【佳學基因檢測】非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移風險基因檢測模型的建立與驗證

本文介紹了用于建立非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移風險基因檢測模型的方法及其臨床驗證實驗結(jié)果。

數(shù)據(jù)源

從 TCGA 數(shù)據(jù)庫 ( https://portal.gdc.cancer.gov/ ) 下載轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)，包括轉(zhuǎn)移樣本 (n = 31) 和非轉(zhuǎn)移樣本 (n = 733)，并用作訓練放。來自 GEO 數(shù)據(jù)集的 117 個 LUAD 樣本，GEO 數(shù)據(jù)集的登錄號為GSE13213，并用作外部驗證集。

DEG的識別

R統(tǒng)計軟件中的'Limma'包用于識別轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組之間的DEG，將adj p值<0.05設(shè)置為篩選閾值。DEG 的熱圖集群和火山圖是通過 R 軟件使用“pheatmap”和“ggplots”包創(chuàng)建的。

基因本體論 (GO) 和京都基因和基因組百科全書 (KEGG) 分析

為了探索轉(zhuǎn)移相關(guān)基因特征的潛在功能，通過“clusterProfiler”包進行了GO分析和KEGG富集分析。發(fā)現(xiàn) P.adjust < 0.05 具有統(tǒng)計學意義。

單變量 cox 回歸和 lasso 回歸分析

我們首先使用 R 包生存 coxph 函數(shù)對 DEG 進行單變量 Cox 回歸分析，以篩選與生存顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。選擇p  < 0.05 作為過濾的閾值。此外，將篩選出的與預后相關(guān)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因納入Lasso回歸模型，對上述基因進行懲罰，以防止模型的過擬合效應。我們進行了 LASSO Cox 回歸分析并確定了 12 個特征基因 。賊后通過多元COX回歸分析成功構(gòu)建了預后模型。訓練組和驗證組的患者分別根據(jù)訓練組風險評分的中值分為低風險組和高風險組。Kaplan-Meier 評估了兩組之間的生存差異。 同時，對訓練組進行單變量和多變量預后分析（p < 0.05），以確定從模型中獲得的riskScore是否可以作為獨立的預后因素。

列線圖的繪制和驗證

建立具有獨立危險因素如臨床信息和風險評分的列線圖來預測非小細胞肺癌患者1年、3年和5年總生存率的可能性。通過校準曲線評估列線圖的功效。

評估免疫評分、基質(zhì)評分和腫瘤純度免疫浸潤

ESTIMATE 包用于計算每個 PAAD 樣本的免疫評分（代表免疫細胞浸潤水平）和基質(zhì)評分（代表基質(zhì)數(shù)量）。ESTIMATE 評分定義為免疫評分和基質(zhì)評分的總和。然后通過Wilcoxon檢驗比較高危組和低危組間質(zhì)評分、免疫評分、ESTIMATE評分、腫瘤純度評分的差異。p值 < 0.05 被認為是顯著的 。為了預測免疫檢查點阻斷治療的效果，我們還探索了各組免疫檢查點基因的表達。

估計此預后風險模型與臨床特征和腫瘤突變負荷 (腫瘤突變負荷（TMB)) 之間的關(guān)系

我們評估了從 TCGA 獲得的風險評分和臨床特征之間的關(guān)系，如下：M（M0 和 M1）、N（N0 和 N1-3）、T（T1-2 和 T3-4）和分期（I- II 和 III-IV)。非小細胞肺癌患者的腫瘤突變數(shù)據(jù)來自TCGA數(shù)據(jù)庫，并計算每個非小細胞肺癌患者的腫瘤突變負荷（腫瘤突變負荷（TMB)）。

GSEA的分析

R包“limma”用于分析高危組和低危組之間的差異表達，所有基因按倍數(shù)變化值排序。h.all.v7.4.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集是從 MSigDB 下載的，通過 R 包“clusterProfiler”進行基因集富集分析以闡明重要的注釋途徑。
 

