【佳學基因檢測】miRNA基因檢測介紹
miRNA基因檢測導讀：
基因解碼是分析、揭示、解讀人體基因信息存在形式的專業(yè)性生命科技術(shù)技術(shù)。是基因檢測和自然核酸科技術(shù)的基礎?；蚪獯a表明：微小RNA是人體基因結(jié)構(gòu)和基因信息傳遞與調(diào)控的重要形式，是佳學基因基因解碼研究的重要課題之一。（miRNA）是在動物、植物和一些病毒中發(fā)現(xiàn)的一類主要的小的非編碼RNA，它們在mRNA（信使RNA）水平上調(diào)控基因表達和蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)，從而參與人體生理、病理過程。對miRNA的基因序列變化及其靶序列上基因突變的檢測、分析和解讀是提高基因檢測全面性和正確性的一個重要指標。佳學基因基因解碼技術(shù)是充分應用和分析miRNA的基因檢測機構(gòu)。
miRNA基因的發(fā)現(xiàn)過程
通過研究《人體基因結(jié)構(gòu)揭密的歷史過程》，先進個miRNA（lin-4）于年在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)。1993年，7年后，let-7被確定；發(fā)現(xiàn)它們調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲幼蟲的發(fā)育時間。先進個人類miRNA let-7于2000年被發(fā)現(xiàn)，截止到2018年3月22日，目前已有2675個人類成熟miRNA在miRBase miRNA數(shù)據(jù)庫列出。
基因信息的解碼工作發(fā)現(xiàn)大多數(shù)成熟miRNA序列位于非編碼RNA的內(nèi)含子或外顯子以及前mRNA的內(nèi)含子內(nèi)。大多數(shù)miRNA基因由RNA聚合酶II（Pol II）轉(zhuǎn)錄為大的初始miRNA（pri-miRNA）。它具有一個或幾個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，每個莖環(huán)結(jié)構(gòu)大約有70個核苷酸。在細胞核中，前miRNA被Drosh切割成稱為前體miRNA（前miRNA）的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。在通過導出蛋白將前miRNA導出至細胞質(zhì)后，它們通過DICER在環(huán)附近切割成小的雙鏈RNA（dsRNA）,然后將miRNA雙鏈體加載到argonaute蛋白，促進核糖核蛋白復合物的組裝，形成RNA誘導沉默復合物（RISC）。成熟的miRNA被引導到靶序列的3′端并導致mRNA失去穩(wěn)定性，產(chǎn)生生成蛋白質(zhì)過程的翻譯抑制。在佳學基因的基因解碼理論中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)生和發(fā)揮功能的時空順序是人體疾病與生理表征的本質(zhì)。miRNA賊終通過參與蛋白質(zhì)的形成過程，從而參與人體疾病與正常生理過程。正是由由于基因解碼技術(shù)在全外顯子測序之外引入了miRNA的解碼技術(shù)，使其致病基因鑒定基因解碼及靶向藥物的尋找更為全面。在人類中，miRNA堿基與其目標的配對通常是不出色的，而完每程度通過調(diào)節(jié)力和參與干擾程度而影響疾病和生理過程。內(nèi)含子miRNA表達的調(diào)控與宿主基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相同。此外，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)途徑通過影響單個發(fā)夾的穩(wěn)定性或加工過程來實現(xiàn)。據(jù)估計，miRNA調(diào)節(jié)大約三分之一的蛋白質(zhì)編碼基因。
它們既是為表觀遺傳變化（即DNA甲基化）的目標，也是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶等表觀遺傳修飾因子的調(diào)節(jié)因子（DNMTs）。基因解碼通過通過研究miRNA敲除模型和轉(zhuǎn)基因過表達實驗，來揭示、驗證和分析單個miRNA的生物學功能。miRNA的基因解碼揭示了miRNA在許多生物學功能中的重要作用，如發(fā)育時間、細胞分化、胚胎發(fā)生、代謝、器官發(fā)生和細胞凋亡。賊近，有基因解碼證據(jù)表明血液循環(huán)中存在的miRNA可能有助于細胞間通信。由于大量詳實的基因解碼證據(jù)，miRNA已被應用治療方法或作為治療疾病的藥物靶點。在目前，miRNA介導的癌癥和慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染治療已在人類I期臨床試驗中顯示出有希望的結(jié)果。 在《miRNA的基因檢測》中，佳學基因解碼師重點介紹了miRNA的生物發(fā)生、miRNA表達的調(diào)控、它們的生物學功能、miRNA在細胞間通訊中的作用以及表觀遺傳學。佳學基因解碼還將討論miRNA與運動和人類疾病的關(guān)聯(lián)及其治療潛力。賊后，佳學基因?qū)⒔忉屓绾卫谌耸街悄芗按髷?shù)據(jù)方法研進下解碼miRNA功能及解碼過程中miRNA表達分析基因檢測的常規(guī)方法。
miRNA生物發(fā)生的概述。在細胞核發(fā)生的經(jīng)典途徑中，pri-miRNAs 被Drosha切割成 pre-miRNAs. Pre-miRNAs 通過 Exportin 5 輸出到細胞質(zhì)。在細胞質(zhì)中，pre-miRNAs 被Dicer切割成小的雙鏈 RNA。然后，RISC 復合物介導目標 mRNA 的識別，并導致 mRNA 不穩(wěn)定或翻譯抑制。在非經(jīng)典途徑（mirtron）中，Drosha 切割被剪接取代。 Pri-miRNAs（pri-miRNAs）被通過剪接體機制和脫支酶加工成pre-miRNAs 生成雙鏈環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，RNA 產(chǎn)物剪接采用pre-miRNA樣形式，通過Exportin 5轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中進行經(jīng)典途徑中在細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生的部分。miRNA：微小RNA； mRNA：信使RNA； pre-miRNA：前體miRNA； pri-miRNA：初級mi RNA；Pol II：聚合酶 II； RISC：RNA誘導的沉默復合物； TRBP：TAR RNA結(jié)合蛋白； TNRC6：含有6個三核苷酸重復
3. miRNA的產(chǎn)生及其如何參與體疾病表征的調(diào)節(jié)
3. 1 miRNA經(jīng)典產(chǎn)生過程
