【佳學(xué)基因檢測】二代測序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤正確醫(yī)學(xué)診斷的共識

【佳學(xué)基因檢測】二代測序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤正確醫(yī)學(xué)診斷的共識

先進(jìn)版（試行）2016.04.23
 

腫瘤基因檢測導(dǎo)讀：

佳學(xué)基因是一個充分挖掘基因信息在各個領(lǐng)域的價值的專業(yè)機(jī)構(gòu)。對于腫瘤與癌癥來說，基因解碼充分利用基因信息指導(dǎo)腫瘤遺傳性分析與明確、腫瘤與癌癥尤其是肺癌的早期診斷與治療?；虻慕獯a信息還被應(yīng)用于腫瘤靶向藥物、個性化藥物的開發(fā)與臨床應(yīng)用。正確的利用基因信息首先需要全面、正確的獲得基因序列。而二代測序是獲取肝癌、腸癌、乳腺癌患者腫瘤治療信息的先進(jìn)步，通過基因解碼而不是基因檢測是建立基因序列與腫瘤癌變、轉(zhuǎn)移和治療關(guān)系的另一個至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

 

中國腫瘤驅(qū)動基因分析聯(lián)盟（CAGC）
中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）

共識摘要：

本專家組代表中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）及中國腫瘤驅(qū)動基因分析聯(lián)盟（CAGC）提供二代測序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤驅(qū)動基因分析的相關(guān)指導(dǎo)性建議。專家組由實(shí)驗(yàn)室癌癥遺傳學(xué)家、臨床腫瘤學(xué)家、生物信息學(xué)專家、病理學(xué)家和其他人員組成。建議內(nèi)容在多次討論修改后定為初步共識，主要包括NGS技術(shù)應(yīng)用需求及相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測內(nèi)容、測序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告、技術(shù)質(zhì)量認(rèn)證和驗(yàn)證等方面的基本要求與規(guī)范。

背景：

當(dāng)今的腫瘤診治已經(jīng)進(jìn)入個體化及正確醫(yī)學(xué)時代，需要充分分析腫瘤從發(fā)生到轉(zhuǎn)歸的整個疾病進(jìn)程中的驅(qū)動基因及其變異，從而選擇有效的靶向治療方案。為此，中國臨床腫瘤學(xué)會于2015年9月17日在廈門市召集了我國具有代表性的腫瘤學(xué)專家、病理及分子生物學(xué)專家及NGS技術(shù)專家，成立了“中國腫瘤驅(qū)動基因分析聯(lián)盟”（China Actionable Genome Consortium，CAGC）并啟動了正確腫瘤學(xué)研究項(xiàng)目（Precision Oncology Initiative，即CAGC POI），確立了整體項(xiàng)目的組織框架和內(nèi)容框架。CAGC-POI計劃先進(jìn)階段擬在初步建立二代測序技術(shù)（next generation sequencing, NGS）臨床應(yīng)用共識的基礎(chǔ)上，在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性實(shí)體瘤開展以NGS技術(shù)為主的驅(qū)動基因譜分析。2015年9月27日經(jīng)CSCO理事長吳一龍教授與中華醫(yī)學(xué)會會長陳竺院士和陳賽娟院士討論后決定，將造血系統(tǒng)腫瘤作為第6個瘤種納入CAGC POI計劃，主要是針對白血病等開展較之以前更為廣泛的基因變異譜分析。在上述共識建立、主要6個瘤種的變異譜分析驗(yàn)證、優(yōu)化流程的基礎(chǔ)上，將在攜帶有臨床“可靶向作用”驅(qū)動基因的患者中，開展相應(yīng)的靶向正確診治的實(shí)踐與試驗(yàn)研究。賊終提出適合我國臨床腫瘤學(xué)實(shí)踐的NGS檢測技術(shù)、分析內(nèi)容、診治模式的共識、標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，克服NGS實(shí)驗(yàn)室與臨床應(yīng)用之間的障礙，提高為腫瘤患者服務(wù)的質(zhì)量和能力。

本階段共識建立是CAGC POI項(xiàng)目的先進(jìn)階段，將由專家組提出NGS技術(shù)在臨床腫瘤學(xué)應(yīng)用的共識內(nèi)容。在廣泛收集相關(guān)的建議和意見的基礎(chǔ)上，修訂為指導(dǎo)下一階段技術(shù)檢測的共識性文件，供腫瘤學(xué)相關(guān)臨床和檢測人員等參考。

技術(shù)引言：

當(dāng)今的二代測序技術(shù)（NGS）是高通量的大規(guī)模平行測序技術(shù)，可同步獲得腫瘤患者個體特定樣本中數(shù)十億以上的DNA堿基序列信息。NGS有明顯的通量優(yōu)勢及發(fā)現(xiàn)未知基因變異的優(yōu)勢，但是在使用中也存在包括檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)管理、分析與報告、解讀與臨床咨詢等方面的各種挑戰(zhàn)。既往的文獻(xiàn)及國際相關(guān)共識已經(jīng)總結(jié)和報道了NGS在單基因遺傳病、產(chǎn)前診斷等方面的應(yīng)用。而在臨床腫瘤學(xué)的實(shí)踐中，基因檢測已經(jīng)成為正確診治的前提和核心內(nèi)容之一，但缺乏統(tǒng)一的共識。腫瘤基因檢測范圍越來越廣，已經(jīng)由單基因的分析，逐步走向數(shù)個至數(shù)百個基因的多重分析。在未來，腫瘤臨床實(shí)踐中甚至可能需要針對外顯子組、轉(zhuǎn)錄組、全基因組、表觀遺傳組的信息分析和應(yīng)用。另一方面，由于生物技術(shù)也在不斷進(jìn)步，因此可以預(yù)見的是，在未來的一段時間，高通量技術(shù)NGS在臨床診斷和正確治療中的應(yīng)用將會在檢測技術(shù)、分析內(nèi)容、解讀等方面會一直產(chǎn)生變化，也會帶來在實(shí)踐應(yīng)用中的各種挑戰(zhàn)。