DEG的識別

TCGA 數(shù)據(jù)集中的 764 個 非小細胞肺癌樣本分為兩組：非轉(zhuǎn)移性（31 個樣本）和轉(zhuǎn)移性（733 個樣本）。TCGA 數(shù)據(jù)集產(chǎn)生了2058 個 DEG（圖 1A-B），其中 1499 個被下調(diào)，559 個被上調(diào)。

功能富集分析

DEGs的生物學功能和途徑可以通過基因富集分析來研究。表皮發(fā)育、皮膚發(fā)育、表皮細胞分化、角質(zhì)形成細胞分化和角質(zhì)化是GO 中豐富的生物過程（前 5 位）。前突觸、突觸膜、谷氨酸能突觸和角質(zhì)化細胞分化及角質(zhì)化是通過 GO分析得到的主要成分（前 5 位）。肽酶調(diào)節(jié)劑活性、內(nèi)肽酶調(diào)節(jié)劑活性、內(nèi)肽酶抑制劑活性、肽酶抑制劑活性和絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性是GO的前五種分子功能（圖 2A）。類似地，神經(jīng)活性配體-受體相互作用、化學致癌-受體激活、雌激素信號通路、金黃色葡萄球菌感染和藥物代謝-細胞色素P450是前5個顯著富集的通路（圖2B）。

基于6個預后轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的風險評分模型的構(gòu)建與驗證

對 TCGA 訓練組的 DEG 進行單變量 Cox 回歸分析。單因素回歸分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移相關(guān)基因與非小細胞肺癌患者預后顯著相關(guān)（p < 0.05）（圖 3A）。對于這些具有預后價值的基因，采用LASSO回歸分析來避免過度擬合預后模型。LASSO 回歸分析顯示 12 個基因與 總生存率 有顯著關(guān)系（圖  3B 和 C）。賊后，肺癌轉(zhuǎn)移風險評估基因檢測包構(gòu)建團隊對選擇的 12 個基因進行了多元回歸分析。通過多元回歸分析，C1QL2、FLNC、LUZP2、PRSS3、SPIC 和 GRAMD1B 被確定為 TCGA 訓練組中總生存率的風險變量（圖 3D)。風險評分計算為 (− 0.265 × C1QL2) + (0.227 × FLNC) + (− 0.625 × LUZP2) + (0.095 × PRSS3) + (0.193 × SPIC) + (0.447 × GRAMD1B)。之后，根據(jù)中位風險評分將 TCGA 患者分為高風險組和低風險組。根據(jù) Kaplan-Meier 曲線，具有高風險評分的患者在訓練集中的存活率較低 ( p = 0.0001)（圖 3E)。同樣，從GSE13213中選擇 117 名個體作為驗證隊列，并根據(jù)中位風險評分分為高風險組和低風險組，風險評分計算公式與 TCGA 隊列相同。生存曲線顯示兩組之間 存在顯著差異（p <0.05）（圖 3F）。分析RiskScore與臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)基于六基因特征構(gòu)建的風險評分根據(jù)年齡、M0分期、N分期、I-II期、T1-2分級區(qū)分為高低風險組。因此，這一發(fā)現(xiàn)表明肺癌轉(zhuǎn)移風險基因評估模型對臨床特征具有很強的預測能力。

RiskScore對不同臨床特征的表達及列線圖的構(gòu)建

采用多變量 Cox 方法在 TCGA 數(shù)據(jù)集中尋找 非小細胞肺癌 患者的三個獨立預后指標（年齡、分期和風險評分）（圖  4A）。之后，根據(jù)年齡、分期和風險評分生成 1 年、3 年和 5 年生存率的列線圖，以客觀估計每位非小細胞肺癌患者的生存可能性（圖 4B）。此外，繪制了 1 年、3 年和 5 年生存率的校準曲線以測試列線圖的正確性，結(jié)果表明列線圖預測的和實際的生存概率大體上是一致的（圖 4C-E)。根據(jù)從列線圖計算的中位風險評分，將 TCGA 隊列中的患者分為高風險組和低風險組。圖 4F 表示高危組患者的 總生存率 顯著短于低危組（p  < 0.001）。