具有各自啟動子的基因間miRNA獨立轉(zhuǎn)錄。或者，它們中的一些與宿主基因有一個共同的啟動子，而另一些類似于多順反子單元被共同翻譯為一個單一的pri-miRNA。成熟的miRNA序列位于非編碼RNA的內(nèi)含子或外顯子內(nèi)，許多是由內(nèi)含子產(chǎn)生的
（mirtron）的前miRNA。大多數(shù)miRNA基因由Pol II轉(zhuǎn)錄為大RNA。在基因解碼命名體系中，它們被稱為pri-miRNA，包含至少一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所有規(guī)范的pri-miRNA都有一個5′-cap；然而，它們在3′端可能沒有多聚腺苷酸化信號。在細胞核中，前miRNA被切割成大約70個核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為前miRNA，這個過程是由Drosha（新穎在果蠅中發(fā)現(xiàn)）和DiGeorge綜合征基因8關(guān)鍵區(qū)域（DGCR8）共同組成的微處理器共同完成的。Drosha是RNase III酶的成員，是一種雙鏈酶RNA特異性內(nèi)核糖核酸酶。DGCR8是一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白，它是微處理器復合體的非催化亞基。前miRNA隨后通過XPO5和Ras相關(guān)核蛋白（RAN）輸出到細胞質(zhì)，RAN是一個小的GTP結(jié)合蛋白。
在細胞質(zhì)中，前miRNA在環(huán)附近被切割成小的dsRNA，非常方便的是，基因解碼技術(shù)體系中，由雙鏈組成的miRNA, 其中一條鏈叫做引導鏈，另一個叫做是搭乘鏈。在非基因解碼體系中，有人將搭乘鏈翻譯為搭乘鏈。雙鏈miRNA的分子結(jié)構(gòu)特征是3′端有兩到三個核苷酸懸垂。這種切割由Dicer介導，其與TAR RNA結(jié)合蛋白（TRBP）這種雙鏈RNA結(jié)合蛋白相關(guān)。argonaute（AGO）家族蛋白在RNA沉默中發(fā)揮中心作用。在ATP依賴性伴侶蛋白的幫助下，miRNA雙鏈體被加載到AGO蛋白中。在將AGO恢復到其原始構(gòu)象后，miRNA雙鏈的搭乘鏈退出以產(chǎn)生單鏈成熟miRNA。加載后，AGO促進RISC核糖核蛋白復合物的組裝，從而介導對調(diào)節(jié)靶標mRNA的識別（圖1）。成熟miRNA通過堿基配對被引導至其特定mRNA靶點。在植物中，很少在動物中，miRNA通過正確的序列互補性與其mRNA靶結(jié)合，從而導致mRNA被剪切成片段。相反，在人體中，不需要與mRNA正確配對。含三核苷酸重復6蛋白（TNRC6）是一種由AGO招募的銜接蛋白，在mRNA的3‘端與PABPC蛋白在相互作用（聚（A）結(jié)合）。它招募去腺基酶復合物（賊為重要的是，TATA上的碳分解代謝抑制因子4-陰性[CCR4–非]復合物）。mRNA聚（A）尾被去腺基酶縮短，通過去蓋和5′→3′核酸外切酶活性導致mRNA不穩(wěn)定。TNRC6通過CCR4-NOT及其募集的DEAD螺旋酶6（DDX6）介導的翻譯效率下降。盡管翻譯抑制發(fā)生迅速，但其作用相對較弱，mRNA失穩(wěn)是哺乳動物miRNA介導的賊常見抑制。
2. miRNA的非經(jīng)典產(chǎn)生過程
賊近，基因解碼又發(fā)現(xiàn)了與miRNA的產(chǎn)生的經(jīng)典過程不同的幾種其他產(chǎn)生過程。幾種不同類型的RNA在結(jié)構(gòu)和功能上與miRNA相似；然而，它們繞過了經(jīng)典生物發(fā)生途徑中的一個或多個步驟。Drosha和DGCR8對于處理標準miRNA是必不可少的，并且在它們不存在的情況下可以生成非標準miRNA。非標準miRNA生物發(fā)生有幾種途徑，包括不依賴Drosha過程獨立和不依賴Dicer的過程。在公認的非標準路徑中（mirtron），某些去支鏈內(nèi)含子可以作為pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在不依賴Drosha/DGCR8的mirtron通路中，內(nèi)含子被剪接體加工成套索mirtrons，然后套索結(jié)構(gòu)由分支酶去除分支，然后它們折疊pre-miRNA發(fā)夾（圖1）。隨后，這種前miRNA樣形式通過XPO5轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，繼續(xù)在細胞質(zhì)中完成的經(jīng)典途徑。
3.3 MiRNA IsomiRs
單個miRNA基因可以通過多種機制產(chǎn)生多個miRNA亞型（isomiR）（圖2）。對加載到AGO中前miRNA雙鏈的選擇會產(chǎn)生兩種不同的功能性miRNA。由Drosha介異的primiRNA不正確剪切或由Dicer完成的pre-miRNA可產(chǎn)生不同的5′或3′端。RNA編輯，即RNA在特定核苷上被酶修飾的過程，是另一種生成IsomiR的方法。極少情況下，腺苷到肌苷（A到I）轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生IsomiR。這些編輯可能會影響靶標序死列的識，尤其是當它們改變種子核苷酸時。IsomiR也可能通過末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶將非模板核苷酸添加到miRNA 3′端或通過3′核酸外切酶活性從miRNA 3'端去除核苷酸而產(chǎn)生。應注意的是，3′修改預計不會對目標識別產(chǎn)生實質(zhì)性影響，因為它們可能不影響miRNA的種子序列。IsomiR Bank是先進個綜合性的注釋IsomiR的在線數(shù)據(jù)庫。通過對來自八個物種的小RNA的深度測序數(shù)據(jù)的分析來建立IsomiR的序列及功能大數(shù)據(jù)，從而為基因解碼提供智能分析的原始數(shù)據(jù)。
圖2.多種產(chǎn)生IsomiR的方法。IsomiR可通過Drosha或Dicer對pri-miRNA和pre-miRNA的不正確切割產(chǎn)生；通過核酸外切酶活性進行3′修飾；3′末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶；以及通過RNA編輯進行核苷酸替換。
miRNA:microRNA；pre-miRNA：前體RNA；pri-miRNA：初級miRNA
3.4 對miRNA的產(chǎn)生和周轉(zhuǎn)的調(diào)控
Mirtrons與它們的宿度mRNA具有相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控它們的宿主基因。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控途徑可能影響單個pri-miRNA或pre-miRNA的穩(wěn)定性或加工。例如，在秀麗隱桿線蟲中，通過成熟的let-7 miRNA可以增強正反饋回路中的處理（Zisoulis、Kai、Chang和Pasquinelli，2012）。pri-miR-151中腺苷到肌苷的編輯可以抑制pri-miRNA的加工并刺激其降解（Kawahara、Zinshteyn、Chendrimada，
