【佳學(xué)基因檢測(cè)】二代測(cè)序(NGS)技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤正確醫(yī)學(xué)診斷的共識(shí)
先進(jìn)版(試行)2016.04.23
腫瘤基因檢測(cè)導(dǎo)讀:
佳學(xué)基因是一個(gè)充分挖掘基因信息在各個(gè)領(lǐng)域的價(jià)值的專業(yè)機(jī)構(gòu)。對(duì)于腫瘤與癌癥來(lái)說(shuō),基因解碼充分利用基因信息指導(dǎo)腫瘤遺傳性分析與明確、腫瘤與癌癥尤其是肺癌的早期診斷與治療?;虻慕獯a信息還被應(yīng)用于腫瘤靶向藥物、個(gè)性化藥物的開(kāi)發(fā)與臨床應(yīng)用。正確的利用基因信息首先需要全面、正確的獲得基因序列。而二代測(cè)序是獲取肝癌、腸癌、乳腺癌患者腫瘤治療信息的先進(jìn)步,通過(guò)基因解碼而不是基因檢測(cè)是建立基因序列與腫瘤癌變、轉(zhuǎn)移和治療關(guān)系的另一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。
中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟(CAGC)
中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)
共識(shí)摘要:
本專家組代表中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)及中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟(CAGC)提供二代測(cè)序(NGS)技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析的相關(guān)指導(dǎo)性建議。專家組由實(shí)驗(yàn)室癌癥遺傳學(xué)家、臨床腫瘤學(xué)家、生物信息學(xué)專家、病理學(xué)家和其他人員組成。建議內(nèi)容在多次討論修改后定為初步共識(shí),主要包括NGS技術(shù)應(yīng)用需求及相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測(cè)內(nèi)容、測(cè)序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告、技術(shù)質(zhì)量認(rèn)證和驗(yàn)證等方面的基本要求與規(guī)范。
背景:
當(dāng)今的腫瘤診治已經(jīng)進(jìn)入個(gè)體化及正確醫(yī)學(xué)時(shí)代,需要充分分析腫瘤從發(fā)生到轉(zhuǎn)歸的整個(gè)疾病進(jìn)程中的驅(qū)動(dòng)基因及其變異,從而選擇有效的靶向治療方案。為此,中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)于2015年9月17日在廈門(mén)市召集了我國(guó)具有代表性的腫瘤學(xué)專家、病理及分子生物學(xué)專家及NGS技術(shù)專家,成立了“中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟”(China Actionable Genome Consortium,CAGC)并啟動(dòng)了正確腫瘤學(xué)研究項(xiàng)目(Precision Oncology Initiative,即CAGC POI),確立了整體項(xiàng)目的組織框架和內(nèi)容框架。CAGC-POI計(jì)劃先進(jìn)階段擬在初步建立二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)臨床應(yīng)用共識(shí)的基礎(chǔ)上,在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性實(shí)體瘤開(kāi)展以NGS技術(shù)為主的驅(qū)動(dòng)基因譜分析。2015年9月27日經(jīng)CSCO理事長(zhǎng)吳一龍教授與中華醫(yī)學(xué)會(huì)會(huì)長(zhǎng)陳竺院士和陳賽娟院士討論后決定,將造血系統(tǒng)腫瘤作為第6個(gè)瘤種納入CAGC POI計(jì)劃,主要是針對(duì)白血病等開(kāi)展較之以前更為廣泛的基因變異譜分析。在上述共識(shí)建立、主要6個(gè)瘤種的變異譜分析驗(yàn)證、優(yōu)化流程的基礎(chǔ)上,將在攜帶有臨床“可靶向作用”驅(qū)動(dòng)基因的患者中,開(kāi)展相應(yīng)的靶向正確診治的實(shí)踐與試驗(yàn)研究。賊終提出適合我國(guó)臨床腫瘤學(xué)實(shí)踐的NGS檢測(cè)技術(shù)、分析內(nèi)容、診治模式的共識(shí)、標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范,克服NGS實(shí)驗(yàn)室與臨床應(yīng)用之間的障礙,提高為腫瘤患者服務(wù)的質(zhì)量和能力。
本階段共識(shí)建立是CAGC POI項(xiàng)目的先進(jìn)階段,將由專家組提出NGS技術(shù)在臨床腫瘤學(xué)應(yīng)用的共識(shí)內(nèi)容。在廣泛收集相關(guān)的建議和意見(jiàn)的基礎(chǔ)上,修訂為指導(dǎo)下一階段技術(shù)檢測(cè)的共識(shí)性文件,供腫瘤學(xué)相關(guān)臨床和檢測(cè)人員等參考。
技術(shù)引言:
當(dāng)今的二代測(cè)序技術(shù)(NGS)是高通量的大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù),可同步獲得腫瘤患者個(gè)體特定樣本中數(shù)十億以上的DNA堿基序列信息。NGS有明顯的通量?jī)?yōu)勢(shì)及發(fā)現(xiàn)未知基因變異的優(yōu)勢(shì),但是在使用中也存在包括檢測(cè)技術(shù)、數(shù)據(jù)管理、分析與報(bào)告、解讀與臨床咨詢等方面的各種挑戰(zhàn)。既往的文獻(xiàn)及國(guó)際相關(guān)共識(shí)已經(jīng)總結(jié)和報(bào)道了NGS在單基因遺傳病、產(chǎn)前診斷等方面的應(yīng)用。而在臨床腫瘤學(xué)的實(shí)踐中,基因檢測(cè)已經(jīng)成為正確診治的前提和核心內(nèi)容之一,但缺乏統(tǒng)一的共識(shí)。腫瘤基因檢測(cè)范圍越來(lái)越廣,已經(jīng)由單基因的分析,逐步走向數(shù)個(gè)至數(shù)百個(gè)基因的多重分析。在未來(lái),腫瘤臨床實(shí)踐中甚至可能需要針對(duì)外顯子組、轉(zhuǎn)錄組、全基因組、表觀遺傳組的信息分析和應(yīng)用。另一方面,由于生物技術(shù)也在不斷進(jìn)步,因此可以預(yù)見(jiàn)的是,在未來(lái)的一段時(shí)間,高通量技術(shù)NGS在臨床診斷和正確治療中的應(yīng)用將會(huì)在檢測(cè)技術(shù)、分析內(nèi)容、解讀等方面會(huì)一直產(chǎn)生變化,也會(huì)帶來(lái)在實(shí)踐應(yīng)用中的各種挑戰(zhàn)。
在現(xiàn)階段,我國(guó)社會(huì)的腫瘤患者數(shù)目龐大,驅(qū)動(dòng)基因診斷和檢測(cè)應(yīng)用需求巨大。但在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)因?yàn)闄z測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)入門(mén)檻低、缺乏臨床公認(rèn)的NGS指導(dǎo)規(guī)范,腫瘤診治中可能存在檢測(cè)質(zhì)量低下、結(jié)果正確性差,檢測(cè)結(jié)果解讀不專業(yè),甚至盲目追求基因檢測(cè)結(jié)果的現(xiàn)象。因此,我國(guó)腫瘤學(xué)界亟需對(duì)當(dāng)前NGS在臨床合理規(guī)范的使用進(jìn)行充分討論,形成共識(shí)予以發(fā)布,以指導(dǎo)我國(guó)臨床腫瘤診療中的規(guī)范應(yīng)用。