肺癌轉(zhuǎn)移風險基因檢測預后評估模型與患者臨床病理特征的相關(guān)性

肺癌轉(zhuǎn)移風險基因檢測評估模型首先查看風險評分和臨床變量之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，N階段之間的風險評級沒有顯著差異（圖 5A）。肺癌轉(zhuǎn)移風險基因檢測評估模型 研究了不同非小細胞肺癌組之間風險評分的差異。按分期分層的亞組分析顯示，IV 期非小細胞肺癌患者的風險評分顯著高于 I 期非小細胞肺癌患者（p  = 0.0031）。（圖 5B）。此外，與 M0 非小細胞肺癌 患者相比，M1 非小細胞肺癌 患者的風險評分顯著更高（p  = 0.043）。此外，T3 非小細胞肺癌 患者的風險評分顯著高于 T1 非小細胞肺癌 患者 ( p  = 0.0052)（圖 5C-D）。

非小細胞肺癌患者免疫微環(huán)境與轉(zhuǎn)移風險基因檢測評分模型的關(guān)系分析

使用 ESTIMATE 算法，肺癌轉(zhuǎn)移風險基因檢測評估專項小組采用 TCGA 數(shù)據(jù)集估計了 非小細胞肺癌的基質(zhì)細胞得分、免疫評分和腫瘤純度。肺癌轉(zhuǎn)移風險基因檢測評估專項小組的數(shù)據(jù)顯示，高危組的免疫評分和基質(zhì)評分顯著高于低危組（圖  6A），高危組的腫瘤純度評分顯著低于低危組。為進一步探索個體免疫微環(huán)境，開展個體化治療，對高危組和低危組的免疫浸潤和免疫檢查點基因進行了進一步研究（圖 6B-C）。與高風險組相比，低風險組的巨噬細胞、巨噬細胞 M1、MEP、單核細胞、pDC 和 Th2 細胞的標志物顯著降低。另一方面，低風險組的 Th1 細胞、MEP 和 HSC 標志物表達增加。此外，在高危組和低危組中發(fā)現(xiàn)了免疫檢查點基因變異的基因檢測結(jié)果。TNFSF15 在低風險組中的表達水平高于高風險組。與低危組相比，高危組表現(xiàn)出更高的 ADORA2A、TNFSF14、CD28、ICOS、TIGIF、TNFRSF9、CD276、TNFSF9、TNFRSF8、PDCD1、CTLA4、TNFSF4、CD86、NRP1、TNFRSF4、CD70、 LAIR1、C10orf54、HAVCR2 和 CD200。 肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移風險評估小組還估計了每個樣本的 腫瘤突變負荷（TMB)，發(fā)現(xiàn)在 TCGA 數(shù)據(jù)集中，高風險組的 腫瘤突變負荷（TMB) 顯著更高（p  = 0.0056）。（圖 6D)。