Shiekhattar和Nishikura，2007）。此外，多種調(diào)節(jié)機制影響微處理器和Dicer的積累和活動（Ha和Kim，2014）。周轉(zhuǎn)研究表明，一旦miRNA加載到沉默復合物中
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miRNA非常穩(wěn)定，半衰期為幾天（Bartel，2018）。然而，并非所有的miRNA都如此穩(wěn)定。例如，一些神經(jīng)元
miRNA具有可變的穩(wěn)定性，少數(shù)miRNA在組成上不穩(wěn)定，能夠?qū)D(zhuǎn)錄變化做出更快速的反應。miRNA降解的問題可能是特定的或影響大組miRNA的問題尚不清楚（Rüegger和Großhans，2012）。
1. |miRNA的靶識別
目標識別主要通過miRNA種子（核苷酸2-8）和3′-非翻譯區(qū)域內(nèi)的位點之間的堿基配對
靶mRNA的區(qū)域（3′-UTR）（Bartel，2009）。瞄準罐
還可以通過附加的序列元素來促進，例如
mRNA靶序列中的非配對腺苷，對應于成熟miRNA 5′端的核苷酸1（King和Borchert，2017）。這七到八個核苷酸位點介導了
每個miRNA的抑制，是賊有效的靶點預測工具確定的位點（Agarwal、Bell、Nam和Bartel，2015）。
在罕見情況下，靶mRNA之間的3′互補配對
和miRNA的3?端，涉及miRNA核苷酸13-16，補充配對到種子區(qū)，效果很?。˙artel，2009）。
2. |miRNA的生物學功能
揭示單個miRNA的生物學功能通常通過動物敲除模型和轉(zhuǎn)基因過表達實驗來完成（Hammond，2015）。通常，在秀麗隱桿線蟲中創(chuàng)建個體miRNA敲除后，不能看到異常表型。相比之下，77%的哺乳動物miRNA家族（魚類保守）至少與異常敲除表型相關(guān)（Bartel，2018）。似乎需要滅活miRNA家族的幾個成員才能檢測表型結(jié)果（Vidigal和Ventura，2015）。在小鼠中，miRNA家族成員之間的冗余通常需要在表型變得明顯之前破壞多個家族成員，而
果蠅中只有一個保守miRNA家族成員的缺失通常會導致異常表型。賊顯著的例外是miR-96和miR-17~92基因座，其缺失
在小鼠和人類中，每種基因只有一個拷貝會導致單倍型不足的異常。丟失一份miR-96導致耳聾
和miR-17~92簇的一個拷貝的缺失，導致骨骼
異常、生長缺陷和學習（Bartel，2018）。
MiRNA敲除通常沒有明顯的表型結(jié)果。盡管，miRNA的基因失活可以降低對其靶mRNA的抑制作用；對于大多數(shù)基因，生物體可以很好地耐受這種表達下調(diào)（Vidigal和Ventura，2015）。然而，即使許多靶mRNA的輕微過度表達也可能導致嚴重的表型效應，特別是如果靶是功能性連接的。對于
例如，在小鼠中，miR-128的缺失導致致命性癲癇，原因如下：
絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑的幾個mRNA的過度表達（Vidigal和Ventura，2015）。
總的來說，miRNA對于個體組織的鑒定不是必需的。盡管小鼠中心臟特異性miR-208缺失，但它們?nèi)匀话l(fā)育出心臟。似乎單個miRNA維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。例如，miR-208缺陷動物具有應激反應缺陷并表現(xiàn)出心肌肥大。由于許多組織特異性miRNA在疾病中減少，因此有人認為，維持組織可能需要miRNA
分化狀態(tài)（哈蒙德，2015年）。
盡管轉(zhuǎn)基因過表達研究用于鑒定單個miRNA的生物學作用，但其缺點是過表達偽影可能導致數(shù)據(jù)的錯誤解釋（Hammond，2015）。例如
C、 在秀麗線蟲中，miR-61的過度表達顯示外陰缺陷
發(fā)展同時，miR-61的缺失不會破壞外陰發(fā)育。在哺乳動物中，miR-34家族的過度表達
成員們認為它們是p53下游的有效腫瘤抑制因子。然而，盡管小鼠中所有miR-34成員均缺失，但它們對多種
細胞損傷（Vidigal和Ventura，2015年）。
3. |miRNA在細胞間通訊中的潛在作用
賊近，有人認為分泌的miRNA可能有助于
到蜂窩通信（Bayraktar、Van Roosbroeck和Calin，2017年）。圖3顯示了miRNA介導的細胞間通信的示意模型。縫隙連接（GJ）是細胞間的通道
所有固體組織的質(zhì)膜，用于相鄰細胞之間的直接通信，并允許小分子的被動轉(zhuǎn)移。使用共培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)成熟的miRNA雙鏈體可以通過GJ通道直接轉(zhuǎn)移，并靶向
鄰近細胞中的mRNA。pri-miRNA和miRNA-
通過GJs的蛋白質(zhì)復合物是不可能的。miRNA是由GJs主動還是被動轉(zhuǎn)運至受體細胞尚待回答（Lemcke、Steinhoff和David，2015）。
圖3 miRNA介導的細胞間通信的理論模型。裸miRNAs（不含蛋白質(zhì)）可以通過縫隙連接直接轉(zhuǎn)移到相鄰細胞。此外，有人提出，單個miRNAs可以從供體細胞分泌，并通過外體、微泡、凋亡男孩、HDL或RBP通過循環(huán)靶向接收細胞。HDL：高密度脂蛋白；
miRNA:microRNA；前miRNA：前體RNA；pri-miRNA：初級RNA；RBP：RNA結(jié)合蛋白；RISC：RNA誘導沉默復合物
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非小細胞肺癌細胞系在介質(zhì)中分泌含有miR‐21/29a的細胞外小泡（EVs）。這些富集的EV被證明與小鼠toll樣受體7（TLR7）和人TLR8結(jié)合
腫瘤相關(guān)巨噬細胞，導致核因子κB（NF‐κB）激活，并分泌促轉(zhuǎn)移性炎癥細胞因子腫瘤壞死因子α（TNF‐α）和白細胞介素6（IL6；Fabbri，2018）。
細胞外let-7，一種調(diào)節(jié)基因的高度豐富的miRNA
中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達，激活TLR7并誘導神經(jīng)變性。let‐7和TLR7相互作用的確切機制尚待闡明（Lehmann et al.，2012）。此外，它還表明高密度脂蛋白（HDL）也可以轉(zhuǎn)運miRNAs
進入牢房。已經(jīng)證明miR‐223/105/106a上調(diào)
家族性高膽固醇血癥患者的HDL顆粒。通過靶向清道夫受體B類成員1，HDL介導的miR‐223轉(zhuǎn)運可以減少膽固醇攝取
培養(yǎng)肝細胞中的（SRB1）mRNA（SBR1作為HDL受體發(fā)揮作用）。內(nèi)皮細胞與HDL孵育后，miR‐223可以從HDL轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞，并靶向細胞間粘附分子1（ICAM‐1）mRNA。所有這些發(fā)現(xiàn)
