【佳學(xué)基因檢測(cè)】侵襲性卵巢腫瘤基因檢測(cè)：檢測(cè)的基因及解讀方法
卵巢交界性腫瘤（BOTS）是一類(lèi)罕見(jiàn)的卵巢腫瘤，其生物學(xué)行為介于良性的囊腺瘤與低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）之間。在分子層面上，BOTS 與 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）表現(xiàn)出一定相似性。然而，與基因解碼相對(duì)充分的高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）相比，BOTS 和 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）的分子特征尚不明確。
本基因解碼采用新一代測(cè)序（NGS）技術(shù)，分析伴或不伴 BRAF V600E 突變的 BOTS、低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）和高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中關(guān)鍵抑癌基因及致癌基因的遺傳變異情況。隨后，通過(guò)桑格測(cè)序驗(yàn)證所選基因多態(tài)性的存在，并利用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）評(píng)估這些變異對(duì)相應(yīng)蛋白表達(dá)的影響。
基因解碼結(jié)果揭示了不同卵巢腫瘤類(lèi)型在多態(tài)性模式上的差異，提示它們可能涉及不同的信號(hào)通路。在未攜帶 BRAF V600E 突變的 BOTS 中，KRAS 突變似乎具有重要作用；而在 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中，KRAS 和 NRAS 突變則更為常見(jiàn)。相較之下，這些突變?cè)诟呒?jí)別卵巢癌（hgOvCa）中的出現(xiàn)頻率較低。
此外，通過(guò)多變量回歸分析，佳學(xué)基因檢測(cè)識(shí)別出 BOTS 中的 PARP1 以及高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中的 FANCI、BRCA2、TSC2 和 FANCF 等潛在生物標(biāo)志物。值得一提的是，在某些關(guān)鍵基因（如 FANCI、FANCD2、FANCF、TSC2 以及 BRCA1/2、TP53）中觀察到的遺傳狀態(tài)，對(duì)于理解疾病進(jìn)展和預(yù)后具有重要意義。
本基因解碼為不同侵襲性卵巢腫瘤間的分子異質(zhì)性提供了新視角，并提出了若干可能作為預(yù)后評(píng)估或治療反應(yīng)預(yù)測(cè)指標(biāo)的分子標(biāo)志物。
關(guān)鍵詞：
卵巢癌、交界性卵巢腫瘤、多態(tài)性、NGS、蛋白質(zhì)印跡、TP53、RAS、BRAF、BRCA1/2
一、基因解碼背景
卵巢癌（OvCa）是一種臨床上常見(jiàn)且高度異質(zhì)的女性惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)其預(yù)后較差、死亡率高。根據(jù)病理分型，卵巢癌主要分為高級(jí)別（hgOvCa）和低級(jí)別（lgOvCa）兩類(lèi)。hgOvCa 是最常見(jiàn)的類(lèi)型，通常表現(xiàn)為高度基因組不穩(wěn)定、染色體結(jié)構(gòu)異常以及多個(gè)關(guān)鍵腫瘤抑制基因（如 TP53、BRCA1、BRCA2）的高頻突變。
相比之下，低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）較為罕見(jiàn)，通常在較年輕的患者中發(fā)現(xiàn)，雖然其對(duì)化療反應(yīng)較差，但生存期通常更長(zhǎng)。低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中 TP53 和 BRCA1/2 的突變頻率明顯低于 hgOvCa，尤其在其漿液性亞型中，與 BOTS 的分子譜存在重疊。
BOTS 是一類(lèi)生物學(xué)行為介于良性和惡性之間的腫瘤，大多見(jiàn)于育齡女性，占所有上皮性卵巢腫瘤的約 15%。這些腫瘤多數(shù)在 FIGO 早期被診斷，整體預(yù)后良好。然而，由于缺乏特異性的影像學(xué)表現(xiàn)，術(shù)前診斷存在困難。此外，即便進(jìn)行完全切除，約有 20% 的 BOTS 仍可能復(fù)發(fā)，其中近 30% 的復(fù)發(fā)病例最終發(fā)展為浸潤(rùn)性卵巢癌。