GSEA分析

進行GSEA分析以進一步探索低風險和高風險人群之間的差異生物學機制。我們發(fā)現(xiàn)了信號通路（圖 7)，包括同種異體移植排斥、凝血、補體、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、G2M 檢查點、IL6-JAK-STAT3 信號傳導、炎癥反應、干擾素 γ 反應、KRAS 信號傳導、通過 NFkB 的 TNFA 信號傳導在高危組中顯著富集。
本文將非小細胞肺癌樣本按照M分期分為轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組。TCGA被用作訓練隊列并構(gòu)建預后模型，而GEO數(shù)據(jù)庫被用作驗證隊列以驗證預后模型評估的有效性。首先，我們分析了 TCGA 入組的 非小細胞肺癌 患者的基因表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，識別了 2058 個與轉(zhuǎn)移相關(guān)的 DEG。使用單變量、LASSO 和多變量 Cox 回歸分析，6 種 mRNA（C1QL2 、FLNC 、LUZP2、PRSS3、SPIC、GRAMD1B) 已被發(fā)現(xiàn)是 非小細胞肺癌 的獨立預后預測因子。其次，生存分析被用來檢查預后模型的可用性。所有 6 種 mRNA 的表達模式都與 總生存率 相關(guān)，這意味著隨著這些 mRNA 表達的產(chǎn)生，患者將有不同的生存時間。第三，對訓練組構(gòu)建的模型進行了外部驗證，增加了結(jié)果的高效性。
通過對轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)許多GO通路被富集，如表皮發(fā)育、皮膚發(fā)育、表皮細胞分化、角質(zhì)形成細胞分化等。其中許多已被證實與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。密切相關(guān)，如Sabounsji的研究指出，非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移與表皮細胞分化密切相關(guān)。Li 的研究中還指出了角質(zhì)形成細胞分化與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤之間的相關(guān)性。模型中的 mRNA 已在其他文章中報道，它們也與不同類型的癌癥有關(guān)。Sigin 等人的一項研究。發(fā)現(xiàn)在 Luminal B 型乳腺癌中的甲基化水平C1QL2與 Luminal B 乳腺癌患者的新輔助化療密切相關(guān) 。細絲蛋白C ( FLNC ) 是一種大型肌動蛋白交聯(lián)蛋白，存在于多種細胞中。根據(jù)以往的文獻，FLNC的暫時表達或沉默可以改變癌細胞的增殖和集落形成，而內(nèi)源性FLNC沉默可以加速癌細胞的運動和侵襲。LUZP2（亮氨酸拉鏈蛋白 2 基因），位于 Chr 11p13-11p14 并編碼亮氨酸拉鏈蛋白，已被證明在 Wilms 的腫瘤患者中被刪除。Wilms 瘤、生殖器異常、無虹膜和智力低下是一種罕見的先天性異常綜合征，其特征是 Wilms 瘤、生殖器畸形、無虹膜和智力低下。此外，Zhao 等人發(fā)現(xiàn)，相對于正常前列腺組織， LUZP2 mRNA 表達在未使用激素的前列腺癌 (PC) 中升高，但在從未使用激素的 PC 到去勢抵抗性 PC (CRPC) 的整個進展過程中下調(diào) 。PRSS3(絲氨酸蛋白酶 3) 是絲氨酸蛋白酶家族的成員，在胰腺腺泡細胞中產(chǎn)生并釋放到小腸中以幫助消化。根據(jù) Wang 的研究結(jié)果，PRSS3表達增加可能會增強胃癌轉(zhuǎn)移，并作為患者預后不良的獨立分子指標 。SpiC是Spi亞型中的一員，SpiC在骨髓分化中具有重要作用，但目前尚無關(guān)于SpiC在腫瘤中作用的報道。GRAMD1B（含 GRAM 結(jié)構(gòu)域的蛋白 1B）被確定為信號級聯(lián)的推定成分 17，與人類惡性腫瘤有關(guān) 。具體而言，據(jù)報道它在卵巢癌患者的化學抗性中發(fā)揮作用，例如GRAMD1B抑制導致抗腫瘤作用 。Khanna 的研究證明GRAMD1B通過 JAK/STAT 和 Akt 信號傳導調(diào)節(jié)乳腺癌細胞中的細胞遷移 。這些結(jié)果代表了與本研究相似的結(jié)論。