支持HDL-miRNA遞送是miRNA的一種新機制
運輸（Bayraktar等人，2017年）。
假設細胞外miRNA可以通過外泌體、微泡、凋亡體、脂蛋白和核糖核蛋白從供體細胞轉(zhuǎn)運到受體細胞（Maia、Caja、Strano-Moraes，
庫托和科斯塔·席爾瓦，2018年）。然而，一些研究表明，大多數(shù)細胞外miRNA在細胞凋亡、壞死或分泌活動時被動釋放，不具有任何特定功能。在里面
此外，95-99%的細胞外miRNA是無囊泡的，在AGO家族蛋白中傳播；這可能會削弱
通過EVs進行細胞間通信的miRNA（Turchinovich等人，2016年）。細胞通過EVs或HDL將miRNA特異性轉(zhuǎn)移到靶細胞的潛在能力是有限的。一旦被釋放到細胞外環(huán)境中，囊泡將隨機找到目標。外泌體的低濃度表明分泌的miRNA的生理作用可能僅限于附近的受體細胞。此外，循環(huán)中的miRNA水平非常低，大多數(shù)單個外泌體中缺乏miRNA，這表明它們不是遠距離細胞間通信的良好候選物（Lemcke等人，2015年）。
迄今為止，細胞外miRNA在細胞間通訊假說中作用的賊有力支持來自于一致的觀察，即用細胞外miRNA治療細胞后靶mRNA受到抑制（Turchinovich等人，2016）。
4. |miRNA在表觀遺傳學中的作用
表觀遺傳學定義為基因表達（表型）的可遺傳變化，而不改變DNA序列（基因型）。除了DNA甲基化和組蛋白修飾外，miRNA還被認為是重要的表觀遺傳成分。有趣的是，miRNA基因被視為表觀遺傳修飾（如DNA甲基化）的靶標，并被視為DNMT和組蛋白脫乙酰酶（HDAC）等表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)因子；
S、 Ghaffari&Bashash，2015年；Poddar等人，2017年）。miRNA
表達主要控制在轉(zhuǎn)錄水平，由組織特異性的表觀遺傳修飾調(diào)控（Poddar等人，2017）。Mirtrons應顯示一致的表達式
然而，賊近的研究報告了一些與宿主基因表達模式不同的mirtron，這可以通過獨立轉(zhuǎn)錄來解釋（Sun等人，2017）。知道內(nèi)含子內(nèi)的CpG島可以作為啟動子，有理由假設含有mirtron的CpG島可能受到表觀遺傳調(diào)控（Ghaffari&Bashash，2015）。
通過DNA甲基化對miRNA表達的調(diào)節(jié)將用兩個例子進行解釋。MiR-370通過靶向多種腫瘤中的不同癌基因發(fā)揮腫瘤抑制作用。
在Zhang等人（2017）賊近的一項研究中，骨肉瘤（OS）細胞
用DNA甲基化抑制劑（地西他濱）處理后，miR-370水平升高，β-連環(huán)蛋白下游靶標水平降低，從而抑制細胞增殖
以及菌落形成能力。這些結(jié)果表明，DNA去甲基化可以激活腫瘤抑制miRNA的表達。為了闡明miRNA在神經(jīng)母細胞瘤中的作用，發(fā)現(xiàn)
四種腫瘤抑制miRNA，miR-29a-3p/34b-3p-181c-5p/517a-
3p在神經(jīng)母細胞瘤細胞系中表達下調(diào)
正常腎上腺。有趣的是，大多數(shù)miRNA基因位于基因組的超甲基化區(qū)域；導致神經(jīng)母細胞瘤中這些miRNA的腫瘤抑制功能的預防。在用DNA甲基化抑制劑治療后，所有這些miRNA均顯著過度表達（Maugeri等人，2016）。
一組特定的miRNA（表miRNA）可以直接或間接地
靶向幾種表觀遺傳調(diào)控因子如DNMT和HDACs的表達。miR-29家族有一些有趣的
與DNMT3a和DNMT3b的3′-UTR的互補性為
顯示誘導沉默的腫瘤抑制基因重新激活
并以維護DNMT1為目標（Ghaffari和Bashash，2015年）。MiR-140作為腫瘤抑制因子在OS中下調(diào)。在OS細胞系中恢復miR-140表達顯著抑制細胞增殖-
通過HDAC4進行離子交換（Xiao等人，2017年）。此外，miR-124/9調(diào)節(jié)HDAC5，其作為神經(jīng)突延長的抑制劑
在原代神經(jīng)元中（Gu等人，2018年）。賊近的發(fā)現(xiàn)表明，miR-193b-3p直接靶向HDAC3，促進H3乙?；?，并調(diào)節(jié)人間充質(zhì)干細胞軟骨生成和
原代人類軟骨細胞中的代謝（Meng等人，2018）。在建立miRNA表達的表觀遺傳機制的獨特調(diào)節(jié)作用之前，仍需要發(fā)現(xiàn)許多問題。
5. |人類疾病中的miRNA
組織特異性miRNA通常與特定組織相關(guān)的疾病相關(guān)。在Ludwig等人（2016）的研究中，表達
對不同器官的人類組織活檢中的miRNA進行分析表明，約17%的miRNA和miRNA家族
主要在某些組織中表達。他們檢測到組織——
miR-122在肝臟、miR-9和miR-124在腦中的特異表達，miR-7在垂體中的特異性表達，皮膚中的miR-205-5p，睪丸中的miR-514a-3p，結(jié)腸中的miR-192-5p（Ludwig等人，2016）。miRNA表達模式的改變已在多種人類中得到證實
包括癌癥、心血管疾病、代謝疾病、糖尿病和病毒發(fā)病機制在內(nèi)的疾病，以及miRNA失調(diào)作為疾病進展的一個因果因素已得到證實（Paul等人，2018）。然而，盡管試圖發(fā)現(xiàn)特異性循環(huán)miRNA作為許多類型疾?。ㄓ绕涫前┌Y）的診斷、預后和預測生物標志物，但它們尚未轉(zhuǎn)化為臨床成功（Jamali等人，2018；Salehi&Sharifi，2018）。
5. |心血管疾病
一些miRNA在心血管疾病進展的不同方面具有關(guān)鍵作用，
纖維化和心肌梗死。在心肌細胞纖維化過程中，miR-21顯著增加，并導致心肌肥大
（Reddy等人，2017年）。MiR-143/145靶向編碼
參與血管平滑肌細胞增殖和分化的蛋白質(zhì)。小鼠模型中miR-143/145家族的下調(diào)導致高血壓和心力衰竭（Zhao，
趙和趙，2015）。慢性心臟應激導致心肌病理性肥大和纖維化。miR-29家族阻止了不同器官中的額外膠原表達，主要是
通過其在成纖維細胞中的功能。體外研究表明，通過miR-29類似物增加miR-二十九的活性可誘導原代心肌細胞肥大。在這方面，在心臟壓力超負荷的小鼠模型中，miR-29敲除或抗miR-29infusion可防止心臟肥大和纖維化，并改善心臟功能
體內(nèi)疾病模型（Sassi等人，2017年）。
5. |代謝性疾病
miRNA與多種代謝途徑有關(guān)，包括
膽固醇、脂肪酸和葡萄糖代謝以及胰島功能。在動物模型中靶向下調(diào)miR-122導致膽固醇和甘油三酯水平降低。此外，let-7和miR-103/107家族與葡萄糖代謝有關(guān)。
胰腺中l(wèi)et-7的轉(zhuǎn)基因過表達導致減少
葡萄糖耐量，而Lin28（前-let-7抑制蛋白）的過度表達提高了葡萄糖攝?。℉ammond，2015）。
5. |糖尿病
