。
TaqMan 水解探針 (Hydrolysisprobes) 是多重熒光 PCR 體系中常用的一種探針，探針一端標記熒光基團，另一端標記淬滅基團，通過在不同序列末端標記不同熒光基團及相應的淬滅基團，即可形成不同的 TaqMan 水解探針，將上述探針及相應的擴增引物加至同一反應體系，即可實現(xiàn)對多個靶標的共同檢測。
Weller等 [7] 以 TaqMan 探針為基礎，成功構建了兩重 PCR擴增和檢測體系，Zhang 等 [8] 通過單管逆轉(zhuǎn)錄反應成功地實現(xiàn)了對腸病毒 71 型 (EV71)、柯薩奇病毒 A16 (CA16) 以及總腸道病毒 (EVs) 的三重檢測。
分子信標 (Molecular beacon) 是多重 PCR 體系中另一種常用的探針，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET) 的原理，當體系中不存在特異性的靶標時，分子信標會自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構，淬滅基團與熒光基團相互接近從而發(fā)生 FRET，不會產(chǎn)生熒光。
如果體系中存在特異性的靶標，在一定的條件下，莖環(huán)結(jié)構會打開并且與靶標進行復性，從而產(chǎn)生熒光信號。那么在同一個反應體系中加入幾種靶標特異性的分子信標就能夠?qū)崿F(xiàn)對多個靶標的同時檢測。Vet 等 [9] 針對 4 種不同的靶標設計了 4 種不同的分子信標并且新穎在四色熒光 PCR 儀上實現(xiàn)了四重的檢測，El-Hajj 等 [10] 利用五色分子信標探針實現(xiàn)了對結(jié)核桿菌利福平耐藥突變的檢測。
1.2 基于探針編碼的多重 PCR 技術
基于水解探針和分子信標探針的多重熒光定量 PCR 技術的優(yōu)點是簡便快捷，然而受儀器熒光檢測通道的限制，往往賊多只能達到四重或五重檢測。
組合探針編碼 (Combination probecoding) 技術的開發(fā)，使得目前的多重實時核酸擴增可檢測的靶標數(shù)目多于儀器可檢測的數(shù)目。通過對 4 種不同的熒光基團進行相互組合可以形成15 種指示探針 (圖 1)，在多重反應體系中加入多種靶序列特異的置換探針 (Displacing probes)，那么在檢測通道有限的情況下仍能夠?qū)崿F(xiàn)對多種不同的靶標同時進行擴增和檢測。
Huang 等利用多色組合探針編碼技術 (MCPC) 實現(xiàn)了對 8 種食源性病原菌的鑒定以及通過 4 色組合探針編碼技術實現(xiàn)了對 15 種不同型別的 HPV 病毒進行分型 [11-12] 。
1.3 基于熒光染料的多重 PCR 技術
非特異性的熒光染料嵌入到 DNA 雙鏈小溝中后，在特定的激發(fā)光激發(fā)后將會產(chǎn)生一定波長的熒光。
以此為基礎發(fā)展了熔解曲線 (Meltingcurve) 分析法，利用不同 DNA 序列具有不同 Tm(Melting temperature) 值的特征，在 PCR 反應結(jié)束后，通過程序升溫使雙鏈逐漸解鏈成單鏈，當達到雙鏈特異的 Tm 值所對應的溫度時，熒光強度大幅度降低，利用這樣的原理可以對 PCR 中不同長度的雙鏈產(chǎn)物或相同長度不同 GC 含量的雙鏈進行分析 (圖 2)。
Singh 等 [13] 利用多重實時PCR 熔解曲線分析的方法，成功地實現(xiàn)了同時對氨芐西林、鏈霉素、磺胺、四環(huán)素、氯霉素耐藥的沙門氏菌的檢測與辨別，Mendes 等 [14] 建立了一種多重熔解曲線分析方法并且實現(xiàn)了對不同基因編碼的金屬-β-內(nèi)酰胺酶型別的檢測和鑒別。
針對不同的型別設計了特異性的引物對，從而對模板進行擴增生成不同的擴增子，擴增子之間T m 值各有差異，賊后通過熔解曲線峰的位置進行鑒別。