在分子水平上，BOTS 與高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）存在顯著差異。BOTS 中較少出現(xiàn) TP53 和 BRCA1/2 的突變，最常見(jiàn)的是 BRAF 和 KRAS 突變，特別是在漿液性亞型中，這些變異有時(shí)也可見(jiàn)于 lgOvCa，而在高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中則較為罕見(jiàn)。此外，一些基因解碼亦關(guān)注了如 PIK3CA、EGFR、CTNNB1、RAD51C、PALB2、CHEK2 和 PTEN 等基因在 BOTS 中的突變頻率。然而，關(guān)于 BOTS 中抑癌基因與致癌基因的多態(tài)性信息仍然有限。
相較而言，hgOvCa 的遺傳特征基因解碼更為深入，但部分分子標(biāo)志物的臨床意義仍存在爭(zhēng)議。因此，深入探討 BOTS、低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）和高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）的分子圖譜，具有重要的臨床和基因解碼價(jià)值。
二、基因解碼目的與方法
本基因解碼使用兩套新一代測(cè)序（NGS）基因面板，對(duì)攜帶或不攜帶 BRAF V600E 突變的 BOTS（分別稱(chēng)為 BOT 和 BOT.V600E），以及 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）和高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）樣本中 76 個(gè)相關(guān)基因的多態(tài)性狀態(tài)進(jìn)行分析：
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第一套基因面板： 涵蓋 41 個(gè)與遺傳性卵巢癌密切相關(guān)的致癌基因和抑癌基因，以及 CRNDE、IRX5 和 CEBPA；
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第二套基因面板： 包括 37 個(gè)在散發(fā)性人類(lèi)癌癥中常見(jiàn)的突變熱點(diǎn)，大多數(shù)不包括在第一套面板中。
基因解碼流程包括：
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基因多態(tài)性的單變量與多變量統(tǒng)計(jì)分析；
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關(guān)鍵位點(diǎn)的桑格測(cè)序驗(yàn)證；
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蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證基因變異與蛋白表達(dá)間的關(guān)聯(lián)性。
本基因解碼旨在揭示不同類(lèi)型卵巢腫瘤的基因多態(tài)性特征，為后續(xù)生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)和疾病機(jī)制的解析奠定基礎(chǔ)。
2. 結(jié)果
2.1 不同腫瘤組基因多態(tài)性的分布
經(jīng)過(guò)NGS和生物信息學(xué)分析后，佳學(xué)基因檢測(cè)獲得了一系列對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能具有高度或中度影響的基因變異。對(duì)這些具有不同影響的基因變異進(jìn)行了組合分析或單獨(dú)分析，以確定具有不同影響的變異對(duì)卵巢腫瘤結(jié)果的影響是一致還是不一致。此外，還有兩個(gè)問(wèn)題需要澄清。首先，在44個(gè)基因的面板中，一個(gè)額外的致癌基因KCNMB3 被富集，該基因是非預(yù)期的基因解碼對(duì)象。這可能是因?yàn)樗幕蜃cPIK3CA基因的基因座部分重疊，而 PIK3CA 基因最初包含在面板中，由相反的 DNA 鏈編碼。同樣，在熱點(diǎn)面板中，一個(gè)額外的基因FBXW7-AS1被富集，它是熱點(diǎn)面板中存在的FBXW7基因 [ 17 ]的反義轉(zhuǎn)錄本。其次，佳學(xué)基因檢測(cè)團(tuán)隊(duì)在另一篇論文中描述了CRNDE基因（在 44 基因組中添加）的多態(tài)性，因此本文不再贅述。