本技術(shù)共識(shí)闡述了NGS技術(shù)質(zhì)量需求、臨床腫瘤相關(guān)NGS檢測(cè)內(nèi)容、樣本處理、測(cè)序流程、數(shù)據(jù)管理、信息學(xué)分析、結(jié)果報(bào)告解釋和咨詢等多個(gè)方面的內(nèi)容。本共識(shí)也對(duì)患者知情同意、測(cè)試項(xiàng)目的質(zhì)控、研究與診斷的應(yīng)用差別等內(nèi)容進(jìn)行了說(shuō)明。
1. NGS在臨床腫瘤診斷中的質(zhì)量需求:
NGS技術(shù)正處于不斷的發(fā)展和完善過(guò)程中,需要對(duì)NGS技術(shù)現(xiàn)狀有正確的認(rèn)識(shí)。但過(guò)去十年腫瘤學(xué)界的研究和應(yīng)用顯示:在恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)條件下,NGS確實(shí)能夠高通量地檢測(cè)分析腫瘤中的驅(qū)動(dòng)基因,給部分患者帶來(lái)治療和生存的獲益。
在臨床實(shí)踐中各實(shí)驗(yàn)室可能有不同的NGS技術(shù)平臺(tái)。無(wú)論使用何種平臺(tái),各實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)該按照本共識(shí)中的推薦(聲明)開(kāi)展NGS項(xiàng)目測(cè)試,對(duì)平臺(tái)及相關(guān)分析工具進(jìn)行驗(yàn)證后才應(yīng)用于臨床。
針對(duì)腫瘤的多基因檢測(cè),需要設(shè)計(jì)特定的NGS測(cè)試項(xiàng)目(test)。這些項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)能夠明確回答臨床診療所需的基因狀態(tài)。需要明確指出的是,應(yīng)該避免分析技術(shù)能力尚未得到充分驗(yàn)證的NGS項(xiàng)目在臨床應(yīng)用。
聲明1:臨床腫瘤診斷應(yīng)用的NGS項(xiàng)目應(yīng)符合相應(yīng)的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。未進(jìn)行充分驗(yàn)證的NGS技術(shù)不應(yīng)該在臨床實(shí)踐的驅(qū)動(dòng)基因診斷中應(yīng)用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該明確能夠提供的檢測(cè)項(xiàng)目的內(nèi)容范圍和相關(guān)技術(shù)參數(shù)。
(注:文中的“聲明”(statement)是專家組討論的各個(gè)要點(diǎn),也即專家組形成的共識(shí)或推薦)
NGS用于臨床腫瘤分子診斷能夠帶來(lái)明確的益處(utility)。NGS技術(shù)優(yōu)勢(shì):一次性、特定時(shí)間(約10個(gè)工作日)產(chǎn)生覆蓋基因組特定區(qū)域(從數(shù)個(gè)基因到數(shù)百個(gè)基因以至外顯子組、轉(zhuǎn)錄組或全基因組)的通量數(shù)據(jù),同步獲得多基因、多位點(diǎn)、多種變異形式的分子檢測(cè)結(jié)果。盡管目前NGS的多基因多重分析總成本較高,但相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法而言,單個(gè)基因單個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)費(fèi)用已大大下降。
影響NGS結(jié)果的限制性因素包括:平臺(tái)類(lèi)別、靶區(qū)域富集方法、文庫(kù)構(gòu)建及擴(kuò)增效率、測(cè)序數(shù)據(jù)量、生物信息學(xué)分析流程等。在臨床應(yīng)用之前,對(duì)于特定突變位點(diǎn)的NGS檢測(cè)結(jié)果在低質(zhì)量數(shù)據(jù)條件下應(yīng)采用其他方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的專家、腫瘤患者的主診醫(yī)生與患者應(yīng)該就開(kāi)展腫瘤NGS分析的利弊進(jìn)行充分溝通和知情同意,同時(shí)讓臨床醫(yī)生了解特定NGS測(cè)試項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)意義。
聲明2:NGS檢測(cè)項(xiàng)目(Test)的目的和臨床益處(utility)應(yīng)該明確,如果是用于臨床靶點(diǎn)抑制劑(靶向藥物)的使用決策參考,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該能夠明確一些在臨床可采取特定藥物靶向治療的靶點(diǎn)變異信息。NGS測(cè)試項(xiàng)目如果是用于分子分型、療效預(yù)測(cè)或預(yù)后判斷則需要在發(fā)現(xiàn)集(discovery set)的基礎(chǔ)上建立分析模型,再通過(guò)技術(shù)和驗(yàn)證集(validation set)的驗(yàn)證方可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。
2. NGS在臨床腫瘤應(yīng)用的檢測(cè)內(nèi)容:
在臨床實(shí)踐中,不同的瘤種既可存在瘤種特異性的驅(qū)動(dòng)基因變異,也可能存在共同的基因變異。一個(gè)瘤種存在眾多的分子變異亞型,從而提出“同病異治”或“分型而治”的策略;不同瘤種之間由于存在共同的驅(qū)動(dòng)基因分型,則可以采取“異病同治”的策略。由此可見(jiàn),臨床腫瘤的基于基因或基因組學(xué)的分子分型將逐步超越傳統(tǒng)的病理組織形態(tài)學(xué)分型,成為臨床診治腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
腫瘤的多基因分型對(duì)藥物研發(fā)策略也產(chǎn)生了重大影響。在藥物臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)方面,近年來(lái)出現(xiàn)了兩種基于分子靶點(diǎn)的試驗(yàn)研究設(shè)計(jì)類(lèi)型。一種是“雨傘”設(shè)計(jì)類(lèi)型(Umbrella trial design),即針對(duì)單個(gè)瘤種的基于多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因分型及其靶向治療,另一種則是“籃子”設(shè)計(jì)類(lèi)型(Basket trial design),是針對(duì)多個(gè)瘤種的驅(qū)動(dòng)基因的“同型同治”。
無(wú)論是臨床實(shí)踐還是臨床試驗(yàn),用于基因分型的NGS檢測(cè)項(xiàng)目?jī)?nèi)容需要精細(xì)的設(shè)計(jì)和技術(shù)高效性的驗(yàn)證。NGS項(xiàng)目的檢測(cè)內(nèi)容應(yīng)明確檢測(cè)哪些基因、相應(yīng)基因的受檢區(qū)域、靶點(diǎn)的變異信息等。