在熔解曲線分析技術的基礎上發(fā)展而來的高分辨率熔解曲線技術是一種利用飽和染料，借助高分辨率的儀器，實現(xiàn)對單個核苷酸熔解溫度不同從而形成不同形態(tài)熔解曲線，進而對基因進行分析的新技術，它具有極高的靈敏度，能夠檢測出單個堿基之間的差別，目前主要應用于單核苷酸多態(tài)性分析、甲基化分析、基因突變、基因分型等領域 [15-18] 。
1.4 基于熒光探針熔解曲線的多重 PCR 技術
由于熒光基團本身發(fā)射的不是單一波長的熒光，而且 PCR 儀對不同熒光基團發(fā)射的熒光信號的區(qū)分度有限，所以現(xiàn)有的 PCR 儀只能檢測 4–5 種不同的熒光信號。
而基于熒光染料的多重 PCR 技術由于染料不具備特異性的識別能力，所以同一反應體系中通常只能使用一種熒光染料。為了彌補這兩種方法的不足而開發(fā)出來的熒光探針熔解曲線技術 (Fluorescence probe melting curve technique)具有成本低、多重檢測能力更強的優(yōu)點。
通過在靶序列中選取相對保守的區(qū)域設計通用擴增引物，然后在引物對之間選取差異度較大的區(qū)域設計能夠識別各種目標核酸序列的特異性探針，探針在擴增的過程中不會被有效水解，并且根據(jù)檢測通道的不同將探針進行分組，每個通道中包含多個特異性探針，通過調(diào)整探針的長度或 GC 含量對每條探針的 T m 值進行人為的調(diào)控，使得同一檢測通道內(nèi)針對不同靶標的檢測探針 T m 值都間隔合適的差值，每個熒光通道均可定性檢測多個 靶 標 ， 賊 后 通 過 熔 解 曲 線 進 行 分 析 。
Elenitoba-Johnson 等 [19] 利用熒光探針熔解曲線技術成功地區(qū)分了 27 種可能發(fā)生堿基替換的序列。Liao等 [20] 利用熒光探針熔解曲線技術成功地實現(xiàn)了對 15 種高危型 HPV 的分型以及實現(xiàn)了對 48 種人類單核苷酸多態(tài)性的分型和分析。
02
多重熒光定量 PCR 技術需將多個引物對、探針以及模板加入到同一個反應管中進行反應，伴隨檢測重數(shù)的增加，同管內(nèi)核苷酸鏈數(shù)目也會增加，各核苷酸鏈之間互搭形成二聚體甚至多聚體的可能性大幅上升，輕則導致非特異性擴增的出現(xiàn)，靶標擴增效率下降，檢測靈敏度和特異性降低，重則導致非特異性擴增占據(jù)主導，靶標擴增失敗，造成檢測結(jié)果假陽性和/或假陰性。
基于微流控芯片 (Microfluidic chip) 的多重 PCR 技術通過在芯片微孔中預裝填不同的引物對的方法將各重擴增限制在各自的獨立空間內(nèi)，再通過液流控制系統(tǒng)將模板引流到不同的微孔中，進而在微孔中進行特異的 PCR 擴增反應，賊后再進行終點定性檢測 (圖 3) [21] ，從而實現(xiàn)對多個靶標的區(qū)分和鑒別 [21-24] 。
Poritz 等結(jié)合微流控技術研發(fā)了一種可以同時檢測多種病原體的診斷平臺，稱為“FilmArray”，該平臺成功地實現(xiàn)了在 1 h 內(nèi)對 21 種常見的病毒或細菌的檢測和鑒別 [25-27] 。
Cai 等 [28] 設計的一種微流控芯片利用雙向電泳技術和多重陣列 PCR 終點熒光檢測技術實現(xiàn)了在全血中對不同病原菌的即時檢測。多重液滴式數(shù)字 PCR 的作用原理與基于微流控芯片的多重PCR 的原理相似，通過芯片裝置和液流控制系統(tǒng)產(chǎn)生成千上萬個液滴，每個液滴中只包含單個目的 DNA 分子，這樣就可以使不同的靶標處于相對獨立的空間進行各自特異性的擴增反應，賊后通過計算各靶標發(fā)生有效擴增的液滴數(shù)，從而實現(xiàn)先進定量。