在現(xiàn)階段，我國社會的腫瘤患者數(shù)目龐大，驅(qū)動基因診斷和檢測應(yīng)用需求巨大。但在實(shí)際應(yīng)用中會因?yàn)闄z測技術(shù)的準(zhǔn)入門檻低、缺乏臨床公認(rèn)的NGS指導(dǎo)規(guī)范，腫瘤診治中可能存在檢測質(zhì)量低下、結(jié)果正確性差，檢測結(jié)果解讀不專業(yè)，甚至盲目追求基因檢測結(jié)果的現(xiàn)象。因此，我國腫瘤學(xué)界亟需對當(dāng)前NGS在臨床合理規(guī)范的使用進(jìn)行充分討論，形成共識予以發(fā)布，以指導(dǎo)我國臨床腫瘤診療中的規(guī)范應(yīng)用。

本技術(shù)共識闡述了NGS技術(shù)質(zhì)量需求、臨床腫瘤相關(guān)NGS檢測內(nèi)容、樣本處理、測序流程、數(shù)據(jù)管理、信息學(xué)分析、結(jié)果報告解釋和咨詢等多個方面的內(nèi)容。本共識也對患者知情同意、測試項(xiàng)目的質(zhì)控、研究與診斷的應(yīng)用差別等內(nèi)容進(jìn)行了說明。
 

1. NGS在臨床腫瘤診斷中的質(zhì)量需求：

NGS技術(shù)正處于不斷的發(fā)展和完善過程中，需要對NGS技術(shù)現(xiàn)狀有正確的認(rèn)識。但過去十年腫瘤學(xué)界的研究和應(yīng)用顯示：在恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)條件下，NGS確實(shí)能夠高通量地檢測分析腫瘤中的驅(qū)動基因，給部分患者帶來治療和生存的獲益。

在臨床實(shí)踐中各實(shí)驗(yàn)室可能有不同的NGS技術(shù)平臺。無論使用何種平臺，各實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)該按照本共識中的推薦（聲明）開展NGS項(xiàng)目測試，對平臺及相關(guān)分析工具進(jìn)行驗(yàn)證后才應(yīng)用于臨床。

針對腫瘤的多基因檢測，需要設(shè)計特定的NGS測試項(xiàng)目（test）。這些項(xiàng)目的檢測結(jié)果應(yīng)能夠明確回答臨床診療所需的基因狀態(tài)。需要明確指出的是，應(yīng)該避免分析技術(shù)能力尚未得到充分驗(yàn)證的NGS項(xiàng)目在臨床應(yīng)用。

聲明1：臨床腫瘤診斷應(yīng)用的NGS項(xiàng)目應(yīng)符合相應(yīng)的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。未進(jìn)行充分驗(yàn)證的NGS技術(shù)不應(yīng)該在臨床實(shí)踐的驅(qū)動基因診斷中應(yīng)用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該明確能夠提供的檢測項(xiàng)目的內(nèi)容范圍和相關(guān)技術(shù)參數(shù)。

（注：文中的“聲明”（statement）是專家組討論的各個要點(diǎn)，也即專家組形成的共識或推薦）

NGS用于臨床腫瘤分子診斷能夠帶來明確的益處（utility）。NGS技術(shù)優(yōu)勢：一次性、特定時間（約10個工作日）產(chǎn)生覆蓋基因組特定區(qū)域（從數(shù)個基因到數(shù)百個基因以至外顯子組、轉(zhuǎn)錄組或全基因組）的通量數(shù)據(jù)，同步獲得多基因、多位點(diǎn)、多種變異形式的分子檢測結(jié)果。盡管目前NGS的多基因多重分析總成本較高，但相對于傳統(tǒng)檢測方法而言，單個基因單個位點(diǎn)的檢測費(fèi)用已大大下降。

影響NGS結(jié)果的限制性因素包括：平臺類別、靶區(qū)域富集方法、文庫構(gòu)建及擴(kuò)增效率、測序數(shù)據(jù)量、生物信息學(xué)分析流程等。在臨床應(yīng)用之前，對于特定突變位點(diǎn)的NGS檢測結(jié)果在低質(zhì)量數(shù)據(jù)條件下應(yīng)采用其他方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。檢測實(shí)驗(yàn)室的專家、腫瘤患者的主診醫(yī)生與患者應(yīng)該就開展腫瘤NGS分析的利弊進(jìn)行充分溝通和知情同意，同時讓臨床醫(yī)生了解特定NGS測試項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)意義。

聲明2：NGS檢測項(xiàng)目（Test）的目的和臨床益處（utility）應(yīng)該明確，如果是用于臨床靶點(diǎn)抑制劑（靶向藥物）的使用決策參考，檢測結(jié)果應(yīng)該能夠明確一些在臨床可采取特定藥物靶向治療的靶點(diǎn)變異信息。NGS測試項(xiàng)目如果是用于分子分型、療效預(yù)測或預(yù)后判斷則需要在發(fā)現(xiàn)集（discovery set）的基礎(chǔ)上建立分析模型，再通過技術(shù)和驗(yàn)證集（validation set）的驗(yàn)證方可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。