聲明3:如果NGS用于臨床分子診斷,應(yīng)該明確至少哪些基因需要納入檢測(cè)名單(panel list)中。這個(gè)必須的“核心基因清單”(core gene list)需要特定腫瘤亞專科相關(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)室多學(xué)科專家共同討論后制定。
“核心基因清單”論證及制定過(guò)程中應(yīng)以“患者的利益”為中心,充分整合臨床腫瘤學(xué)家對(duì)于正確診治的觀點(diǎn),并充分考慮在我國(guó)推廣應(yīng)用的可操作性。以肺癌為例: 目前NCCN及國(guó)內(nèi)肺癌臨床指南或衛(wèi)計(jì)委診療規(guī)范都明確指出EGFR突變、KRAS突變、ALK重排(融合)、ROS1重排(融合)、MET 14號(hào)外顯子可變剪切變異、MET拷貝數(shù)擴(kuò)增、RET重排(融合)、HER2突變或擴(kuò)增、BRAF突變等驅(qū)動(dòng)基因變異是臨床實(shí)踐中的重要必須基因。
從CAGC POI項(xiàng)目的惡性腫瘤的整體角度考慮,檢測(cè)內(nèi)容(gene panel及其基因組區(qū)域)應(yīng)該既包括各瘤種特異性的panel,也應(yīng)備有一個(gè)大而全的gene panel。因?qū)嶓w瘤和血液腫瘤的變異譜方面的差異較大,因此,在大而全的panel中對(duì)實(shí)體瘤和血液腫瘤應(yīng)該分別設(shè)計(jì)。
“可靶向作用”的原理及定義:驅(qū)動(dòng)基因的定義是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等疾病進(jìn)程中關(guān)鍵步驟的基因。“可靶向作用”基因則是指針對(duì)該驅(qū)動(dòng)基因的變異靶點(diǎn)或其上下游關(guān)鍵分子,能夠采用靶向藥物等手段進(jìn)行治療,從而達(dá)到抑制腫瘤進(jìn)展或消退腫瘤的治療效果??砂邢蜃饔没蛞部芍冈摶虻淖儺惪梢杂脕?lái)作為明確的分子亞型診斷或預(yù)后判斷。
聲明4:“可靶向作用基因”的變異可能會(huì)影響臨床決策,醫(yī)生需要根據(jù)基因分型的檢測(cè)結(jié)果來(lái)指導(dǎo)臨床診療方案。“可靶向作用基因”的變異可分為兩大類(lèi),先進(jìn)類(lèi)(Level 1 actionable alterations)包括國(guó)際、國(guó)內(nèi)指南(CSCO、ASCO、NCCN、ESMO等)中明確指定的、藥物標(biāo)簽中說(shuō)明的、與FDA/CFDA批準(zhǔn)的適應(yīng)癥相關(guān)的臨床分型基因變異,或是具有明確的分子診斷或預(yù)后判斷價(jià)值的基因變異。第二類(lèi)(Level 2 actionable alterations)包括正在開(kāi)展的任何期別(I-III期)臨床試驗(yàn)中的藥物相關(guān)靶點(diǎn)、在已經(jīng)或即將開(kāi)展的臨床試驗(yàn)中作為入組條件的變異靶點(diǎn)、在國(guó)內(nèi)外指南中其他腫瘤或疾病適應(yīng)癥的藥物靶點(diǎn)、用于輔助診斷或預(yù)后判斷的靶點(diǎn)等。在NGS檢測(cè)中,對(duì)于臨床意義非常明確的體細(xì)胞突變的少數(shù)基因集分析,可以直接檢測(cè)腫瘤標(biāo)本而無(wú)須設(shè)置白細(xì)胞等對(duì)照樣本。但對(duì)于需要包含上述第二類(lèi)可靶向作用基因的更大的基因集分析,尤其是數(shù)百基因乃至全外顯子組測(cè)序等,建議在腫瘤樣本進(jìn)行NGS檢測(cè)時(shí)設(shè)置患者自身白細(xì)胞樣本對(duì)照分析。
聲明5:隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的不斷深入,新的靶點(diǎn)及藥物會(huì)得到不斷的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)。因此有必要定期或不定期依據(jù)重要的臨床研究進(jìn)展對(duì)檢測(cè)內(nèi)容進(jìn)行討論并發(fā)布更新。
聲明6:檢測(cè)基因數(shù)量越多,診斷信息會(huì)越多。但由于腫瘤信號(hào)通路的冗余性和復(fù)雜性,在基因清單中,除了“核心基因”之外,應(yīng)該對(duì)其他增加的每個(gè)基因進(jìn)行明確定義注釋,說(shuō)明其基因型與潛在可靶向作用位點(diǎn)或通路的關(guān)系。在實(shí)際的NGS測(cè)試項(xiàng)目應(yīng)用中,檢測(cè)基因數(shù)量的增加不應(yīng)以核心基因的檢測(cè)質(zhì)量受損為代價(jià)。
技術(shù)參數(shù)驗(yàn)證對(duì)高效檢測(cè)結(jié)果的正確性很重要。所有NGS計(jì)量參數(shù)都應(yīng)該明確說(shuō)明。在檢測(cè)中應(yīng)該記錄批次或分析樣本特異性的特征。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該利用結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)高效平臺(tái)、各分析項(xiàng)目、樣本處理等方面的質(zhì)量分析。在檢測(cè)分析流程中,每個(gè)樣本都應(yīng)該做好少有性標(biāo)識(shí)。在平臺(tái)穩(wěn)定性驗(yàn)證中,應(yīng)該使得所有儀器和試劑都符合標(biāo)準(zhǔn)要求,提供特定驅(qū)動(dòng)基因的正確性和正確性。
技術(shù)驗(yàn)證過(guò)程中應(yīng)該記錄在案的相關(guān)內(nèi)容或參數(shù)包括以下幾方面。1.樣本相關(guān)的患者信息保護(hù)原則、少有性標(biāo)識(shí)、接收、存儲(chǔ)、處理各步驟內(nèi)容及時(shí)間;2. 實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中DNA/RNA處理每一步驟所用試劑名稱、生產(chǎn)廠家、批號(hào),記錄每一步操作后的質(zhì)量指標(biāo)(如RIN等);3.?dāng)?shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)庫(kù)管理相關(guān)的軟件(包括版本號(hào),分析時(shí)所用各項(xiàng)參數(shù))、數(shù)據(jù)的相關(guān)參數(shù)(數(shù)據(jù)量大小,QC等)、數(shù)據(jù)庫(kù)的安全性和備份情況等。
聲明7: NGS項(xiàng)目的檢測(cè)流程和生物信息學(xué)分析需要針對(duì)特定平臺(tái)和分析項(xiàng)目進(jìn)行充分優(yōu)化。流程驗(yàn)證中應(yīng)提供分析敏感性和特異性的參數(shù)。因?yàn)榉治龇椒ǖ牟町?,針?duì)SNV、INDEL、重排(融合)、CNV等不同的變異應(yīng)該分別測(cè)試技術(shù)的敏感度和特異度。受樣本取材或探針設(shè)計(jì)等因素影響或限制,NGS在某些變異類(lèi)型如拷貝數(shù)擴(kuò)增的檢測(cè)方面有時(shí)存在一定的局限性。對(duì)于NGS方法正確性可能有影響的情況,應(yīng)考慮采用高效的單基因方法對(duì)檢出變異進(jìn)行驗(yàn)證。
3. NGS應(yīng)用中的樣本處理:
NGS檢測(cè)需文庫(kù)構(gòu)建,該步驟原始材料為DNA或來(lái)自RNA的cDNA。適合臨床NGS分析的樣本類(lèi)型優(yōu)先選擇新鮮組織標(biāo)本,也可選用甲醛固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,F(xiàn)FPE)樣本、腫瘤細(xì)胞學(xué)標(biāo)本及血漿(游離DNA/RNA)等。