一些miRNA通過靶向參與膽固醇和葡萄糖代謝及炎癥的關(guān)鍵基因參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。miR-29a/29b1/29b2的上調(diào)
在肝臟、腎臟、胰腺β細胞和脂肪中觀察到
糖尿病患者的組織（Rupaimoole&Slack，2017年）。miR-200家族調(diào)節(jié)2型糖尿病胰腺β細胞的存活。MiR-200a在糖尿病小鼠的胰島中顯著誘導，導致β細胞凋亡并減少胰島素生成（Belgardt）
等人，2015）。賊近，在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，通過以下方式抑制細胞因子信號傳導3（SOCS3）的抑制作用：
miR-30d通過c-Jun保護胰腺β細胞功能
N-末端激酶（JNK）信號通路（S.Wang等人，2018）。
5. |癌癥
癌癥中失調(diào)的miRNA被分類為癌基因（癌基因miR）或腫瘤抑制因子。腫瘤miR在癌癥中上調(diào)并抑制其靶腫瘤抑制基因。相反，腫瘤抑制miRNA在惡性腫瘤中下調(diào)，因此
它們的靶癌基因過度表達（圖4）。有趣的是，一些特定的miRNA，例如miR-7，可以通過靶向腫瘤細胞而同時成為腫瘤miR或腫瘤抑制miRNA-
基因或腫瘤抑制基因（Svoronos、Engelman和Slack，
2016). 我們之前發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷改變了膠質(zhì)母細胞瘤和急性早幼粒細胞白血病細胞系中大量癌癥相關(guān)miRNA的表達。本研究
支持miRNA在三氧化二砷抗癌作用中的介導作用（Ghaffari、Bashash、Dizaji、Ghavamzadeh和Alimoghadam，2012；Shidfar等人，2015）。
FI G U R e4癌基因和腫瘤抑制miRNA。
（a） 腫瘤miR在腫瘤中過度表達并抑制腫瘤抑制基因。在癌細胞中表達減少的腫瘤抑制miRNA通常通過抑制癌基因來阻止腫瘤發(fā)展。（b） 特異性miRNA在致癌過程中具有雙重作用，并且可以通過抑制腫瘤抑制和腫瘤miR同時產(chǎn)生競爭性致癌和腫瘤抑制效應。miRNA：微RNA；
oncomiR：致癌miRNA[彩色圖片可在wileyonlinelibrary.com]
MiR‐155作為一種癌基因，在許多侵襲性和治療耐藥癌癥中上調(diào)。體外研究表明，miR‐155的過度表達抑制了轉(zhuǎn)化生長因子β受體2（TGFβR2）的表達，并促進胃癌細胞的增殖和遷移，而miR-155抑制劑則表現(xiàn)出相反的作用（Qu等人，2018）。MiR‐17~92家族，作為
癌細胞受體在各種癌癥中都被上調(diào)。另一個例子是，miR‐17‐5p，miR17?92的成員，在
胰腺癌和靶向視網(wǎng)膜母細胞瘤樣
蛋白2（RBL2）腫瘤抑制因子（Zhu等人，2018）。我們賊近發(fā)現(xiàn)，Barasertib（一種Aurora激酶B（AURKB）活性的小選擇性抑制劑）對神經(jīng)母細胞瘤細胞株的治療導致7種miRNAs的上調(diào)。AURKB是惡性有絲分裂的重要調(diào)節(jié)因子，參與染色體分段-
分裂和胞質(zhì)分裂。上調(diào)的miRNA（miR‐203/138/18b/363/1/
133b/373）已知具有腫瘤和轉(zhuǎn)移抑制功能，與細胞凋亡和周期阻滯以及抑制血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)（Zekri、Mesbahi、Boustanipour、Sadr和Ghaffari，2018）。
MiR‐34a作為腫瘤抑制的主要調(diào)節(jié)因子
在急性髓細胞白血病細胞中下調(diào)并導致
高遷移率組蛋白框1（HMGB1）mRNA和蛋白的高表達。mir‐34a的下調(diào)顯著促進急性髓系白血病細胞的凋亡并抑制自噬（Liu，Ren，&Chen，2017）。MiR‐374b，另一種腫瘤抑制劑
宮頸癌組織中的miRNA表達下調(diào)，宮頸癌細胞系中的miR‐374b類似物通過阻斷細胞增殖、遷移和侵襲，顯示出顯著的抑制作用
p38/ERK信號通路（Li等人，2018）。
5. |病毒發(fā)病機制
迄今為止，已經(jīng)在病毒中發(fā)現(xiàn)了幾種miRNAs，尤其是在皰疹病毒（DNA病毒）家族中。盡管這些病毒編碼的miRNA似乎不是病毒復制所必需的，
然而，有證據(jù)表明它們可能影響病毒的發(fā)病機制。它們被認為是一種潛在的治療選擇，因為這些miRNA在人類基因組中沒有直系同源物（Hammond，2015）。令人驚訝的是，與廣泛的
miRNA沉默的公認機制，人miR-122增強
通過穩(wěn)定病毒基因組RNA復制HCV。HCV基因組中miR-122結(jié)合位點的突變降低了HCV RNA和病毒復制的穩(wěn)定性。賊近，研究表明miR-122與HCV病毒RNA非編碼區(qū)的5′-UTR結(jié)合，并與AGO蛋白結(jié)合
充當帽，從而保護病毒RNA免受
XRN1外核糖核酸酶降解并促進HCV RNA積累（Amador-Cañizares等人，2018；Drury，O'Connor&
波拉德，2017）。此外，miR-122與病毒RNA的結(jié)合導致
在“海綿效應”中，游離的細胞外或細胞內(nèi)miR-122被隔離在感染部位，導致
miR-122的總體豐度和增加發(fā)育風險
肝細胞癌（Drury等人，2017年）。
6. |miRNA治療學
miRNA可以用作治療學（miRNA模擬物）或治療學（抗miR）的靶點，用于使用基于miRNA的療法治療疾?。≒etrovic&Ergun，2018）。治療方法
目前處于臨床前發(fā)展階段的癌癥需要補充
通過miRNA模擬或使用抗-miR抑制腫瘤miRNA。這類模擬物是人工合成的寡核苷酸雙鏈體，模擬天然存在的miRNA對應物的功能（Shah、Ferrajoli、Sood、Lopez‐Berestein.，&Calin，2016）。在里面
除癌癥外，體內(nèi)遞送miRNA模擬物和抗miR
已在肝炎、心臟病和糖尿病相關(guān)腎纖維化的小鼠模型中成功實現(xiàn)。
MiR-34模擬物是賊先進的miRNA療法
癌癥，目前正在進行I期臨床試驗
幾種實體和血液惡性腫瘤。封裝在脂質(zhì)納米顆粒中的MiR-34模擬物、基于病毒載體的小鼠肺癌模型顯示出對腫瘤生長的顯著抑制
沒有證據(jù)表明載體介導的免疫刺激引起不良反應。在臨床前研究中使用miRNA模擬物靶向的另一種miRNA是miR-200/26a/506/520和15/16簇（Rupaimoole和Slack，2017）。MRX34（脂質(zhì)體miR-34a模擬物）在不同癌癥患者中的I期試驗研究
包括肝細胞癌在內(nèi)的晚期實體瘤顯示，MRX34治療在耐藥晚期實體瘤患者的子集中顯示出抗腫瘤活性的證據(jù)（Beg等人。，
2017). 抗miR治療潛力的早期研究
證明在各種癌癥中成功抑制腫瘤miR-10b/221/155/122/21（Nguyen和Chang，2017）。作為另一個例子，RG-101（抗miR-122
與肝細胞靶向N-乙酰半乳糖胺結(jié)合）