2. NGS在臨床腫瘤應(yīng)用的檢測內(nèi)容：

在臨床實(shí)踐中，不同的瘤種既可存在瘤種特異性的驅(qū)動基因變異，也可能存在共同的基因變異。一個瘤種存在眾多的分子變異亞型，從而提出“同病異治”或“分型而治”的策略；不同瘤種之間由于存在共同的驅(qū)動基因分型，則可以采取“異病同治”的策略。由此可見，臨床腫瘤的基于基因或基因組學(xué)的分子分型將逐步超越傳統(tǒng)的病理組織形態(tài)學(xué)分型，成為臨床診治腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

腫瘤的多基因分型對藥物研發(fā)策略也產(chǎn)生了重大影響。在藥物臨床試驗(yàn)設(shè)計方面，近年來出現(xiàn)了兩種基于分子靶點(diǎn)的試驗(yàn)研究設(shè)計類型。一種是“雨傘”設(shè)計類型（Umbrella trial design），即針對單個瘤種的基于多個驅(qū)動基因分型及其靶向治療，另一種則是“籃子”設(shè)計類型（Basket trial design），是針對多個瘤種的驅(qū)動基因的“同型同治”。

無論是臨床實(shí)踐還是臨床試驗(yàn)，用于基因分型的NGS檢測項(xiàng)目內(nèi)容需要精細(xì)的設(shè)計和技術(shù)高效性的驗(yàn)證。NGS項(xiàng)目的檢測內(nèi)容應(yīng)明確檢測哪些基因、相應(yīng)基因的受檢區(qū)域、靶點(diǎn)的變異信息等。

聲明3：如果NGS用于臨床分子診斷，應(yīng)該明確至少哪些基因需要納入檢測名單（panel list）中。這個必須的“核心基因清單”（core gene list）需要特定腫瘤亞?？葡嚓P(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)室多學(xué)科專家共同討論后制定。

“核心基因清單”論證及制定過程中應(yīng)以“患者的利益”為中心，充分整合臨床腫瘤學(xué)家對于正確診治的觀點(diǎn)，并充分考慮在我國推廣應(yīng)用的可操作性。以肺癌為例: 目前NCCN及國內(nèi)肺癌臨床指南或衛(wèi)計委診療規(guī)范都明確指出EGFR突變、KRAS突變、ALK重排（融合）、ROS1重排（融合）、MET 14號外顯子可變剪切變異、MET拷貝數(shù)擴(kuò)增、RET重排（融合）、HER2突變或擴(kuò)增、BRAF突變等驅(qū)動基因變異是臨床實(shí)踐中的重要必須基因。

從CAGC POI項(xiàng)目的惡性腫瘤的整體角度考慮，檢測內(nèi)容（gene panel及其基因組區(qū)域）應(yīng)該既包括各瘤種特異性的panel，也應(yīng)備有一個大而全的gene panel。因?qū)嶓w瘤和血液腫瘤的變異譜方面的差異較大，因此，在大而全的panel中對實(shí)體瘤和血液腫瘤應(yīng)該分別設(shè)計。

“可靶向作用”的原理及定義：驅(qū)動基因的定義是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等疾病進(jìn)程中關(guān)鍵步驟的基因。“可靶向作用”基因則是指針對該驅(qū)動基因的變異靶點(diǎn)或其上下游關(guān)鍵分子，能夠采用靶向藥物等手段進(jìn)行治療，從而達(dá)到抑制腫瘤進(jìn)展或消退腫瘤的治療效果?？砂邢蜃饔没蛞部芍冈摶虻淖儺惪梢杂脕碜鳛槊鞔_的分子亞型診斷或預(yù)后判斷。

聲明4：“可靶向作用基因”的變異可能會影響臨床決策，醫(yī)生需要根據(jù)基因分型的檢測結(jié)果來指導(dǎo)臨床診療方案。“可靶向作用基因”的變異可分為兩大類，先進(jìn)類（Level 1 actionable alterations）包括國際、國內(nèi)指南（CSCO、ASCO、NCCN、ESMO等）中明確指定的、藥物標(biāo)簽中說明的、與FDA/CFDA批準(zhǔn)的適應(yīng)癥相關(guān)的臨床分型基因變異，或是具有明確的分子診斷或預(yù)后判斷價值的基因變異。第二類（Level 2 actionable alterations）包括正在開展的任何期別（I-III期）臨床試驗(yàn)中的藥物相關(guān)靶點(diǎn)、在已經(jīng)或即將開展的臨床試驗(yàn)中作為入組條件的變異靶點(diǎn)、在國內(nèi)外指南中其他腫瘤或疾病適應(yīng)癥的藥物靶點(diǎn)、用于輔助診斷或預(yù)后判斷的靶點(diǎn)等。在NGS檢測中，對于臨床意義非常明確的體細(xì)胞突變的少數(shù)基因集分析，可以直接檢測腫瘤標(biāo)本而無須設(shè)置白細(xì)胞等對照樣本。但對于需要包含上述第二類可靶向作用基因的更大的基因集分析，尤其是數(shù)百基因乃至全外顯子組測序等，建議在腫瘤樣本進(jìn)行NGS檢測時設(shè)置患者自身白細(xì)胞樣本對照分析。

聲明5：隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的不斷深入，新的靶點(diǎn)及藥物會得到不斷的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)。因此有必要定期或不定期依據(jù)重要的臨床研究進(jìn)展對檢測內(nèi)容進(jìn)行討論并發(fā)布更新。