NGS可用于疾病初診時(shí)的分子靶點(diǎn)分析,也可用于治療中疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的監(jiān)測(cè)及耐藥分子機(jī)制的診斷。因而在疾病的全程管理中可合理地考慮在診療的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)收集臨床標(biāo)本進(jìn)行NGS分析。決定是否采用NGS在多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的檢測(cè)分析應(yīng)做好多學(xué)科討論和充分的知情同意。
各類(lèi)樣本采集:(1)對(duì)于手術(shù)和活檢的新鮮組織:理想的保存方法是迅速置于液氮中,可保存于液氮罐或-80℃冰箱,該過(guò)程應(yīng)在手術(shù)離體后30分鐘內(nèi)完成,以防止RNA等核酸降解;或采用保存在樣本保護(hù)劑中,盡早轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存。可采用冷凍切片染色評(píng)估樣本中的腫瘤細(xì)胞含量。(2)甲醛固定石蠟包埋組織(formalin-fixed paraffin-embedded,F(xiàn)FPE):按病理操作規(guī)范進(jìn)行取材。手術(shù)或活檢離體的組織應(yīng)在30分鐘內(nèi)浸入10%中性福爾馬林溶液中進(jìn)行固定,避免使用酸性及含有重金屬離子的固定液。大標(biāo)本應(yīng)切開(kāi)后充分固定至6-48小時(shí),不超過(guò)72小時(shí)。小活檢標(biāo)本可固定6-12小時(shí)。開(kāi)展NGS檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行HE染色評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量。(3)細(xì)胞學(xué)樣本:胸腹水中的腫瘤細(xì)胞用于基因檢測(cè)時(shí),必須確認(rèn)是否有腫瘤細(xì)胞存在。細(xì)胞病理檢查之后,符合質(zhì)量要求的標(biāo)本可直接抽提核酸,也可以制備成FFPE細(xì)胞學(xué)蠟塊進(jìn)行后續(xù)分析。(4)血漿或血液樣本:循環(huán)游離/腫瘤DNA(circulating free/tumor DNA,cf/ctDNA)是存在于血漿中的游離DNA,腫瘤來(lái)源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊。采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測(cè),取樣時(shí)應(yīng)使用一次性的EDTA抗凝真空采血管,采集8~10ml全血,冷藏運(yùn)輸,2小時(shí)內(nèi)分離血漿,提取游離DNA,保存到-80℃冰箱中,并避免反復(fù)凍融。如外周血需要長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸,建議用商品化的游離DNA樣本專用保存管,在常溫條件下,cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存3-7天。由于血細(xì)胞基因組DNA(gDNA)的潛在大量釋放會(huì)極大地稀釋血漿游離腫瘤DNA的濃度,經(jīng)肉眼觀察確認(rèn)為溶血的樣本不適用于對(duì)游離腫瘤DNA的NGS檢測(cè)。當(dāng)懷疑血漿游離DNA受到血細(xì)胞基因組DNA污染時(shí),可考慮采用核酸片段大小分布分析來(lái)判斷污染是否存在,而從判斷樣本是否適用于NGS檢測(cè)。
采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)對(duì)后續(xù)結(jié)果的解讀有重要意義,臨床樣本的采樣過(guò)程、分析前的運(yùn)輸和處理流程以及病理的評(píng)估結(jié)果等均應(yīng)做相應(yīng)的記錄。質(zhì)量評(píng)價(jià)的內(nèi)容應(yīng)包括腫瘤細(xì)胞含量比例、腫瘤細(xì)胞的數(shù)量,是否按照要求進(jìn)行處理與運(yùn)輸?shù)?。評(píng)價(jià)方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和血漿樣本核酸濃度分析等。對(duì)于腫瘤細(xì)胞分布集中的區(qū)域應(yīng)進(jìn)行標(biāo)注,必要時(shí)進(jìn)行顯微切割后再提取核酸。
樣本采集和處理中的防污染:樣本采集賊好采用一次性材料;制備不同患者病理切片樣本時(shí),需更換新刀片,并清除操作器皿或切片機(jī)上先前樣本的殘留。
樣本運(yùn)送和保存:實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立詳細(xì)的樣本運(yùn)送標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP),對(duì)臨床醫(yī)生提供樣本采集手冊(cè),要求物流人員填寫(xiě)相關(guān)運(yùn)送記錄表,確保運(yùn)送過(guò)程中各類(lèi)樣本的安全性和過(guò)程的可控性。石蠟材料可常溫運(yùn)輸,血漿樣本干冰條件下運(yùn)輸,核酸樣本需要在4攝氏度或冷凍條件下運(yùn)輸。
聲明8:為了提高NGS檢測(cè)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的正確性,應(yīng)該提供高質(zhì)量的臨床生物材料樣本。不同類(lèi)型生物材料的收集及處理均應(yīng)有明確的標(biāo)準(zhǔn)操作流程(SOP)指導(dǎo)。
聲明9:樣本登記過(guò)程中每個(gè)標(biāo)本應(yīng)該在NGS分析中有少有性標(biāo)識(shí)。包括來(lái)自同一患者的不同組織病灶、不同組織切片、不同核酸樣本等均有少有性的標(biāo)識(shí)。
聲明10:樣本評(píng)估和用量:除了血漿或血液來(lái)源的DNA/RNA,凡是涉及形態(tài)學(xué)的標(biāo)本,應(yīng)該在顯微鏡下評(píng)估腫瘤細(xì)胞的含量,充分記錄各類(lèi)形態(tài)學(xué)惡性細(xì)胞的含量比例。評(píng)估記錄還應(yīng)包括標(biāo)本收集和處理方法。腫瘤細(xì)胞比例低的標(biāo)本必要時(shí)應(yīng)采用包括顯微微切割在內(nèi)的有效富集腫瘤細(xì)胞的方法,提高腫瘤細(xì)胞比例。一般情況下,適合于NGS檢測(cè)的組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議應(yīng)達(dá)到20%以上。如果腫瘤細(xì)胞占比較低,患者知情后依然愿意進(jìn)行NGS檢測(cè),應(yīng)該盡量采用顯微切割技術(shù)富集腫瘤細(xì)胞,或增加NGS測(cè)序 數(shù)據(jù)量以提高測(cè)序覆蓋深度(depth),并在報(bào)告中提示樣本局限性。組織樣本抽提獲得的DNA量應(yīng)達(dá)50ng以上用于NGS檢測(cè)。血液樣本建議采血至少8ml,分離血漿游離DNA用于NGS檢測(cè)。
聲明11:核酸樣本抽提及QC/QA。組織DNA與血漿游離DNA等核酸樣本均應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)前的質(zhì)量控制分析,包括核酸的濃度和純度分析。組織DNA樣本應(yīng)該進(jìn)行核酸完整性分析,以判斷DNA質(zhì)量。血漿游離DNA樣本應(yīng)該進(jìn)行片段長(zhǎng)度分布分析,以判斷是否存在血細(xì)胞基因組DNA的污染。在文庫(kù)構(gòu)建后應(yīng)該對(duì)核酸樣本進(jìn)行濃度測(cè)定與文庫(kù)片段分布等質(zhì)量控制。