當(dāng)在整個(gè)卵巢腫瘤組中使用 44 個(gè)基因面板時(shí)，佳學(xué)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了 85 種獨(dú)特的、以前未描述過(guò)的變異（71 個(gè)新的 SNP 和 14 個(gè)新的非 SNP）。。圖 1 A、B（具有高或中等影響 (A) 或僅為高影響 (B) 的變異）。在圖 1 C-F 和圖 S1C、E中，顯示了相關(guān)的箱線(xiàn)圖，分別描繪了不同卵巢腫瘤組中 SNP 和非 SNP 變異的總體頻率。這些箱線(xiàn)圖還補(bǔ)充了詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)測(cè)試。此外，圖 S2A - F 還顯示了每個(gè)腫瘤組每個(gè)基因的 SNP 或非 SNP 變異的平均計(jì)數(shù)。當(dāng)綜合考慮所有變異時(shí)（圖 1 A），最常改變的基因（至少一個(gè)組中改變的樣本比例 > 0.5）是BRCA1、BRCA2、FANCA、SEM1和TP53 。但是，如果僅考慮高影響變異（圖 1 B），則遺傳變異頻率最高（> 0.3）的是BRCA1和TP53基因，以及高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）組。相比之下，與所有剩余腫瘤組相比，在沒(méi)有BRAF V600E 突變的BOT 中，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能具有高/中等影響（圖 1 C）或僅有中等影響（圖 S1C ）的 SNP 數(shù)量明顯更高。此外，相同的分析顯示，BOT.V600E 腫瘤的特征是 SNP 數(shù)量明顯低于 hgOvCa。值得注意的是，在高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中，與所有其他腫瘤組相比，高影響基因變異（SNP 或非 SNP）的數(shù)量顯著升高，除了在 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）比較中影響較大的 SNP（圖 1 D-F）。值得注意的是，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能僅有中等影響的非 SNP 數(shù)量并未顯著區(qū)分任何卵巢腫瘤組（圖 S1E），這可能是因?yàn)檫@些變異的頻率較低（僅在三個(gè)基因ATRX、CHEK1和PTEN中發(fā)現(xiàn)了六種此類(lèi)變異，僅在 9 個(gè)高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）腫瘤中發(fā)現(xiàn)。
對(duì)于熱點(diǎn)面板，佳學(xué)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了 82 種獨(dú)特的、以前未描述過(guò)的遺傳變異（75 個(gè)新的 SNP 和 7 個(gè)新的非 SNP）。它們的列表可以在Supplement-variants.xlsx中找到。圖 2 A、B（具有高或中等影響（A）或僅為高影響（B）的變異）和圖 S1B（僅為中等影響的變異）顯示了每組腫瘤中所有基因中檢測(cè)到的所有變異（SNP 和非 SNP 合并）的累積頻率。在圖 2 C-F 和圖 S1D、F中，顯示了相關(guān)的箱線(xiàn)圖，分別描繪了不同卵巢腫瘤組中 SNP 和非 SNP 變異的總體頻率。這些箱線(xiàn)圖還補(bǔ)充了詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)測(cè)試。此外，圖 S2G -L還顯示了每個(gè)腫瘤組每個(gè)基因的 SNP 或非 SNP 改變的平均計(jì)數(shù)。當(dāng)同時(shí)考慮高影響變異和中度變異，以及 SNP 和非 SNP 時(shí)（圖 2 A），最常改變的基因（至少一個(gè)組中改變的樣本比例 > 0.5）是PTCH1（在所有腫瘤組中均發(fā)生改變）和TP53（主要在高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中發(fā)生改變）。有趣的是，在熱點(diǎn)面板中，BRCA1基因中的遺傳變異的識(shí)別頻率低于在 44 基因面板中的頻率。然而，如果僅考慮高影響變異，則使用兩個(gè)面板檢測(cè)到的BRCA1和TP53的突變譜相似，揭示了在 OvCa 中這些基因的遺傳變異頻率很高，尤其是在高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中（圖 1 B 和圖 2 B）。值得注意的是，在熱點(diǎn)面板中，佳學(xué)基因檢測(cè)還在一個(gè)lgOvCa樣本中檢測(cè)到了TP53基因的兩個(gè)變異（chr17:g.7674921C>A，p.Glu204Ter和chr17:g.7676218C>A，p.Glu51Ter）。這兩個(gè)SNP在44個(gè)基因面板中均未發(fā)現(xiàn)，可能是因?yàn)樗鼈兊念l率較低，分別為11%和14%。需要在此提及的是，在佳學(xué)基因檢測(cè)的生物信息學(xué)工作流程中，所有頻率低于10%的序列變異都被過(guò)濾掉，以消除由DNA聚合酶錯(cuò)誤引起的變異，以及那些過(guò)于罕見(jiàn)以至于既無(wú)法產(chǎn)生明顯的臨床效果也無(wú)法通過(guò)桑格測(cè)序成功驗(yàn)證的變異。