聲明6：檢測基因數(shù)量越多，診斷信息會越多。但由于腫瘤信號通路的冗余性和復(fù)雜性，在基因清單中，除了“核心基因”之外，應(yīng)該對其他增加的每個基因進(jìn)行明確定義注釋，說明其基因型與潛在可靶向作用位點(diǎn)或通路的關(guān)系。在實(shí)際的NGS測試項(xiàng)目應(yīng)用中，檢測基因數(shù)量的增加不應(yīng)以核心基因的檢測質(zhì)量受損為代價。

技術(shù)參數(shù)驗(yàn)證對高效檢測結(jié)果的正確性很重要。所有NGS計量參數(shù)都應(yīng)該明確說明。在檢測中應(yīng)該記錄批次或分析樣本特異性的特征。檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該利用結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫來高效平臺、各分析項(xiàng)目、樣本處理等方面的質(zhì)量分析。在檢測分析流程中，每個樣本都應(yīng)該做好少有性標(biāo)識。在平臺穩(wěn)定性驗(yàn)證中，應(yīng)該使得所有儀器和試劑都符合標(biāo)準(zhǔn)要求，提供特定驅(qū)動基因的正確性和正確性。
技術(shù)驗(yàn)證過程中應(yīng)該記錄在案的相關(guān)內(nèi)容或參數(shù)包括以下幾方面。1．樣本相關(guān)的患者信息保護(hù)原則、少有性標(biāo)識、接收、存儲、處理各步驟內(nèi)容及時間；2. 實(shí)驗(yàn)操作過程中DNA/RNA處理每一步驟所用試劑名稱、生產(chǎn)廠家、批號，記錄每一步操作后的質(zhì)量指標(biāo)（如RIN等）；3．?dāng)?shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)庫管理相關(guān)的軟件（包括版本號，分析時所用各項(xiàng)參數(shù)）、數(shù)據(jù)的相關(guān)參數(shù)（數(shù)據(jù)量大小，QC等）、數(shù)據(jù)庫的安全性和備份情況等。

聲明7: NGS項(xiàng)目的檢測流程和生物信息學(xué)分析需要針對特定平臺和分析項(xiàng)目進(jìn)行充分優(yōu)化。流程驗(yàn)證中應(yīng)提供分析敏感性和特異性的參數(shù)。因?yàn)榉治龇椒ǖ牟町悾槍NV、INDEL、重排（融合）、CNV等不同的變異應(yīng)該分別測試技術(shù)的敏感度和特異度。受樣本取材或探針設(shè)計等因素影響或限制，NGS在某些變異類型如拷貝數(shù)擴(kuò)增的檢測方面有時存在一定的局限性。對于NGS方法正確性可能有影響的情況，應(yīng)考慮采用高效的單基因方法對檢出變異進(jìn)行驗(yàn)證。
 

3. NGS應(yīng)用中的樣本處理：

NGS檢測需文庫構(gòu)建，該步驟原始材料為DNA或來自RNA的cDNA。適合臨床NGS分析的樣本類型優(yōu)先選擇新鮮組織標(biāo)本，也可選用甲醛固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）樣本、腫瘤細(xì)胞學(xué)標(biāo)本及血漿（游離DNA/RNA）等。

NGS可用于疾病初診時的分子靶點(diǎn)分析，也可用于治療中疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的監(jiān)測及耐藥分子機(jī)制的診斷。因而在疾病的全程管理中可合理地考慮在診療的關(guān)鍵時間節(jié)點(diǎn)收集臨床標(biāo)本進(jìn)行NGS分析。決定是否采用NGS在多個時間節(jié)點(diǎn)的檢測分析應(yīng)做好多學(xué)科討論和充分的知情同意。

各類樣本采集：（1）對于手術(shù)和活檢的新鮮組織：理想的保存方法是迅速置于液氮中，可保存于液氮罐或-80℃冰箱，該過程應(yīng)在手術(shù)離體后30分鐘內(nèi)完成，以防止RNA等核酸降解；或采用保存在樣本保護(hù)劑中，盡早轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?？刹捎美鋬銮衅旧u估樣本中的腫瘤細(xì)胞含量。（2）甲醛固定石蠟包埋組織（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）：按病理操作規(guī)范進(jìn)行取材。手術(shù)或活檢離體的組織應(yīng)在30分鐘內(nèi)浸入10%中性福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，避免使用酸性及含有重金屬離子的固定液。大標(biāo)本應(yīng)切開后充分固定至6-48小時，不超過72小時。小活檢標(biāo)本可固定6-12小時。開展NGS檢測前應(yīng)進(jìn)行HE染色評估腫瘤細(xì)胞的含量。（3）細(xì)胞學(xué)樣本：胸腹水中的腫瘤細(xì)胞用于基因檢測時，必須確認(rèn)是否有腫瘤細(xì)胞存在。細(xì)胞病理檢查之后，符合質(zhì)量要求的標(biāo)本可直接抽提核酸，也可以制備成FFPE細(xì)胞學(xué)蠟塊進(jìn)行后續(xù)分析。（4）血漿或血液樣本：循環(huán)游離/腫瘤DNA(circulating free/tumor DNA，cf/ctDNA)是存在于血漿中的游離DNA，腫瘤來源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊。采集外周血提取血漿游離DNA進(jìn)行檢測，取樣時應(yīng)使用一次性的EDTA抗凝真空采血管，采集8~10ml全血，冷藏運(yùn)輸，2小時內(nèi)分離血漿，提取游離DNA，保存到-80℃冰箱中，并避免反復(fù)凍融。如外周血需要長時間運(yùn)輸，建議用商品化的游離DNA樣本專用保存管，在常溫條件下，cfDNA在全血中可穩(wěn)定保存3－7天。由于血細(xì)胞基因組DNA（gDNA）的潛在大量釋放會極大地稀釋血漿游離腫瘤DNA的濃度，經(jīng)肉眼觀察確認(rèn)為溶血的樣本不適用于對游離腫瘤DNA的NGS檢測。當(dāng)懷疑血漿游離DNA受到血細(xì)胞基因組DNA污染時，可考慮采用核酸片段大小分布分析來判斷污染是否存在，而從判斷樣本是否適用于NGS檢測。