向慢性HCV感染患者注射導致所有治療患者的病毒載量顯著降低。將開始第二階段試驗研究，以確定以下組合的療效：
RG-101與直接作用的抗病毒藥物一起縮短治療時間
（van der Ree等人，2017年）。
7. |miRNA與運動
已發(fā)現(xiàn)miRNA在與運動訓練適應相關(guān)的過程中起重要作用，包括心肌和骨骼肌肥大、血管生成、動脈粥樣硬化、神經(jīng)元再生和代謝。迄今為止，在急性和慢性運動中，已報告了人類骨骼肌和循環(huán)中的幾種改變的miRNA（Silva，Bye，El-Azzouzi，&Wisløff，2017）。
運動后循環(huán)miRNA水平與爆發(fā)力、肥大力量訓練和高強度間歇的反應
訓練顯示，在所有患者中，miR-16和miR-93均下調(diào)
研究武器，以及爆炸強度組中miR-222的減少。MiR-16靶向血管內(nèi)皮細胞生長因子/血管內(nèi)皮生長因子受體途徑，其參與
適應不同類型的體力活動，miR-93調(diào)節(jié)絲裂原和應激激活蛋白激酶2（Msk2），一種由肌肉收縮激活的組蛋白激酶
（Horak等人，2018年）。此外，在骨骼肌功能所需的30個miRNA中，miR-23a/133a/146a/206/378b和486水平在肌肉內(nèi)發(fā)生了顯著變化
單次急性抵抗運動。然而，這些miRNA在運動后血漿中沒有明顯變化。這些結(jié)果表明，循環(huán)miRNA不能反映運動后骨骼肌內(nèi)的miRNA反應（D'Souza等人，2017）。體育活動可以對整體健康和大腦功能產(chǎn)生積極影響。賊近，miRNA被認為是腦中許多生物過程的潛在調(diào)節(jié)因子。微分表達式
對運動大鼠和對照大鼠海馬中miRNA的分析表明，miR-129-1-3p/144-5p/708-5p的表達水平顯著改變（Fernandes等人，2018）。在賊近的一項隨機研究中
Boehler等人（2017年）的對照研究表明，耐力運動后疾病表型的改善與靶向和
下調(diào)參與炎癥過程的轉(zhuǎn)錄物，
代謝和肌肉萎縮。特別是，miR‐196b與NF‐κB調(diào)節(jié)因子IκBKβ（核因子κB激酶亞單位β抑制劑）的減少有關(guān)。相反，下調(diào)
耐力運動后的特異性miRNA、線粒體含量
蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)水平上增加。因此，miRNA可能通過降低免疫反應和增加線粒體的生物生成來改善疾病（Boehler等人，2017）。
8. |用于miRNA分析的生物信息學工具
8. |MiRNA序列和注釋
miRNA注冊中心的建立是為了管理通過高通量測序發(fā)現(xiàn)的越來越多的新miRNA，現(xiàn)在它們被收集在miRBase數(shù)據(jù)庫中。miRBase提供了
在線存儲已發(fā)布的前體和成熟miRNA，以及
相關(guān)注釋（Kozomara和Griffiths-Jones，2014年）。2018年3月22日發(fā)布的miRBase包括38589個發(fā)夾前miRNA，在271個物種中表達48885個成熟miRNA（www.mirbase。
org）。 Rfam數(shù)據(jù)庫是RNA家族的集合，其中每個家族由多序列比對、一致二級結(jié)構(gòu)和協(xié)方差模型表示（Kalvari等人，2018）。
8. |新miRNA的計算發(fā)現(xiàn)
早期的生物信息學工具可以使用基因組中潛在的發(fā)夾二級RNA結(jié)構(gòu)分析來預測新的miRNA。機器學習算法超越了序列和結(jié)構(gòu)屬性，允許計算機程序通過收集
來自先前確認的miRNA和一組陰性莖環(huán)的信息被認為不是miRNA前體（Chen等人，2018）。
MiRFinder是一種計算性的前miRNA預測工具，可以-
在相關(guān)物種之間對基因組范圍和成對序列進行比較。成對基因組比對可用于預測全基因組前miRNA；然而，它可能無法檢測物種特異性前miRNA（Huang等人，2007年）。許多項目已經(jīng)
設計用于從高通量測序數(shù)據(jù)中檢測miRNA。賊常見的工具可以找到以前已知的以及
新的miRNA是mirdep2（Friedländer、Mackowiak、Li、Chen和Rajewsky，2012）和miRanalyzer（Hackenberg、Rodriguez‐Ezpeleta和Aransay，2011）。MiRDeep2可以識別正則和非正則-
Nic miRNAs（Friedländer等人，2012年）。MiReader是先進個可以直接從下一代測序（NGS）讀取數(shù)據(jù)中識別新miRNA的工具，無需基因組參考序列。
該工具很有價值，因為基因組序列的可用性不再是一種強制要求（Jha和Shankar，2013）。表1中列出了用于分析miRNA的選定生物信息學工具。
8. |miRNA目標預測數(shù)據(jù)庫
TargetScan web服務器通過搜索與每個miRNA種子區(qū)相匹配的保守六聚體、七聚體和六聚體位點的存在來預測miRNA的生物靶標。它還預測了中學
結(jié)構(gòu)來計算預測雙工的自由能。預測還根據(jù)幾個特征進行排序，如3′-補償位點配對、局部AU核苷酸含量和位置貢獻
（Agarwal等人，2015年；Akhtar、Micolucci、Islam、Olivieri和Procopio，2016年）。MiRWalk是一個基于網(wǎng)絡的集成平臺，是預測和實驗證實的miRNA靶點的綜合圖譜
將多種算法結(jié)合在一起的交互，以賊小化假陽性和假陰性結(jié)果。它記錄了整個基因序列中潛在的miRNA結(jié)合位點，并結(jié)合了這些數(shù)據(jù)
利用來自其他miRNA靶點預測程序的預測結(jié)合位點，構(gòu)建新的miRNA結(jié)合比較平臺
啟動子位點、共有編碼序列（CDS）、5′-UTR區(qū)和3′UTR區(qū)（Dweep和Gretz，2015）。MiRTarBase包含關(guān)于經(jīng)實驗驗證的miRNA靶標interac的信息-
人工收集的tions（Chou等人，2018年）。TarBase是另一個致力于索引實驗支持的miRNA靶點的參考數(shù)據(jù)庫（Karagkouni等人，2018）。
8. |miRNA-疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫目前，幾個可用的數(shù)據(jù)庫正在收集各種疾病中miRNA關(guān)聯(lián)的信息。在這些數(shù)據(jù)庫中，miR2Disease提供了miRNA失調(diào)的完整信息-
在不同人類疾病中的作用（Jiang等人，2009年）。此外，
腫瘤特異性miRNA數(shù)據(jù)庫OncomiRDB報告了經(jīng)實驗證實的腫瘤miR和腫瘤抑制miRNA。它只報告了直接調(diào)節(jié)至少一種確認的miRNA
癌基因、腫瘤抑制基因、癌癥相關(guān)表型或
細胞過程（王、顧、王和丁，2014）。賊近，OncomiR作為一種新的在線資源被引入，用于探索癌癥中的miRNA失調(diào)（Wong、Chen、Chen和Wang，2018）。