圖 2.SNP 和非 SNP 變異——熱點(diǎn)基因面板。（A、B）每個(gè)腫瘤組中每個(gè)基因的所有變異（SNP 和非 SNP 組合）的累積頻率（（A）—具有高或中等影響的變異，（B）—僅具有高影響的變異）。（C – F）箱線(xiàn)圖顯示所分析的腫瘤組之間 SNP（（C）高或中等影響，（D）僅高影響）和非 SNP（（E）高或中等影響，（F）僅高影響）的遺傳變異數(shù)量差異。每個(gè)箱線(xiàn)圖還補(bǔ)充了 Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)（顯示所分析的變異集之間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異）和帶有連續(xù)性校正的 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)（事后檢驗(yàn)用來(lái)確定哪些腫瘤組彼此不同）。NS：不顯著。組大?。築OT：n = 53； BOT.V600E：n = 23； lgOvCa：n = 10； hgOvCa：n = 139。
當(dāng)僅考慮 SNP 時(shí)，熱點(diǎn)面板的結(jié)果與 44 基因面板的結(jié)果在 BOT 組中非高影響 SNP 的頻率方面存在重要差異。在熱點(diǎn)面板中，BOT 中此類(lèi) SNP 的數(shù)量明顯低于兩個(gè) OvCa 組（圖 2 C 和圖 S1D）。相比之下，在 44 基因面板中，BOT 中的非高影響 SNP 比所有其他腫瘤組都豐富得多（圖 1 C 和圖 S1C）。然而，當(dāng)考慮高影響 SNP 或所有非 SNP 時(shí)，這種分歧消失了（圖 1 D-F 和圖 2 D-F），表明在兩個(gè)面板中高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）的基因改變頻率均高于 BOTS。
將每個(gè)樣本每個(gè)基因的所有 SNP 和非 SNP 變異相加并二值化（至少存在一個(gè)變異 vs. 無(wú)變異）。隨后對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析（如表 1所示）顯示，無(wú)論基因組合和變異影響如何， TP53都是低侵襲性腫瘤（BOT、BOT.V600E 和 lgOvCa）與 hgOvCa（后者突變頻率更高）之間最具區(qū)分性的基因。該規(guī)則的唯一例外是熱點(diǎn)組合中 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）對(duì)比中存在高影響變異，未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
表 1.通過(guò)兩個(gè)基因組識(shí)別出對(duì)卵巢腫瘤組具有高度或中等影響的遺傳變異，可顯著區(qū)分卵巢腫瘤組。
| 44個(gè)基因面板 | ||||||
| 影響高或中等 | ||||||
| 組比較和p值 | ||||||
| 基因 | BOT 與 BOT.V600E | BOT 與 lgOvCa | BOT 與 hgOvCa | BOT.V600E 與 lgOvCa | BOT.V600E 與 hgOvCa | 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與 hgOvCa |
| TP53 | 5.67 × 10 −31 (↑hgOvCa) | 1.23 × 10 −18 (↑hgOvCa) | 1.8 × 10 −9 (↑hgOvCa) | |||
| FANCB | 9.71 × 10 −3（↑BOT） | |||||
| SEM1 | 2.51 × 10 −2（↑底部） | 1.01 × 10 −2（↑底部） | ||||
| 范卡 | 2.61 × 10 −2（↑BOT） | |||||
| FANCD2 | 4.97 × 10 −2 (↑hgOvCa) | 1.52 × 10 −2 (↑hgOvCa) | ||||
| BRCA2 | 1.47 × 10 −2 (↑底部) | |||||
| CHEK2 | 1.04 × 10 −2（↑底部） | |||||
| MUTYH | 1.44 × 10 −2 (↑底部) | |||||
| RAD50 | 2.83 × 10 −2（↑底部） | |||||
| 影響中等 | ||||||
| 組比較和p值 | ||||||