采樣質(zhì)量的評價對后續(xù)結(jié)果的解讀有重要意義，臨床樣本的采樣過程、分析前的運(yùn)輸和處理流程以及病理的評估結(jié)果等均應(yīng)做相應(yīng)的記錄。質(zhì)量評價的內(nèi)容應(yīng)包括腫瘤細(xì)胞含量比例、腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，是否按照要求進(jìn)行處理與運(yùn)輸?shù)取Ｔu價方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和血漿樣本核酸濃度分析等。對于腫瘤細(xì)胞分布集中的區(qū)域應(yīng)進(jìn)行標(biāo)注，必要時進(jìn)行顯微切割后再提取核酸。
樣本采集和處理中的防污染：樣本采集賊好采用一次性材料；制備不同患者病理切片樣本時，需更換新刀片，并清除操作器皿或切片機(jī)上先前樣本的殘留。

樣本運(yùn)送和保存：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立詳細(xì)的樣本運(yùn)送標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），對臨床醫(yī)生提供樣本采集手冊，要求物流人員填寫相關(guān)運(yùn)送記錄表，確保運(yùn)送過程中各類樣本的安全性和過程的可控性。石蠟材料可常溫運(yùn)輸，血漿樣本干冰條件下運(yùn)輸，核酸樣本需要在4攝氏度或冷凍條件下運(yùn)輸。

聲明8：為了提高NGS檢測腫瘤驅(qū)動基因的正確性，應(yīng)該提供高質(zhì)量的臨床生物材料樣本。不同類型生物材料的收集及處理均應(yīng)有明確的標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP）指導(dǎo)。

聲明9：樣本登記過程中每個標(biāo)本應(yīng)該在NGS分析中有少有性標(biāo)識。包括來自同一患者的不同組織病灶、不同組織切片、不同核酸樣本等均有少有性的標(biāo)識。

聲明10：樣本評估和用量：除了血漿或血液來源的DNA/RNA，凡是涉及形態(tài)學(xué)的標(biāo)本，應(yīng)該在顯微鏡下評估腫瘤細(xì)胞的含量，充分記錄各類形態(tài)學(xué)惡性細(xì)胞的含量比例。評估記錄還應(yīng)包括標(biāo)本收集和處理方法。腫瘤細(xì)胞比例低的標(biāo)本必要時應(yīng)采用包括顯微微切割在內(nèi)的有效富集腫瘤細(xì)胞的方法，提高腫瘤細(xì)胞比例。一般情況下，適合于NGS檢測的組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議應(yīng)達(dá)到20%以上。如果腫瘤細(xì)胞占比較低，患者知情后依然愿意進(jìn)行NGS檢測，應(yīng)該盡量采用顯微切割技術(shù)富集腫瘤細(xì)胞，或增加NGS測序 數(shù)據(jù)量以提高測序覆蓋深度（depth），并在報告中提示樣本局限性。組織樣本抽提獲得的DNA量應(yīng)達(dá)50ng以上用于NGS檢測。血液樣本建議采血至少8ml，分離血漿游離DNA用于NGS檢測。

聲明11：核酸樣本抽提及QC/QA。組織DNA與血漿游離DNA等核酸樣本均應(yīng)進(jìn)行檢測前的質(zhì)量控制分析，包括核酸的濃度和純度分析。組織DNA樣本應(yīng)該進(jìn)行核酸完整性分析，以判斷DNA質(zhì)量。血漿游離DNA樣本應(yīng)該進(jìn)行片段長度分布分析，以判斷是否存在血細(xì)胞基因組DNA的污染。在文庫構(gòu)建后應(yīng)該對核酸樣本進(jìn)行濃度測定與文庫片段分布等質(zhì)量控制。

聲明12：為了便于后續(xù)采用其他技術(shù)方法對檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在樣本留取時，應(yīng)適當(dāng)考慮增加生物材料的留取量。在石蠟標(biāo)本的切片過程中可考慮適當(dāng)同步預(yù)留幾張切片用于后續(xù)IHC、FISH、PCR測序等方法驗(yàn)證。

4. NGS測序 技術(shù)及流程：

NGS又稱大規(guī)模平行測序（MPS），是一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測序技術(shù)，是繼Sanger測序之后的革命性進(jìn)步。NGS能夠同時對上百萬甚至數(shù)十億個DNA分子進(jìn)行測序，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測序的目標(biāo)。高通量測序技術(shù)不僅可以進(jìn)行大規(guī)?；蚪M序列的測序，還可用于基因表達(dá)分析、非編碼小分子RNA的鑒定、DNA甲基化等相關(guān)分析。

目前在臨床腫瘤實(shí)踐中，NGS主要應(yīng)用于驅(qū)動基因測序，是腫瘤正確診療的重要環(huán)節(jié)。NGS的優(yōu)勢包括：一次性通量測序、能夠分析變異豐度、相對成本低。存在的不足之處包括：滿足臨床應(yīng)用的生物信息分析軟件尚處于發(fā)展之中、基因型的判讀依賴于生物信息的正確分析、測序深度在必要時因整體成本高而難以達(dá)到等。