聲明12:為了便于后續(xù)采用其他技術(shù)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,在樣本留取時(shí),應(yīng)適當(dāng)考慮增加生物材料的留取量。在石蠟標(biāo)本的切片過(guò)程中可考慮適當(dāng)同步預(yù)留幾張切片用于后續(xù)IHC、FISH、PCR測(cè)序等方法驗(yàn)證。
4. NGS測(cè)序 技術(shù)及流程:
NGS又稱大規(guī)模平行測(cè)序(MPS),是一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測(cè)序技術(shù),是繼Sanger測(cè)序之后的革命性進(jìn)步。NGS能夠同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序,實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測(cè)序的目標(biāo)。高通量測(cè)序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)?;蚪M序列的測(cè)序,還可用于基因表達(dá)分析、非編碼小分子RNA的鑒定、DNA甲基化等相關(guān)分析。
目前在臨床腫瘤實(shí)踐中,NGS主要應(yīng)用于驅(qū)動(dòng)基因測(cè)序,是腫瘤正確診療的重要環(huán)節(jié)。NGS的優(yōu)勢(shì)包括:一次性通量測(cè)序、能夠分析變異豐度、相對(duì)成本低。存在的不足之處包括:滿足臨床應(yīng)用的生物信息分析軟件尚處于發(fā)展之中、基因型的判讀依賴于生物信息的正確分析、測(cè)序深度在必要時(shí)因整體成本高而難以達(dá)到等。
就NGS技術(shù)本身而言,在臨床腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用應(yīng)充分關(guān)注試劑管理、樣本的QA/QC、檢測(cè)環(huán)境、人員資質(zhì)和熟練程度、NGS技術(shù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)(包括文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序流程、質(zhì)控等)等環(huán)節(jié),以標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范加以約束,以高效特定腫瘤NGS測(cè)試(test)能夠穩(wěn)定正確地發(fā)揮作用。
測(cè)序技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)該做好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范記錄,賊好有結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行管理,包括平臺(tái)環(huán)境參數(shù)、試劑使用和性能、樣本追蹤、質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)等管理。通過(guò)日常和定期分析質(zhì)控高效檢測(cè)的正確性。
為滿足臨床需求,實(shí)驗(yàn)室需對(duì)各個(gè)質(zhì)量控制步驟出現(xiàn)異常、失敗的樣本規(guī)定合理的備選方案。比如采用其他分子診斷平臺(tái)檢測(cè)一部分重要位點(diǎn),或?qū)﹃?yáng)性位點(diǎn)采用其他平臺(tái)確認(rèn)性檢測(cè),或者重復(fù)高通量測(cè)序流程等,有條件的檢測(cè)單位也可以重新選取標(biāo)本。
聲明13:NGS檢測(cè)需要符合嚴(yán)格的檢測(cè)環(huán)境要求,各類(lèi)樣本的儲(chǔ)存、核酸抽提處理及NGS分析應(yīng)在通過(guò)審核驗(yàn)收的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。
聲明14:NGS試劑管理和質(zhì)控:NGS試劑應(yīng)該獨(dú)立存放,防止交叉污染。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室自配試劑或探針及采購(gòu)試劑,均需做好每批試劑的性能評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)合格后才可用于臨床樣本分析。
聲明15:每個(gè)特定的NGS測(cè)試項(xiàng)目(test)都需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的技術(shù)驗(yàn)證合格后才可以用于臨床腫瘤檢測(cè)。診斷測(cè)試項(xiàng)目必須在正確性、分析敏感度、特異度、正確性等方面進(jìn)行充分評(píng)價(jià)。如果檢測(cè)項(xiàng)目中的試劑或步驟有任何主要變更,則質(zhì)量參數(shù)需要重新評(píng)價(jià)。在針對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目更新或升級(jí)的重新評(píng)價(jià)中,應(yīng)該明確測(cè)試所需要的樣本類(lèi)型及例數(shù)。強(qiáng)烈建議各實(shí)驗(yàn)室參加NGS相關(guān)的室間質(zhì)量評(píng)估項(xiàng)目來(lái)評(píng)測(cè)檢測(cè)能力和質(zhì)量。
聲明16:明確的檢測(cè)流程包括樣本QC/QA、樣本預(yù)處理、接頭連接、預(yù)擴(kuò)增、基因組合(gene panel)靶區(qū)的捕獲、靶區(qū)純化、擴(kuò)增文庫(kù)構(gòu)建、QC定量后上NGS測(cè)序 儀檢測(cè)等步驟。每個(gè)步驟的操作和質(zhì)量控制都應(yīng)建立SOP進(jìn)行指導(dǎo)。如果使用擴(kuò)增子(amplicon)建庫(kù)的方式,同樣需要建立相應(yīng)的SOP進(jìn)行質(zhì)控管理。
聲明17:NGS的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括上述樣本預(yù)處理至文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序、質(zhì)控的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化,也包括原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生和管理、信息學(xué)分析過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化。由此CAGC將在下一階段可行性驗(yàn)證基礎(chǔ)上形成一套NGS技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)文件(SOP)。
聲明18:人員配備和熟練程度應(yīng)滿足實(shí)踐需求。應(yīng)配有專門(mén)的質(zhì)控人員。對(duì)于參與NGS實(shí)驗(yàn)流程操作的技術(shù)人員進(jìn)行充分的培訓(xùn),達(dá)到一定的熟練程度。每個(gè)平臺(tái)應(yīng)有技術(shù)員專職從事實(shí)驗(yàn)操作。