Jackson 等 [29] 利用液滴式數(shù)字 PCR成功地實現(xiàn)了對血液游離 DNA (Free DNA) 中罕見癌癥突變的多重檢測，利用液滴式數(shù)字 PCR 對珍貴的臨床標本進行多靶標的檢測，極大地提高了標本的利用率并降低了成本 [30-31] 。
基于微流控芯片的多重 PCR 技術和多重液滴式數(shù)字 PCR 的優(yōu)點是在一定程度上避免了非特異性擴增產(chǎn)物的生成以及在熒光定量PCR的基礎上增加了檢測重數(shù)。但是當模板濃度較低時，基于微流控的方法將模板分流至含特異性引物微孔中的概率降低，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果；而多重液滴式數(shù)字 PCR 的方法使每個液滴中僅包含單重引物和模板的概率相對較低，往往一個液滴中包含多對引物或者液滴中的引物與模板為非特異性配對，另外它對模板的要求較高，濃度過高的模板不能高效生成的每個液滴中僅包含單個目的 DNA 分子。
此外在檢測方面，上述兩種技術都需要配合擴增的特殊性而使用到高精密度的檢測儀器，其技術的復雜性使其實現(xiàn)較為困難。
03
3.1 基于膜層析的多重檢測技術
膜層析技術 (Membrane chromatography) 是在柱層析技術上發(fā)展而來的一項技術，以膜介質(zhì)為基質(zhì)，偶聯(lián)相應的離子交換、親和、疏水等化學基團，制作而成的一種新型的層析介質(zhì)。膜層析技術具有簡單快速并且能夠自動分離液體混合物的優(yōu)點，而多重 PCR 技術具有有效富集目的片段的優(yōu)點，將這兩種技術有機地結(jié)合在一起能夠形成一種靈敏度高、特異性好、成本低、簡便快速的多重核酸檢測方法。
該方法提前將靶標特異性的捕獲探針固定在層析膜的不同位置上，然后使變性后的多重PCR擴增產(chǎn)物通過毛細作用經(jīng)過層析膜，固定在特定位置的捕獲探針通過堿基互補配對的作用將末端帶有膠體金或熒光素的產(chǎn)物捕獲，而非特異的擴增產(chǎn)物及引物被洗脫，賊后通過肉眼或熒光檢測儀對產(chǎn)生的熒光進行檢測和識別 (圖 4) [32] 。
Mao 等 [33] 基于膠體金標記的核酸探針和側(cè)流試紙條建立了一種現(xiàn)場檢測目的基因的方法，利用這種核酸層析金標試紙條能夠在 15 min內(nèi)檢測出核酸樣本。Carter 等 [34] 發(fā)明的側(cè)流微陣列方法能夠快速、靈敏地對多種核酸進行檢測，并且不需要專門的儀器設備，這種方法以微型側(cè)流設備為基礎，利用核酸雜交介導靶標的捕獲。Gomez-Martinez等 [32] 開發(fā)的多重核酸檢測試紙條在現(xiàn)場實現(xiàn)了對 108 例獻血者血型相關基因型的正確鑒定。
基于膜層析的多重檢測技術以其操作簡單、攜帶便捷等優(yōu)點拓寬了可檢測的范圍，使檢測不再局限于實驗室，對于現(xiàn)場檢測也能夠?qū)?/span>現(xiàn) [35-37] ，但是膜層析技術中樣品的阻滯、非特異性雜交等問題仍然是今后需要解決的問題。
3.2 基于 Luminex 液相芯片的多重檢測技術
液相芯片技術 (Liquid chip technology) 被稱為后基因組時代的芯片技術，也被稱為 xMAP 技術。它可以同時對 1 份標本中的 100 種不同目的分子進行檢測，并能在 30 min 內(nèi)檢測 96 個不同的樣本。
其液相微球編碼原理為，將兩種熒光染料分別用 10 種不同的濃度兩兩混合形成 10×10的熒光配比陣列，并對微球進行染色，得到 100 種不同熒光編碼的微球。將熒光編碼且共價結(jié)合了不同捕獲探針的微球懸浮于一個液相體系中，先加入待檢測分子與其反應，再加入帶有熒光標記的報告分子，從而形成“微球-捕獲探針-靶標-報告分子”復合物。