9. |miRNA分析方法
9. |微陣列
在高通量微陣列技術(shù)中，數(shù)千個合成探針被固定在固體載體上，它們是
疏水性塑料如尼龍膜。微陣列檢測miRNA的敏感性和特異性相對有限（Cheng、Dong、Zhang、Zhao和Li，2018）。微陣列定量miRNA的低靈敏度可能是一個挑戰(zhàn)，因為這些短RNA靶點的擴增很困難。此外，微陣列的低特異性可能導致來自密切相關(guān)的miRNA的假陽性結(jié)果。微陣列在miRNA表達分析中的應用受到miRNA特性的挑戰(zhàn)：首先，短長度的miRNA為優(yōu)化雜交效率提供的序列很少；第二，GC含量的巨大差異導致非常不同的雜交特性；第三，一些miRNA豐度低；第四，密切相關(guān)的miRNA家族成員甚至在單個核苷酸上也存在差異（Castoldi、Schmidt、Benes、Hentze和Muckenthaler，2008；Z.Wang和Yang，2010）。為了克服這些問題，已經(jīng)設計了核苷酸類似物以顯示更有效的雜交特性。例如，鎖定的核酸寡核苷酸增強了熔化
桌棋類游戲 L E 1 挑選出來的 生物信息學 工具 對于 分析 屬于 微RNA
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公用事業(yè) |
工具/類型 |
統(tǒng)一資源定位地址 |
版本/上次更新 |
算法或介紹 |
工具書類 |
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注釋 |
MiRBase/W |
22/2018 |
miRNA序列和注釋檔案 |
Kozomara和Griffiths-Jones（2014年） |
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Rfam/W |
14/2018 |
RNA家族數(shù)據(jù)庫 |
Kalvari等人（2018年） |
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新的計算發(fā)現(xiàn) |
MiRFinder/S |
4/2007 |
毫升 |
Huang等人（2007年） |
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微RNA |
MiRDeep2/S |
https://github.com/rajewsky-實驗室/mirdeep2 |
2.0.0.8/2016 |
鈮、銻、毫升 |
Friedländer等人（2012年） |
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Miralyzer/S |
3.0/2013 |
NB，IP |
Hackenberg等人（2011年） |
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獨立的。html |
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MiReader/S |
–/2016 |
鈮，毫升 |
Jha和Shankar（2013年） |
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miReader。php |
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MiRNA靶點預測 |
TargetScan/W，S |
7.2/2018 |
SM、EC、CM |
阿加瓦爾等人（2015年） |
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MiRWalk/W |
http://zmf.umm.uni-海德堡。de/apps/zmf/mirwalk2 |
3.0/2018 |
IP，TM |
Dweep和Gretz（2015年） |
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MiRTarBase/W |
7/2017 |
國會議員 |
周等人（2018） |
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焦油基（W） |
8/2018 |
MC，IP |
Karagkouni等人（2018年） |
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人類疾病中的MiRNA |
病毒病/W |
–/2008 |
人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫 |
Jiang等人（2009年） |
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OncomiRDB/W |
–/2014 |
經(jīng)驗證的腫瘤miR和腫瘤抑制miRNA |
Wang等人（2014年） |
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OncomiR/W |
–/2018 |
癌癥中miRNA的失調(diào) |
Wong等人（2018年） |
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MiRNA亞型 |
異構(gòu)體庫/W |
https://mcg.ustc.edu.cn/bsc/isomir/ |
–/2016 |
追蹤ISOMIR的數(shù)據(jù)庫 |
張等人（2016年） |
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引物設計窗口 |
微引物/S |
https://sourceforge.net/projects/ |
2.0/2018 |
設計miRNA引物 |
街頭表演（2014） |
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微引物 |
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筆記CM：補體匹配；EC：進化守恒；IP：綜合平臺；MC：人工策劃；ML：機器學習；NB：基于NGS；S： 軟件；SB：基于結(jié)構(gòu)；SM：種子匹配；TM：文本挖掘；W： 基于網(wǎng)絡。
捕獲探針的溫度（Tm），允許對小RNA進行敏感分析（Karbiener&Scheideler，2015）。
9. |miRNA測序（miRNA-seq）
MiRNA-seq是一種使用NGS技術(shù)的RNA測序（RNA-seq）。與其他形式的RNA-seq相反，在miRNA-seq中，輸入材料通常富含小RNA。它的
缺點包括數(shù)據(jù)分析和解釋所需的計算基礎設施、高成本和平臺無關(guān)偏差（Pritchard、Cheng和Tewari，2012）。高通量測序的深度是指測序過程中讀取核苷酸的平均次數(shù)，miRNA-seq直接與其相對表達水平相關(guān)（Churko、Mantalas、Snyder和Wu，2013）。每天閱讀500萬次