聲明19:“核心基因清單”與相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品將被用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)控比較。根據(jù)檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因的突變結(jié)果描述、目的區(qū)域的覆蓋度等建立評(píng)分體系。這個(gè)評(píng)分體系將用于對(duì)實(shí)驗(yàn)室間NGS檢測(cè)能力的分析與認(rèn)證。
5. NGS數(shù)據(jù)的產(chǎn)生、管理、信息學(xué)分析:
由于NGS數(shù)據(jù)龐大,數(shù)據(jù)管理、儲(chǔ)存和分析需要強(qiáng)大的計(jì)算平臺(tái)支持。數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢查、信息學(xué)分析、輸出格式、儲(chǔ)存等方面都應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)SOP支持。賊好有結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)管理原始數(shù)據(jù)、質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)以及分析結(jié)果數(shù)據(jù)等。
聲明20:數(shù)據(jù)分析工具(軟件)的能力驗(yàn)證。需要采用適量例數(shù)的原始數(shù)據(jù)針對(duì)NGS數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行驗(yàn)證分析。通過(guò)采用攜帶不同種類(lèi)與豐度變異的數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證整個(gè)分析流程的正確性與穩(wěn)定性。特別是在增加檢測(cè)基因的內(nèi)容時(shí)需要驗(yàn)證分析工具的高效性。分析工具的能力驗(yàn)證應(yīng)有詳細(xì)的內(nèi)部軟件驗(yàn)證記錄。CSCO CAGC項(xiàng)目也將組織開(kāi)展軟件分析能力驗(yàn)證。
聲明21:數(shù)據(jù)產(chǎn)生和管理儲(chǔ)存。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必須采用結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)注釋SNP、Indel、重排(融合)、CNV等各類(lèi)變異信息。
聲明22:數(shù)據(jù)儲(chǔ)存應(yīng)該采用通用的FASTQ、BAM、VCF格式,便于數(shù)據(jù)交換及實(shí)驗(yàn)室間評(píng)價(jià)。同時(shí)保存完整的log日志文件,便于區(qū)別流程版本信息、追溯異常結(jié)果來(lái)源及分析原始數(shù)據(jù)向診斷報(bào)告生成的可重復(fù)性。診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該長(zhǎng)期保存相關(guān)的數(shù)據(jù)集(至少15年)。
聲明23:NGS原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢查,應(yīng)有嚴(yán)格的操作規(guī)程指導(dǎo)。所有參數(shù)需與檢測(cè)性能評(píng)價(jià)過(guò)程中的參數(shù)進(jìn)行比較,設(shè)置并執(zhí)行接受與拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。參見(jiàn)表1。
表1. 基于原始序列(FASTQ)和比對(duì)后序列(BAM)質(zhì)量的計(jì)量參數(shù)
參數(shù) | 描述 |
每循環(huán)的中位堿基質(zhì)量 | 在序列片段末端堿基測(cè)序質(zhì)量會(huì)急劇降低。序列質(zhì)量評(píng)分不能低于20(Phred序列質(zhì)量評(píng)分) |
重復(fù)片段占比 | 重復(fù)測(cè)序片段占比是反映文庫(kù)構(gòu)建的復(fù)雜度的指標(biāo) |
去除接頭序列堿基的占比(如果適用) | 在去除接頭序列時(shí),去除的堿基所占比例是反映序列質(zhì)量的指標(biāo) |
比對(duì)成功的片段占比 | 能夠比對(duì)到參考基因組序列上面的測(cè)序片段的比例 |
目標(biāo)區(qū)域片段占比 | 能夠比對(duì)到富集目標(biāo)基因組區(qū)域的片段在所有測(cè)序片段中所占的比例 |
目標(biāo)區(qū)域的平均測(cè)序深度 | 符合臨床需求的目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域中所有位點(diǎn)的平均測(cè)序深度 |
目標(biāo)區(qū)域測(cè)序深度的分布 | 在符合臨床需求的目標(biāo)區(qū)域所覆蓋的所有位點(diǎn)中,繪制測(cè)序深度分布圖或不同測(cè)序深度覆蓋位點(diǎn)的占比表格。 |
變異檢測(cè)質(zhì)量的相關(guān)計(jì)量參數(shù)
參數(shù) | 描述 |
總變異數(shù)量 | 符合臨床需求的目標(biāo)區(qū)域中檢出的的總變異數(shù)目應(yīng)當(dāng)與同類(lèi)病人群體且采用相同捕獲區(qū)域以及處理方法相同的樣本結(jié)果相類(lèi)似。 |
已知的多態(tài)性比例 | 每個(gè)樣本中大部分被檢測(cè)到的變異(> 90%)都應(yīng)該是已知的基因多態(tài)性。 |
插入或缺失(Indel)變異比例 | 插入或缺失變異占總變異數(shù)的比例 |
純合型變異的比例 | 純合型變異占總變異數(shù)的比例 |
無(wú)義突變比例 | 無(wú)義突變占總變異數(shù)的比例 |
轉(zhuǎn)換/顛換比值 | 轉(zhuǎn)換/顛換突變之間的比值 |
聲明24:數(shù)據(jù)分析的流程包括初步分析、接頭序列去除、引物序列去除、低質(zhì)量序列去除、參照基因組序列比對(duì)(mapping)、去重、Indel重復(fù)比對(duì)、堿基質(zhì)量得分校正、突變識(shí)別(variant calling)、注釋、過(guò)濾后輸出等流程(見(jiàn)下表2)。CAGC POI項(xiàng)目需要在各個(gè)瘤種中的每一步都應(yīng)做到同質(zhì)性。
表2. 臨床腫瘤NGS測(cè)序 的簡(jiǎn)單流程步驟描述
處理步驟 | 過(guò)程描述 | 工具及數(shù)據(jù)庫(kù) | 輸出 |
堿基識(shí)別和去重復(fù) | 堿基識(shí)別和去重復(fù),又稱為初級(jí)分析 | 測(cè)序平臺(tái)的配置軟件 | FASTQ文件 |
去除引物序列 | 擴(kuò)增子測(cè)序的引物序列必須從測(cè)序片段中去除 | CutAdapt,BWA(比對(duì)和剪輯序列的軟件) | FASTQ文件或BAM文件(由如BWA的比對(duì)軟件生成) |
去除接頭序列(可選項(xiàng)) | 將測(cè)序接頭序列從測(cè)序片段末端去除。如果不能去除,測(cè)序接頭可能會(huì)干擾序列比對(duì)和變異檢測(cè),從而導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性突變。 | CutAdapt,BWA(比對(duì)和剪輯序列的軟件),Trimmomatic,SeqPrep | FASTQ文件或BAM文件(由如BWA的比對(duì)軟件生成) |