| 基因 | BOT 與 BOT.V600E | BOT 與 lgOvCa | BOT 與 hgOvCa | BOT.V600E 與 lgOvCa | BOT.V600E 與 hgOvCa | 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與 hgOvCa |
| TP53 | 3.48 × 10 −14 (↑hgOvCa) | 6.97 × 10 −9 (↑hgOvCa) | 1.64 × 10 −4 (↑hgOvCa) | |||
| BRCA1 | 2.76 × 10 −2（↑底部） | |||||
| FANCB | 9.71 × 10 −3（↑BOT） | |||||
| SEM1 | 2.51 × 10 −2（↑底部） | 1.01 × 10 −2（↑底部） | ||||
| MUTYH | 3.8 × 10 −2 (↑底部) | |||||
| BRCA2 | 3.83 × 10 −3（↑底部） | |||||
| CHEK2 | 5.94 × 10 −3（↑BOT） | |||||
| FANCA | 2.61 × 10 −2（↑BOT） | |||||
| FANCD2 | 4.97 × 10 −2 (↑hgOvCa) | 1.52 × 10 −2 (↑hgOvCa) | ||||
| RAD50 | 2.83 × 10 −2（↑底部） | |||||
| PALB2 | 4.31 × 10 −2（↑底部） | |||||
| ATM | 3.62 × 10 −2 (↑lgOvCa) | |||||
| 高影響 | ||||||
| 組比較和p值 | ||||||
| 基因 | BOT 與 BOT.V600E | BOT 與 lgOvCa | BOT 與 hgOvCa | BOT.V600E 與 lgOvCa | BOT.V600E 與 hgOvCa | 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與 hgOvCa |
| TP53 | 1.25 × 10 −8 (↑hgOvCa) | 1.47 × 10 −4 (↑hgOvCa) | 3.08 × 10 −2 (↑hgOvCa) | |||
| BRCA1 | 1.25 × 10 −7 (↑hgOvCa) | 6.01 × 10 −4 (↑hgOvCa) | 3.4 × 10 −2 (↑hgOvCa) | |||
| 熱點(diǎn)面板 | ||||||
| 影響高或中等 | ||||||
| 組比較和p值 | ||||||
| 基因 | BOT 與 BOT.V600E | BOT 與 lgOvCa | BOT 與 hgOvCa | BOT.V600E 與 lgOvCa | BOT.V600E 與 hgOvCa | 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與 hgOvCa |
| TP53 | 1.01 × 10 −29 (↑hgOvCa) | 7.62 × 10 −18 (↑hgOvCa) | 2.35 × 10 −7 (↑hgOvCa) | |||
| BRAF | 1.52×10−16 （ ↑BOT.V600E） | 1.08×10−8 （ ↑BOT.V600E） | 1.08× 10−23（↑BOT.V600E） | |||
| NRAS | 1.1 × 10 −2 (↑lgOvCa) | 2.2 × 10 −2 (↑lgOvCa) | 2.22 × 10 −4 (↑lgOvCa) | |||
| BRCA1 | 1.08 × 10 −4 (↑hgOvCa) | |||||
| FBXW7 | 3.67 × 10 −2 (↑hgOvCa) | |||||
| KRAS | 6.44 × 10 −5（↑底部） | 2.58 × 10 −10 (↑底部) | 5.13 × 10 −3 (↑lgOvCa) | 2.77 × 10 −3 (↑lgOvCa) | ||
| 影響中等 | ||||||
| 組比較和p值 | ||||||
| 基因 | BOT 與 BOT.V600E | BOT 與 lgOvCa | BOT 與 hgOvCa | BOT.V600E 與 lgOvCa | BOT.V600E 與 hgOvCa | 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與 hgOvCa |
| TP53 | 2.27 × 10 −15 (↑hgOvCa) | 1.66 × 10 −9 (↑hgOvCa) | 8.26 × 10 −5 (↑hgOvCa) | |||
| BRAF | 1.52×10−16 （ ↑BOT.V600E） | 1.08×10−8 （ ↑BOT.V600E） | 1.08× 10−24（↑BOT.V600E） | |||
| NRAS | 1.1 × 10 −2 (↑lgOvCa) | 2.2 × 10 −2 (↑lgOvCa) | 2.22 × 10 −4 (↑lgOvCa) | |||
