【佳學(xué)基因測序技術(shù)】RNAseq統(tǒng)計程序、軟件數(shù)據(jù)模板：基因檢測機(jī)構(gòu)培訓(xùn)教材

RNA差異化表達(dá)分析的輸入數(shù)據(jù)是基于計數(shù)的統(tǒng)計方法，共享開源軟件如DESeq2、edgeR、limma、voom、DSS、EBSeq和baySeq采用的數(shù)據(jù)是RNA seq或其他高通量測序?qū)嶒?yàn)。這些數(shù)據(jù)需要以整數(shù)值矩陣的形式。矩陣行是基因名稱，矩陣的列是樣本名稱，而數(shù)值是信號讀取值。類似地，對于其他類型的分析，矩陣行可能對應(yīng)于例如結(jié)合區(qū)（具有芯片序列）、細(xì)菌種類（具有宏基因組數(shù)據(jù)集），或肽序列（使用定量質(zhì)譜）。

矩陣中的值應(yīng)為序列讀取/片段計數(shù)。這對于保持DESeq2的統(tǒng)計模型很重要，因?yàn)橹挥杏嫈?shù)才能正確評估測量精度。先進(jìn)不要提供針對測序深度/庫大小預(yù)先標(biāo)準(zhǔn)化的計數(shù)，因?yàn)榻y(tǒng)計模型在應(yīng)用于未標(biāo)準(zhǔn)化計數(shù)時賊為強(qiáng)大，其目的是在內(nèi)部解釋庫大小差異。

在基因檢測和測序機(jī)構(gòu)學(xué)習(xí)如何將測序結(jié)果匹配到參考基因組，并對RNA測序片段進(jìn)行計數(shù)之前，佳學(xué)基因向大家介紹一種先進(jìn)的轉(zhuǎn)錄本（基因表達(dá)）豐度量化方法，比如Salmon、Sailfish、kallisto、和RSEM等方法?？梢栽诓贿M(jìn)行序列匹配的情況下對轉(zhuǎn)錄本序列的表達(dá)進(jìn)行計數(shù)。然后使用tximport軟件包進(jìn)行基因組組裝并生成表達(dá)計數(shù)和偏移矩陣，從而為使用差異基因表達(dá)分析準(zhǔn)備好數(shù)據(jù)。

關(guān)于如何使用Salmon軟件量化轉(zhuǎn)錄本豐度的教程可以參閱佳學(xué)基因的其他基因檢測基因測序技術(shù)文章。佳學(xué)基因建議使用--gcBias來估計RNA-seq數(shù)據(jù)中普遍存在的系統(tǒng)偏差的校正因子。在采用Salmon數(shù)據(jù)處理之后，可以使用tximport構(gòu)建DESeqDataSet。這是佳學(xué)基因?yàn)榛驕y序?qū)W員單位推薦的RNA測序分析流程。

結(jié)合轉(zhuǎn)錄物豐度量化和tximport以產(chǎn)生基因水平計數(shù)矩陣和標(biāo)準(zhǔn)化偏移量的優(yōu)點(diǎn)是：該方法校正了樣本間基因長度的任何潛在變化（例如，同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本）；與基于對齊的方法相比，其中一些方法速度更快，所需的內(nèi)存和磁盤使用量更少；而且可以避免丟棄那些可以與多個具有同源序列的基因?qū)R的片段。請注意，轉(zhuǎn)錄本豐度量詞跳過存儲讀取比對的大型文件的生成，而生成存儲每個轉(zhuǎn)錄本的豐度、計數(shù)和有效長度的較小文件。