去除低質(zhì)量堿基(可選項(xiàng)) | 低質(zhì)量的堿基也可能干擾序列比對(duì)和變異檢測(cè),可以將其從測(cè)序片段末端(或前端)去除。 | CutAdapt,BWA(比對(duì)和剪輯序列的軟件),Trimmomatic,SeqPrep | FASTQ文件或BAM文件(由如BWA的比對(duì)軟件生成) |
序列比對(duì) | 在序列片段比對(duì)階段,雙端/單端序列片段都被比對(duì)到參考基因組上,單堿基改變和插入缺失變異都會(huì)在這個(gè)過(guò)程中被識(shí)別出來(lái)。序列比對(duì)通常是針對(duì)整個(gè)參照基因組,即使測(cè)序只是針對(duì)一個(gè)小的基因集合。 | BWA, Novalign, Stampy,SOAP2, LifeScope, Bowtie. | BAM文件 |
去重(可選項(xiàng)) | 鳥(niǎo)槍法測(cè)序結(jié)果中重復(fù)片段較少,這是因?yàn)镈NA是被隨機(jī)打斷的。然而,在擴(kuò)增子測(cè)序中,PCR擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致重復(fù)測(cè)序,因而重復(fù)序列應(yīng)該被去除。 | Picard MarkDuplicates | BAM文件 |
插入缺失(Indel)再比對(duì)(可選項(xiàng)) | 測(cè)序樣本中Indel周?chē)赡艹霈F(xiàn)一些單堿基的測(cè)序錯(cuò)配誤差,特別是容易發(fā)生在測(cè)序片段的開(kāi)頭或末端,因而造成假陽(yáng)性突變判讀。局部重新比對(duì)法可以確定這些位置并且通過(guò)局部重新比對(duì)來(lái)盡量減少這種錯(cuò)誤,增加正確性。 | GATK RealignerTargetCreator & IndelRealigner 和 SRMA | BAM文件 |
校正質(zhì)量評(píng)分(可選項(xiàng)) | 與參考基因組比對(duì)之后 ,片段中的堿基質(zhì)量評(píng)分可以被重校準(zhǔn)以減少錯(cuò)誤的突變判讀。 | GATK BaseRecalibrator & PrintReads, ReQON | BAM文件 |
變異判讀 | 變異判讀是指依據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組之間的差異來(lái)檢出和描述變異(包括單堿基改變和短的堿基序列插入或缺失) | GATK UnifiedGenotyper, GATK HaplotypeCaller, samtools 和 Platypus | VCF文件 |
注釋 | 對(duì)變異的解讀依托于詳細(xì)的注釋。賊基礎(chǔ)的注釋有基因名,區(qū)域(外顯子、拼接區(qū)域、內(nèi)含子、基因間區(qū)域等)和譯碼改變信息。此外,可利用已知基因多態(tài)性的等位基因頻率、致病性及其他數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行注釋。 | Annovar, SNPeff, Cartagenia Bench Lab NGS, dbSNP, 1000 Genomes, ESP 6500, SIFT, PhyloP, MutationTaster, COSMIC, OMIM, ClinVar, HGMD | CSV, TSV, TXT, Excel文件或數(shù)據(jù)庫(kù) |
篩選 | 從大量的變異列表里尋找與鑒別疾病相關(guān)變異須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選。典型的變異篩選要排除低質(zhì)量變異、非編碼區(qū)(如內(nèi)含子或基因間區(qū)域的變異)、同義SNPs、以及已知的健康人群中低頻的基因多態(tài)性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該建立內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù),分析在自己的平臺(tái)上經(jīng)常出現(xiàn)的假陽(yáng)性變異,針對(duì)這些假陽(yáng)性變異進(jìn)行嚴(yán)格的篩選去除。 | Cartagenia Bench Lab NGS, SnpSift | CSV, TSV, TXT, Excel文件或數(shù)據(jù)庫(kù) |
聲明25:體細(xì)胞與胚系來(lái)源的變異應(yīng)該加以區(qū)分。體細(xì)胞突變?cè)谀[瘤診療中的臨床意義較大。特定的胚系突變的生物學(xué)意義需要說(shuō)明,如乳腺癌中BRCA1/2的突變。
聲明26:應(yīng)對(duì)各個(gè)瘤種中與臨床意義相關(guān)的變異重點(diǎn)進(jìn)行關(guān)注分析和說(shuō)明,比如肺癌中的EGFR exons 18-21突變、ALK重排、ROS重排、MET E14拼接變異、HER2插入突變或擴(kuò)增等突變的說(shuō)明。
近年來(lái),關(guān)于腫瘤細(xì)胞分子異質(zhì)性的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn),腫瘤中存在不同分子變異亞型的亞克隆。異質(zhì)性亞克隆的存在會(huì)影響腫瘤疾病的整體進(jìn)化路徑及對(duì)靶向治療的應(yīng)答和耐藥。因此NGS用于腫瘤診斷或耐藥監(jiān)測(cè)時(shí)需要達(dá)到較深的測(cè)序覆蓋度,這樣才能充分解釋腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)化過(guò)程中的異質(zhì)性及其與臨床表型的關(guān)系。
聲明27:CAGC建議,臨床腫瘤組織樣本的NGS檢測(cè)數(shù)據(jù)中測(cè)序“有效深度”應(yīng)該達(dá)到 500X以上;血漿游離DNA標(biāo)本的NGS“有效測(cè)序深度”應(yīng)該達(dá)到1000X以上。
說(shuō)明:(1)有效深度定義為去除PCR重復(fù)reads(duplicates)之后的深度;(2)應(yīng)該在80%以上的目標(biāo)捕獲區(qū)域達(dá)到這個(gè)深度,而非是所有區(qū)域的平均,否則在區(qū)域間覆蓋波動(dòng)較大的情況下會(huì)有大量區(qū)域出現(xiàn)覆蓋不夠的情況。
聲明28:CAGC項(xiàng)目數(shù)據(jù)的管理應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)流程和各類(lèi)數(shù)據(jù)管理方面實(shí)現(xiàn)同一化。在后續(xù)將開(kāi)展每個(gè)瘤種約100例的分析,從而對(duì)本次共識(shí)的可操作性進(jìn)行驗(yàn)證。
6. NGS結(jié)果報(bào)告與咨詢:
NGS是多步驟的復(fù)雜的檢測(cè)和分析方法,產(chǎn)生報(bào)告的內(nèi)容較多。對(duì)臨床而言需要遵循首頁(yè)簡(jiǎn)明、結(jié)果明確、解釋清楚、信息充分的原則。
在開(kāi)展NGS臨床測(cè)試之前,應(yīng)明確定義所檢測(cè)的驅(qū)動(dòng)基因在基因組上的哪些靶區(qū)域范圍(target range),并在報(bào)告中告知臨床醫(yī)生。
NGS報(bào)告結(jié)果應(yīng)該簡(jiǎn)明清晰。具有臨床靶向意義的檢測(cè)結(jié)果及其參數(shù)應(yīng)該優(yōu)先報(bào)告,如EGFR L858R突變,突變位點(diǎn)占比(mutant allele fraction, MAF)=15.6%。在報(bào)告首頁(yè)中應(yīng)包括患者ID、臨床診斷、測(cè)試的簡(jiǎn)單描述、技術(shù)類(lèi)型等信息。根據(jù)情況,報(bào)告可以適當(dāng)添加附件成多頁(yè)。各個(gè)瘤種的“核心基因”檢測(cè)結(jié)果必須明確報(bào)告,其他基因根據(jù)結(jié)果概括性報(bào)告,對(duì)于特別的突變(如在其他腫瘤中發(fā)現(xiàn)是核心變異)可特別進(jìn)行報(bào)告。