就NGS技術(shù)本身而言，在臨床腫瘤診斷和監(jiān)測中的應(yīng)用應(yīng)充分關(guān)注試劑管理、樣本的QA/QC、檢測環(huán)境、人員資質(zhì)和熟練程度、NGS技術(shù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（包括文庫構(gòu)建、測序流程、質(zhì)控等）等環(huán)節(jié)，以標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范加以約束，以高效特定腫瘤NGS測試（test）能夠穩(wěn)定正確地發(fā)揮作用。

測序技術(shù)的各個環(huán)節(jié)應(yīng)該做好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范記錄，賊好有結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行管理，包括平臺環(huán)境參數(shù)、試劑使用和性能、樣本追蹤、質(zhì)控數(shù)據(jù)等管理。通過日常和定期分析質(zhì)控高效檢測的正確性。
為滿足臨床需求，實(shí)驗(yàn)室需對各個質(zhì)量控制步驟出現(xiàn)異常、失敗的樣本規(guī)定合理的備選方案。比如采用其他分子診斷平臺檢測一部分重要位點(diǎn)，或?qū)﹃栃晕稽c(diǎn)采用其他平臺確認(rèn)性檢測，或者重復(fù)高通量測序流程等，有條件的檢測單位也可以重新選取標(biāo)本。

聲明13：NGS檢測需要符合嚴(yán)格的檢測環(huán)境要求，各類樣本的儲存、核酸抽提處理及NGS分析應(yīng)在通過審核驗(yàn)收的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。

聲明14：NGS試劑管理和質(zhì)控：NGS試劑應(yīng)該獨(dú)立存放，防止交叉污染。對于實(shí)驗(yàn)室自配試劑或探針及采購試劑，均需做好每批試劑的性能評價，評價合格后才可用于臨床樣本分析。

聲明15：每個特定的NGS測試項(xiàng)目（test）都需要經(jīng)過嚴(yán)格的技術(shù)驗(yàn)證合格后才可以用于臨床腫瘤檢測。診斷測試項(xiàng)目必須在正確性、分析敏感度、特異度、正確性等方面進(jìn)行充分評價。如果檢測項(xiàng)目中的試劑或步驟有任何主要變更，則質(zhì)量參數(shù)需要重新評價。在針對檢測項(xiàng)目更新或升級的重新評價中，應(yīng)該明確測試所需要的樣本類型及例數(shù)。強(qiáng)烈建議各實(shí)驗(yàn)室參加NGS相關(guān)的室間質(zhì)量評估項(xiàng)目來評測檢測能力和質(zhì)量。

聲明16：明確的檢測流程包括樣本QC/QA、樣本預(yù)處理、接頭連接、預(yù)擴(kuò)增、基因組合（gene panel）靶區(qū)的捕獲、靶區(qū)純化、擴(kuò)增文庫構(gòu)建、QC定量后上NGS測序 儀檢測等步驟。每個步驟的操作和質(zhì)量控制都應(yīng)建立SOP進(jìn)行指導(dǎo)。如果使用擴(kuò)增子（amplicon）建庫的方式，同樣需要建立相應(yīng)的SOP進(jìn)行質(zhì)控管理。

聲明17：NGS的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括上述樣本預(yù)處理至文庫構(gòu)建、測序、質(zhì)控的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，也包括原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生和管理、信息學(xué)分析過程的標(biāo)準(zhǔn)化。由此CAGC將在下一階段可行性驗(yàn)證基礎(chǔ)上形成一套NGS技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)文件（SOP）。

聲明18：人員配備和熟練程度應(yīng)滿足實(shí)踐需求。應(yīng)配有專門的質(zhì)控人員。對于參與NGS實(shí)驗(yàn)流程操作的技術(shù)人員進(jìn)行充分的培訓(xùn)，達(dá)到一定的熟練程度。每個平臺應(yīng)有技術(shù)員專職從事實(shí)驗(yàn)操作。

聲明19：“核心基因清單”與相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)品將被用于各個實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)控比較。根據(jù)檢測驅(qū)動基因的突變結(jié)果描述、目的區(qū)域的覆蓋度等建立評分體系。這個評分體系將用于對實(shí)驗(yàn)室間NGS檢測能力的分析與認(rèn)證。
 

5. NGS數(shù)據(jù)的產(chǎn)生、管理、信息學(xué)分析：

由于NGS數(shù)據(jù)龐大，數(shù)據(jù)管理、儲存和分析需要強(qiáng)大的計算平臺支持。數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢查、信息學(xué)分析、輸出格式、儲存等方面都應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)SOP支持。賊好有結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫來管理原始數(shù)據(jù)、質(zhì)控數(shù)據(jù)以及分析結(jié)果數(shù)據(jù)等。

聲明20：數(shù)據(jù)分析工具（軟件）的能力驗(yàn)證。需要采用適量例數(shù)的原始數(shù)據(jù)針對NGS數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行驗(yàn)證分析。通過采用攜帶不同種類與豐度變異的數(shù)據(jù)來驗(yàn)證整個分析流程的正確性與穩(wěn)定性。特別是在增加檢測基因的內(nèi)容時需要驗(yàn)證分析工具的高效性。分析工具的能力驗(yàn)證應(yīng)有詳細(xì)的內(nèi)部軟件驗(yàn)證記錄。CSCO CAGC項(xiàng)目也將組織開展軟件分析能力驗(yàn)證。