腫瘤轉(zhuǎn)移是由癌細胞與腫瘤微環(huán)境的眾多基質(zhì)細胞成分之間的相互作用以及惡性細胞內(nèi)在變化的積累引發(fā)的 。來自宿主的免疫細胞（如腫瘤相關(guān)巨噬細胞、髓源性抑制細胞和調(diào)節(jié)性 T 細胞）對腫瘤組織的炎癥和浸潤已被證明可促進腫瘤發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移 。我們的數(shù)據(jù)顯示，高危組的免疫評分和基質(zhì)評分顯著高于低危組。如巨噬細胞、巨噬細胞M1、單核細胞、pDC和Th2細胞的免疫浸潤明顯高于低危組。這表明腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因也在調(diào)節(jié)腫瘤免疫中發(fā)揮作用。為了更詳細地解釋 非小細胞肺癌 中的免疫細胞浸潤，使用 ssGSEA 發(fā)現(xiàn)低風險組的 iDC、MSC、Th2 細胞、內(nèi)皮細胞、單核細胞的標志物表達較高。這些結(jié)果與以往研究的結(jié)論一致，表明我們的預后模型不僅可以對非小細胞肺癌患者的預后有很好的預測作用。并且可以在一定程度上對患者的免疫變化做出反應。這對于 非小細胞肺癌 患者的免疫治療將非常重要。例如，在未來，可以通過我們研究中建立的預后模型來預測患者對免疫治療的反應。
我們希望從遺傳學上了解我們的模型起作用的可能機制，進行 GSEA 以分別對高風險和低風險組進行富集分析，可以發(fā)現(xiàn)包括同種異體移植排斥、凝血、補體、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、G2M 檢查點、IL6 JAK STAT3 信號傳導、炎癥反應、干擾素 γ 反應、KRAS 信號傳導、通過 NFkB 的 TNFA 信號傳導在高危組中顯著富集。這些途徑都在之前的研究中顯示與腫瘤轉(zhuǎn)移直接或間接相關(guān)。例如，EMT 是一種進化上保守的發(fā)育程序，它與致癌作用有關(guān)，并通過增加移動性、侵襲性和對凋亡刺激的抗性賦予癌細胞轉(zhuǎn)移特性。此外。細胞因子白細胞介素 6 (IL6) 及其下游效應器 STAT3 形成了乳腺癌中的主要致癌途徑，據(jù)推測該途徑在功能上與雌激素受體 (ER) 相關(guān)。Siersbak 等人。發(fā)現(xiàn)IL6 / STAT3信號促進ER +乳腺癌的轉(zhuǎn)移，而不是ER陽性。一部分 ER 增強子被 STAT3 劫持以產(chǎn)生獨特的轉(zhuǎn)錄途徑 。據(jù)報道，我們已經(jīng)確定的一些潛在途徑與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，這驗證了我們的結(jié)果，并且我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)了尚未探索到轉(zhuǎn)移的潛在途徑。這為未來研究腫瘤轉(zhuǎn)移基因提供了新的視角。
賊后，我們通過一系列生物信息分析開發(fā)了用于預測 非小細胞肺癌 轉(zhuǎn)移預后的模型和生物標志物。根據(jù)我們在訓練組和測試組中都證實的研究結(jié)果，低風險組患者的總生存率高于高風險組患者。我們的研究為非小細胞肺癌的診斷和治療開辟了一條新途徑。然而，這項研究仍然存在一些局限性。首先，TCGA中的數(shù)據(jù)可能包含不同程度的錯誤，并且包含的??數(shù)據(jù)量是有限的，這可能會導致不正確。其次，缺乏體內(nèi)和體外研究會導致證據(jù)不足。賊后，我們的研究還存在一個缺陷，即 TCGA 數(shù)據(jù)庫無法提供配對樣本。所以，我們無法縱向比較同一患者不同轉(zhuǎn)移時間的情況，我們還將在未來的研究中納入更多的隊列以彌補這一不足。還值得一提的是，我們的研究并非基于所有臨床特征，包括年齡、性別等，而是僅由一些可訪問的臨床特征構(gòu)建的預后模型。比如T和N分期等等。未來的研究需要結(jié)合更多的臨床特征以實現(xiàn)更好的模型性能。因此，需要進一步的研究和試驗來驗證模型和生物標志物，以確保其穩(wěn)健性。但是一個僅由一些可訪問的臨床特征構(gòu)建的預后模型。比如T和N分期等等。未來的研究需要結(jié)合更多的臨床特征以實現(xiàn)更好的模型性能。因此，需要進一步的研究和試驗來驗證模型和生物標志物，以確保其穩(wěn)健性。但是一個僅由一些可訪問的臨床特征構(gòu)建的預后模型。比如T和N分期等等。未來的研究需要結(jié)合更多的臨床特征以實現(xiàn)更好的模型性能。因此，需要進一步的研究和試驗來驗證模型和生物標志物，以確保其穩(wěn)健性。


(責任編輯：佳學基因)