對(duì)于生物學(xué)意義未明或未明確分類(lèi)的變異(Unclassified variants,UVs)結(jié)果應(yīng)該收集整理,并提倡在同行間交換,為賊終確認(rèn)這些UVs是功能性或非功能性的提供幫助。
對(duì)于不同瘤種的NGS數(shù)據(jù),可以整合到同一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,這將有助于不同瘤種間變異信息在臨床應(yīng)用中的借鑒。
聲明29:報(bào)告格式和內(nèi)容需要標(biāo)準(zhǔn)化,應(yīng)能夠適應(yīng)短期未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)(靶點(diǎn)知識(shí)和檢測(cè)內(nèi)容的變更)。請(qǐng)見(jiàn)附件一,臨床腫瘤NGS的報(bào)告格式。報(bào)告內(nèi)容應(yīng)該包括患者ID、疾病信息、樣本信息、分析技術(shù)信息、主要結(jié)果、結(jié)果解釋、操作員和實(shí)驗(yàn)室專家(腫瘤分子生物學(xué)或遺傳學(xué)專家)簽字等。
聲明30:報(bào)告范圍(reportable range)應(yīng)該根據(jù)測(cè)試目的以及測(cè)序能夠達(dá)到質(zhì)量要求的覆蓋范圍來(lái)決定。例如在對(duì)外顯子組序列的檢測(cè)中,在肺癌中不一定報(bào)告所有覆蓋區(qū)域中檢出的變異。但需知情臨床醫(yī)生本次報(bào)告不能排除潛在的“非關(guān)注區(qū)域”的變異。
聲明31:NGS報(bào)告應(yīng)既簡(jiǎn)明扼要、明確易懂,又能充分提供必要信息以供醫(yī)生參考用于當(dāng)前臨床的靶向治療方案決策。
聲明32:結(jié)果解釋需客觀中肯,平實(shí)地描述腫瘤突變的結(jié)果。在疾病相關(guān)性方面只描述既往研究中的療效或預(yù)測(cè)相關(guān)性,不應(yīng)出現(xiàn)建議使用何種治療手段或策略的文字。檢測(cè)結(jié)果在臨床決策中的應(yīng)用應(yīng)由臨床醫(yī)生或多學(xué)科專家討論決定。
聲明33:遺傳咨詢需多學(xué)科支持,臨床決策的制定過(guò)程中需要與實(shí)驗(yàn)室癌癥遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、病理學(xué)等多方面專家進(jìn)行必要的信息溝通。
7. 知情同意。
聲明34:NGS檢測(cè)項(xiàng)目開(kāi)展前應(yīng)該向患者做好知情同意或相關(guān)遺傳咨詢(genetic counseling),解釋疾病條件下進(jìn)行特定NGS檢測(cè)分析的目的和利弊。同時(shí)需要向醫(yī)生及患者告知測(cè)試的局限性,包括驅(qū)動(dòng)基因的信息、報(bào)告范圍、技術(shù)分析的敏感度和特異度等。
知情同意書(shū)的內(nèi)容至少必須包含:
(1)進(jìn)行基因檢測(cè)的依據(jù),其中包括醫(yī)學(xué)指南、專家共識(shí)、治療規(guī)范等內(nèi)容,需使患者知悉檢測(cè)的意義和目的;
(2)基因檢測(cè)過(guò)程中可能有的局限性,如提取樣本量是否足夠,樣本質(zhì)量控制指標(biāo)是否適合基因檢測(cè),如發(fā)生類(lèi)似情況,需要及時(shí)向患者以及家屬說(shuō)明情況,再?zèng)Q定下一步;
(3)進(jìn)行基因測(cè)序可輔助個(gè)體化治療,但是賊終決定須由臨床醫(yī)生決定;
(4)基因檢測(cè)結(jié)果要只針對(duì)該次送檢樣本;
(5)檢測(cè)機(jī)構(gòu)必須對(duì)患者的身份信息、病例信息以及檢測(cè)結(jié)果等保密。患者進(jìn)行基因檢測(cè)之前需知悉以上事項(xiàng),并簽署知情同意書(shū)。
8. NGS用于研究與診斷的區(qū)別:
由于技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用單位的能力提升,NGS用于研究或是診斷的界限已經(jīng)模糊,但在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)該明確特定的NGS測(cè)試是用于研究還是診斷。診斷目的的NGS檢測(cè)是為了回答臨床患者腫瘤中是否具有特定的基因變異狀態(tài)(可作用靶點(diǎn)的變異)。診斷檢測(cè)通常是在一個(gè)得到認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。而研究目的的NGS檢測(cè)是研究假設(shè)驅(qū)動(dòng)的檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果對(duì)入組患者通常只具有有限或不確定的臨床意義。全外顯子或基因組測(cè)序的診斷結(jié)果由于數(shù)據(jù)量大,除了滿足特定的基因診斷,其他數(shù)據(jù)也可能產(chǎn)生新的研究假設(shè)。
聲明35:研究項(xiàng)目獲得有臨床意義的分子變異結(jié)果需要進(jìn)一步在診斷條件下確證后才可以納入患者的醫(yī)療記錄。
聲明36:研究和診斷的檢測(cè)結(jié)果都應(yīng)該建立數(shù)據(jù)庫(kù)管理,以便于與本地、區(qū)域性的、國(guó)家或國(guó)際的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,這有助于對(duì)變異進(jìn)行臨床分類(lèi)。
9. CAGC POI項(xiàng)目NGS測(cè)試(Test)的監(jiān)督管理
對(duì)于應(yīng)用于CAGC POI臨床實(shí)踐、試驗(yàn)或研究的NGS檢測(cè)項(xiàng)目,為高效質(zhì)量的同一性和延續(xù)性,將由CSCO CAGC專家組對(duì)所測(cè)試的NGS項(xiàng)目進(jìn)行監(jiān)督管理,管理方式包括現(xiàn)場(chǎng)考察、管理文件和流程監(jiān)督、測(cè)試樣本的室間評(píng)比等。目的是使得參與CAGC POI項(xiàng)目的各個(gè)NGS實(shí)驗(yàn)室能夠達(dá)到統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
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附件:
[1] NGS檢測(cè)報(bào)告格式化模板
[2] 基因名稱及基因突變的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)(NGS技術(shù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)、NGS數(shù)據(jù)生物信息學(xué)所涉及的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ)。中英文對(duì)照)
[3] 臨床腫瘤NGS診斷項(xiàng)目(test)的技術(shù)要求和質(zhì)控
[4] CAGC 2015年度啟動(dòng)會(huì)議紀(jì)要
(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)