聲明21：數(shù)據(jù)產(chǎn)生和管理儲存。檢測實(shí)驗(yàn)室必須采用結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)庫來注釋SNP、Indel、重排（融合）、CNV等各類變異信息。

聲明22：數(shù)據(jù)儲存應(yīng)該采用通用的FASTQ、BAM、VCF格式，便于數(shù)據(jù)交換及實(shí)驗(yàn)室間評價。同時保存完整的log日志文件，便于區(qū)別流程版本信息、追溯異常結(jié)果來源及分析原始數(shù)據(jù)向診斷報告生成的可重復(fù)性。診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該長期保存相關(guān)的數(shù)據(jù)集（至少15年）。

聲明23：NGS原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢查，應(yīng)有嚴(yán)格的操作規(guī)程指導(dǎo)。所有參數(shù)需與檢測性能評價過程中的參數(shù)進(jìn)行比較，設(shè)置并執(zhí)行接受與拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。參見表1。

表1. 基于原始序列(FASTQ)和比對后序列(BAM)質(zhì)量的計量參數(shù)

變異檢測質(zhì)量的相關(guān)計量參數(shù)

聲明24：數(shù)據(jù)分析的流程包括初步分析、接頭序列去除、引物序列去除、低質(zhì)量序列去除、參照基因組序列比對（mapping）、去重、Indel重復(fù)比對、堿基質(zhì)量得分校正、突變識別（variant calling）、注釋、過濾后輸出等流程（見下表2）。CAGC POI項(xiàng)目需要在各個瘤種中的每一步都應(yīng)做到同質(zhì)性。

表2. 臨床腫瘤NGS測序 的簡單流程步驟描述

聲明25：體細(xì)胞與胚系來源的變異應(yīng)該加以區(qū)分。體細(xì)胞突變在腫瘤診療中的臨床意義較大。特定的胚系突變的生物學(xué)意義需要說明，如乳腺癌中BRCA1/2的突變。

聲明26：應(yīng)對各個瘤種中與臨床意義相關(guān)的變異重點(diǎn)進(jìn)行關(guān)注分析和說明，比如肺癌中的EGFR exons 18-21突變、ALK重排、ROS重排、MET E14拼接變異、HER2插入突變或擴(kuò)增等突變的說明。

近年來，關(guān)于腫瘤細(xì)胞分子異質(zhì)性的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在不同分子變異亞型的亞克隆。異質(zhì)性亞克隆的存在會影響腫瘤疾病的整體進(jìn)化路徑及對靶向治療的應(yīng)答和耐藥。因此NGS用于腫瘤診斷或耐藥監(jiān)測時需要達(dá)到較深的測序覆蓋度，這樣才能充分解釋腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)化過程中的異質(zhì)性及其與臨床表型的關(guān)系。

聲明27：CAGC建議，臨床腫瘤組織樣本的NGS檢測數(shù)據(jù)中測序“有效深度”應(yīng)該達(dá)到 500X以上；血漿游離DNA標(biāo)本的NGS“有效測序深度”應(yīng)該達(dá)到1000X以上。
說明：（1）有效深度定義為去除PCR重復(fù)reads（duplicates）之后的深度；（2）應(yīng)該在80%以上的目標(biāo)捕獲區(qū)域達(dá)到這個深度，而非是所有區(qū)域的平均，否則在區(qū)域間覆蓋波動較大的情況下會有大量區(qū)域出現(xiàn)覆蓋不夠的情況。

聲明28：CAGC項(xiàng)目數(shù)據(jù)的管理應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)流程和各類數(shù)據(jù)管理方面實(shí)現(xiàn)同一化。在后續(xù)將開展每個瘤種約100例的分析，從而對本次共識的可操作性進(jìn)行驗(yàn)證。
 

6. NGS結(jié)果報告與咨詢：

NGS是多步驟的復(fù)雜的檢測和分析方法，產(chǎn)生報告的內(nèi)容較多。對臨床而言需要遵循首頁簡明、結(jié)果明確、解釋清楚、信息充分的原則。

在開展NGS臨床測試之前，應(yīng)明確定義所檢測的驅(qū)動基因在基因組上的哪些靶區(qū)域范圍（target range），并在報告中告知臨床醫(yī)生。

NGS報告結(jié)果應(yīng)該簡明清晰。具有臨床靶向意義的檢測結(jié)果及其參數(shù)應(yīng)該優(yōu)先報告，如EGFR L858R突變，突變位點(diǎn)占比（mutant allele fraction, MAF）=15.6%。在報告首頁中應(yīng)包括患者ID、臨床診斷、測試的簡單描述、技術(shù)類型等信息。根據(jù)情況，報告可以適當(dāng)添加附件成多頁。各個瘤種的“核心基因”檢測結(jié)果必須明確報告，其他基因根據(jù)結(jié)果概括性報告，對于特別的突變（如在其他腫瘤中發(fā)現(xiàn)是核心變異）可特別進(jìn)行報告。

對于生物學(xué)意義未明或未明確分類的變異（Unclassified variants，UVs）結(jié)果應(yīng)該收集整理，并提倡在同行間交換，為賊終確認(rèn)這些UVs是功能性或非功能性的提供幫助。

對于不同瘤種的NGS數(shù)據(jù)，可以整合到同一個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，這將有助于不同瘤種間變異信息在臨床應(yīng)用中的借鑒。