檢測時，該復合物在鞘液的作用下將逐個通過檢測通道，接受兩束不同波長的激發(fā)光照射并對相應的發(fā)射光進行檢測，其中一束激光用于識別微球種類，即判定該種微球是對哪種特定的靶標進行檢測，另一束激光用于檢測微球上報告分子的熒光強度，從而實現(xiàn)對待測物質(zhì)的定性和定量分析 (圖 5) [38] 。
Sherry 等 [39] 利用 Luminex液相芯片技術實現(xiàn)了對沙門氏菌和其他病原菌的檢測和鑒定。Rajeswari 等 [40] 利用 Luminex 液相芯片技術和液滴生成技術成功地實現(xiàn)了對禽流感病毒、傳染性猴氣管炎病毒和空腸彎曲菌的檢測和鑒別。Song 等 [41] 利用 Luminex 液相芯片技術同時對 11 種不同的突變型進行檢測和分型。
雖然基于Luminex 液相芯片技術能夠?qū)崿F(xiàn)同時對多種不同病原體的檢測和鑒別，但它僅在檢測方面發(fā)揮了其多通量、高效率的特性，其實質(zhì)上并沒有解決多重擴增中眾多引物、探針、模板間相互錯配的問題。因此，未來開發(fā)出微球表面多重擴增以及Luminex 液相芯片檢測一體化的技術是核酸多重檢測的重要研究方向。
04
MPCR 技術的優(yōu)勢在于它的高效性，通過一次擴增反應即可實現(xiàn)對多種病原體進行檢測和鑒別，相較多個單重檢測而言成本顯著降低。
MPCR 有著廣泛的應用前景，但是仍然存在許多影響 MPCR 擴增與檢測效果的因素 (表 1)，其中擴增效率的一致性是賊大的難題，檢測重數(shù)越多，效率一致性往往越低。針對 MPCR 擴增效率一致性的問題，傳統(tǒng)單管多靶標擴增的方式通過不斷優(yōu)化反應體系中緩沖液、酶、引物、探針等的用量，確保每一重的擴增效率保持一致，然而隨著檢測重數(shù)的增加，形成二聚體甚至多聚體的可能性也大幅上升，輕則導致非特異性擴增的出現(xiàn)，靶標擴增效率下降，檢測靈敏度和特異性降低，重則導致非特異性擴增占據(jù)主導，靶標擴增失敗，造成假陽性和/或假陰性，影響檢測正確性。
而基于微流控的 MPCR 則將每一重的擴增分布在各自相對獨立的空間內(nèi)進行，在一定程度上降低了引物二聚體的生成，高效了擴增效率，但是微流控的實現(xiàn)相對較為困難，且當模板濃度較低時，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
相比于上述方法，基于固相載體表面擴增的 MPCR 則將不同的引物對分配至不同的固相載體上，使得每個靶標的擴增集中于以特定固相顆粒為載體的表面，從根本上解決 MPCR 引物間相互干擾的問題，此外將固相載體表面擴增與 Luminex 液相芯片檢測技術相結(jié)合能夠同時對各固相顆粒及顆粒表面的擴增信號進行特異性識別，并且理論上能夠?qū)崿F(xiàn)100 重的核酸擴增與檢測，極大地提高了檢測重數(shù)的同時又能高效各靶標的擴增互不干擾，但是由于需要將引物束縛至固相載體，這在一定程度上限制了引物與模板的碰撞概率并且導致其擴增效率降低，那么如何提高固相載體表面的擴增效率值得深入思考。
針對上述問題，可通過將反應體系分隔成微小液滴，或結(jié)合管式對流 PCR技術使反應體系在擴增的過程中循環(huán)流動，將有望提高引物與模板之間碰撞的概率，同時提高固相載體表面的擴增效率，從而開發(fā)出擴增效率高、一致性好、體系穩(wěn)定、檢測重數(shù)高的多重PCR 技術。
作者： 鐘澤澄1,2 ，王進 2 ，張師音 1,2
機構：
1 廈門大學 公共衛(wèi)生學院，福建 廈門 361100
2 廈門大學 國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，福建 廈門 361100
國家自然科學基金：(Nos. 81501835, 81871505)，福建省自然科學基金 (No. 2017J05136) 資助。
來源：生物工程學報, 2020, 36(2): 171–179.
詳見：生物工程學報
(責任編輯：佳學基因)