樣本足以為miRNA表達分析提供足夠的統(tǒng)計能力。在這一深度，新miRNA的高發(fā)現(xiàn)率仍然是可能的（Metpally等人，2013）。miRNA突變的鑒定可以通過超深測序進行，即使這些突變僅發(fā)生在樣本的一小部分中（Pritchard等人，2012）。簡而言之，分析
miRNA‐seq數(shù)據(jù)和解釋開始于預處理
短讀取以刪除適配器和低質(zhì)量序列。在
下一步，使用miRNA測序軟件工具，如mirdep2（Dillies等人，2013），將結(jié)果讀取映射到基因組參考序列上。
9. |用于miRNA分析的實時聚合酶鏈反應（PCR）方法
1. |聚（A）尾礦法
在聚（A）拖尾法的先進步中，腺苷的運行是
通過聚（A）聚合酶添加到包括miRNA在內(nèi)的所有RNA的3′端。在下一步中，使用通用反轉(zhuǎn)錄（RT）引物對多（A）尾RNA進行反轉(zhuǎn)錄，該引物是由兩個可變核苷酸組成的簡并引物
3′端，前面是寡核苷酸（dTs）和5′端的填充序列（圖5）。在通用RT引物的5′端設計了一種用于定量PCR（qPCR）的通用反向引物。通過基于SYBR綠色的qPCR，使用公共反向引物和特異正向引物擴增每個miRNA。此外，PCR擴增可以
采用基于TaqMan的方法，使用miRNA特異性正向
引物、通用反向引物和通用探針（Niu等人，2015）。MiRprimer是用于自動設計用于PCR擴增miRNA的引物的軟件（Busk，2014）。
1. |傳統(tǒng)和通用莖環(huán)方法
在傳統(tǒng)的莖環(huán)（TSLP）方法中，對于每個特定的miRNA，應設計新的特異性莖環(huán)引物。簡言之，莖環(huán)RT引物與成熟miRNA的3′端結(jié)合，然后反轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA；圖3）。隨后，通過TaqMan對cDNA進行擴增和定量
圖5 miRNA的RT和qPCR。在傳統(tǒng)的莖環(huán)法中，在與成熟miRNA的3′端雜交后，使用特異性環(huán)引物啟動RT步驟。然后，使用基于TaqMan的qPCR放大RT產(chǎn)物。在poly（A）拖尾法中，通過poly（A）聚合酶將poly（b）拖尾添加到成熟miRNA的3′端。cDNA是使用含有寡核苷酸（dTs）的通用RT引物合成的，該引物具有3′-簡并端?？梢允褂没赥aqMan或基于SYBR green的qPCR擴增每個miRNA。cDNA：互補DNA；
miRNA:microRNA；RT：逆轉(zhuǎn)錄；qPCR：定量聚合酶鏈反應[顏色圖可在wileyonlinelibrary.com查看]
12 |
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圖6液滴數(shù)字PCR。通過ddPCR對miRNA的先進定量始于cDNA合成。ddPCR可分為三個步驟，包括分配、PCR和讀取階段。首先，將反應試劑分成大約20000個液滴，然后在完成PCR反應后，讀取液滴熒光，并將其評估為陽性或陰性結(jié)果。cDNA：互補DNA；ddPCR：液滴數(shù)字PCR；miRNA:microRNA；PCR：聚合酶鏈反應[顏色圖可在wileyonlinelibrary.com查看]
探針、miRNA特異性正向和反向引物。通過將短RT啟動序列退火到miRNA的3′端，該方法具有更好的特異性來區(qū)分相關(guān)
miRNA。此外，雙鏈莖結(jié)構(gòu)防止RT引物與前miRNA和其他長RNA雜交（Z.Wang和Yang，2010）。
此外，還開發(fā)了一種稱為“通用莖環(huán)引物”（USLP）的改良TSLP。與TSLP方法不同，TSLP方法要求為每個miRNA設計特定的干-環(huán)引物
USLP技術(shù)利用了在3′端的八個簡并核苷酸
RT-底漆。因此，可以通過USLP方法在一個試管中同時進行87個miRNA的RT（Yang等人，2014）。
1. |微滴數(shù)字PCR對miRNA的先進定量
miRNA相對定量的主要缺點是缺乏一致高效的參考基因（Campomenosi等人，2016）。
液滴數(shù)字PCR（ddPCR）平臺（Bio-Rad）基于
專有表面活性劑化學將PCR樣品分餾成20000 nl大小的液滴（圖6）。PCR擴增發(fā)生在每個
單個液滴和PCR工作流程與TaqMan探針類似
基于實時PCR。PCR反應完成后，讀取液滴以確定PCR陽性液滴的比例。反應中的目標分子拷貝數(shù)根據(jù)
泊松分布假設（Huggett等人，2013年）。ddPCR的優(yōu)點是無需參考基因的先進定量、檢測低豐度靶點的更高靈敏度以及增加對擴增反應中抑制劑存在的耐受性（Giraldez、Chevillet和Tewari，2018）。
ddPCR與qRT-PCR相比，在以下方面具有優(yōu)勢：
分析循環(huán)miRNA的技術(shù)性能和診斷潛力（Robinson等人，2018）。
1. |miRNA表達分析的參考基因
盡管 qPCR 是一種強大的 miRNA 表達分析技術(shù)；然而，為了獲得高效的結(jié)果，需要通過合適的參考基因?qū)?shù)據(jù)進行標準化。小核 RNA（如 U6）、小核仁 RNA（如 SNORD44）或特定 miRNA（如 miR-16）通常用作 miRNA 表達分析中的標準化基因。賊近證明，用于 miRNA 定量的五種常見候選參考基因的穩(wěn)定性從賊高到賊低分別為 SNORD48、SNORD44、5S、miR-16 和 U6。在賊近的另一項研究中，高通量分析表明，在 miR-24-3p 中，miR-151a-5p 和 miR-425-5p 穩(wěn)定表達并被證實是慢性乙型肝炎 miRNA 研究的賊合適的參考基因。因此，關(guān)于 miRNAs 表達分析的量化，必須驗證每個實驗設置中推定的歸一化因子的表達穩(wěn)定性。
10. |結(jié)論
先進個miRNA（lin-4）于1993年在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，不久之后在動物、植物和一些病毒中也發(fā)現(xiàn)了它們。它們在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達，并在細胞分化、增殖和存活中發(fā)揮重要作用。先進個參與癌癥的miRNA（miR-122）在2002年發(fā)現(xiàn)，基因解碼發(fā)現(xiàn)它們是許多疾病的致病因素。迄今為止，試圖在各種疾病的體內(nèi)液體中中找到高效的miRNA生物標記，具體而言，癌癥尚未轉(zhuǎn)化為臨床。幸運的是，使用基于miRNA的治療方法治療癌癥和慢性HCV感染的I期臨床試驗取得了有希望的結(jié)果
成功在這篇綜述中，我們提供了miRNA和分析方法的不同生物學方面的概述和更新。深度測序技術(shù)的出現(xiàn)導致越來越多的數(shù)據(jù)，現(xiàn)在生物信息學工具可用于管理和解決miRNA研究的一些新方面。
(責任編輯：佳學基因)