聲明29：報告格式和內(nèi)容需要標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)能夠適應(yīng)短期未來的發(fā)展趨勢（靶點(diǎn)知識和檢測內(nèi)容的變更）。請見附件一，臨床腫瘤NGS的報告格式。報告內(nèi)容應(yīng)該包括患者ID、疾病信息、樣本信息、分析技術(shù)信息、主要結(jié)果、結(jié)果解釋、操作員和實(shí)驗(yàn)室專家（腫瘤分子生物學(xué)或遺傳學(xué)專家）簽字等。

聲明30：報告范圍(reportable range)應(yīng)該根據(jù)測試目的以及測序能夠達(dá)到質(zhì)量要求的覆蓋范圍來決定。例如在對外顯子組序列的檢測中，在肺癌中不一定報告所有覆蓋區(qū)域中檢出的變異。但需知情臨床醫(yī)生本次報告不能排除潛在的“非關(guān)注區(qū)域”的變異。

聲明31：NGS報告應(yīng)既簡明扼要、明確易懂，又能充分提供必要信息以供醫(yī)生參考用于當(dāng)前臨床的靶向治療方案決策。

聲明32：結(jié)果解釋需客觀中肯，平實(shí)地描述腫瘤突變的結(jié)果。在疾病相關(guān)性方面只描述既往研究中的療效或預(yù)測相關(guān)性，不應(yīng)出現(xiàn)建議使用何種治療手段或策略的文字。檢測結(jié)果在臨床決策中的應(yīng)用應(yīng)由臨床醫(yī)生或多學(xué)科專家討論決定。

聲明33：遺傳咨詢需多學(xué)科支持，臨床決策的制定過程中需要與實(shí)驗(yàn)室癌癥遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、病理學(xué)等多方面專家進(jìn)行必要的信息溝通。

7. 知情同意。

聲明34：NGS檢測項(xiàng)目開展前應(yīng)該向患者做好知情同意或相關(guān)遺傳咨詢（genetic counseling），解釋疾病條件下進(jìn)行特定NGS檢測分析的目的和利弊。同時需要向醫(yī)生及患者告知測試的局限性，包括驅(qū)動基因的信息、報告范圍、技術(shù)分析的敏感度和特異度等。

知情同意書的內(nèi)容至少必須包含：

（1）進(jìn)行基因檢測的依據(jù)，其中包括醫(yī)學(xué)指南、專家共識、治療規(guī)范等內(nèi)容，需使患者知悉檢測的意義和目的；

（2）基因檢測過程中可能有的局限性，如提取樣本量是否足夠，樣本質(zhì)量控制指標(biāo)是否適合基因檢測，如發(fā)生類似情況，需要及時向患者以及家屬說明情況，再決定下一步；

（3）進(jìn)行基因測序可輔助個體化治療，但是賊終決定須由臨床醫(yī)生決定；

（4）基因檢測結(jié)果要只針對該次送檢樣本；

（5）檢測機(jī)構(gòu)必須對患者的身份信息、病例信息以及檢測結(jié)果等保密?；颊哌M(jìn)行基因檢測之前需知悉以上事項(xiàng)，并簽署知情同意書。

8. NGS用于研究與診斷的區(qū)別：

由于技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用單位的能力提升，NGS用于研究或是診斷的界限已經(jīng)模糊，但在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)該明確特定的NGS測試是用于研究還是診斷。診斷目的的NGS檢測是為了回答臨床患者腫瘤中是否具有特定的基因變異狀態(tài)（可作用靶點(diǎn)的變異）。診斷檢測通常是在一個得到認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室開展。而研究目的的NGS檢測是研究假設(shè)驅(qū)動的檢測，檢測結(jié)果對入組患者通常只具有有限或不確定的臨床意義。全外顯子或基因組測序的診斷結(jié)果由于數(shù)據(jù)量大，除了滿足特定的基因診斷，其他數(shù)據(jù)也可能產(chǎn)生新的研究假設(shè)。

聲明35：研究項(xiàng)目獲得有臨床意義的分子變異結(jié)果需要進(jìn)一步在診斷條件下確證后才可以納入患者的醫(yī)療記錄。

聲明36：研究和診斷的檢測結(jié)果都應(yīng)該建立數(shù)據(jù)庫管理，以便于與本地、區(qū)域性的、國家或國際的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，這有助于對變異進(jìn)行臨床分類。

9. CAGC POI項(xiàng)目NGS測試（Test）的監(jiān)督管理

對于應(yīng)用于CAGC POI臨床實(shí)踐、試驗(yàn)或研究的NGS檢測項(xiàng)目，為高效質(zhì)量的同一性和延續(xù)性，將由CSCO CAGC專家組對所測試的NGS項(xiàng)目進(jìn)行監(jiān)督管理，管理方式包括現(xiàn)場考察、管理文件和流程監(jiān)督、測試樣本的室間評比等。目的是使得參與CAGC POI項(xiàng)目的各個NGS實(shí)驗(yàn)室能夠達(dá)到統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
 

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[13] NCCN臨床實(shí)踐指南：結(jié)直腸癌（2016.V1）

[14] NCCN臨床實(shí)踐指南：乳腺癌（2016.V1）

[15] NCCN臨床實(shí)踐指南：肝癌（2016.V1）

[16] NCCN臨床實(shí)踐指南：胃癌（2016.V1）

[17] NCCN臨床實(shí)踐指南：白血?。?016.V1）

附件：

[1] NGS檢測報告格式化模板

[2] 基因名稱及基因突變的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語（NGS技術(shù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語、NGS數(shù)據(jù)生物信息學(xué)所涉及的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語。中英文對照）

[3] 臨床腫瘤NGS診斷項(xiàng)目（test）的技術(shù)要求和質(zhì)控

[4] CAGC 2015年度啟動會議紀(jì)要