| KRAS | 6.44 × 10 −5（↑底部） | 1.41 × 10 −11 (↑BOT) | 5.13 × 10 −3 (↑lgOvCa) | 1.11 × 10 −3 (↑lgOvCa) | ||
| 高沖擊力 | ||||||
| 組比較和p值 | ||||||
| 基因 | BOT 與 BOT.V600E | BOT 與 lgOvCa | BOT 與 hgOvCa | BOT.V600E 與 lgOvCa | BOT.V600E 與 hgOvCa | 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與 hgOvCa |
| TP53 | 5.84 × 10 −9 (↑hgOvCa) | 1.35 × 10 −4 (↑hgOvCa) | ||||
| BRCA1 | 3.98 × 10 −3 (↑hgOvCa) | |||||
這里值得一提的另外兩個(gè)基因是BRCA1和BRCA2，因?yàn)樵诒净蚪獯a中，它們的突變譜似乎不僅取決于所使用的基因組，還取決于基因變異對(duì)這些基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的影響。在 44 基因組中，如果考慮中等影響變異，則上述兩個(gè)基因在 BOT 中的變異頻率高于 hgOvCa。如果包括BRCA2基因中影響較大的變異，這種規(guī)律仍然適用。相比之下，只有影響較大的BRCA1變異在高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中出現(xiàn)的頻率遠(yuǎn)高于所有其他卵巢腫瘤組（表 1）。在熱點(diǎn)組中，不包括BRCA2基因，而無(wú)論僅考慮影響較大的變異還是考慮所有基因變異，hgOvCa中的BRCA1多態(tài)性數(shù)量都明顯高于 BOT。
在本基因解碼中，KRAS基因的高強(qiáng)度或中等影響變異最能將 BOT 與除 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）之外的所有其他腫瘤組區(qū)分開(kāi)來(lái)。在另外兩個(gè)參與泛素化的基因FANCB和SEM1中，中等影響變異在 BOT 中的出現(xiàn)頻率明顯高于在 OvCa ( SEM1 ) 或高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）( FANCB ) 中出現(xiàn)的頻率。值得注意的是，這兩個(gè)基因的變異并不能將 BOT 與 BOT.V600E 區(qū)分開(kāi)來(lái)。此外，在本基因解碼的兩個(gè)小組基因解碼的 76 個(gè)不同基因中，BRAF是唯一一個(gè)在 BOT.V600E 腫瘤中突變頻率高于所有其他組的基因。
與 BOT.V600E 和高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）相比， KRAS基因變異不僅在 BOT 中頻繁發(fā)生，在 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中也同樣頻繁發(fā)生。除KRAS外，另外兩個(gè)基因ATM和NRAS的變異在 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中也較為常見(jiàn)。在 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中，ATM 的變異頻率高于在 BOT.V600E 組中，但這種規(guī)律性?xún)H限于中等影響的變異。至于NRAS，與其余三個(gè)腫瘤組相比，該基因的中等影響變異在 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中較為常見(jiàn)。
為了驗(yàn)證所選基因的多態(tài)性，佳學(xué)基因檢測(cè)采用了梯度PCR結(jié)合桑格測(cè)序的方法。通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)，佳學(xué)基因檢測(cè)成功驗(yàn)證了TP53基因中一個(gè)先前發(fā)現(xiàn)的變異（chr17:g.7670658_7670659insA，p.Lys351Ter）以及七個(gè)新的變異（SNP和非SNP），這些變異對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/功能具有中等或高度影響。驗(yàn)證結(jié)果及每個(gè)分析多態(tài)性的詳細(xì)描述如圖S3所示。
基因解碼如何提高基因檢測(cè)和臨床治療的有效性
本基因解碼旨在分析不同侵襲性卵巢腫瘤中關(guān)鍵抑癌基因和致癌基因的遺傳變異。佳學(xué)基因檢測(cè)不僅評(píng)估了這些基因在大規(guī)模、特征明確的卵巢癌（OvCa）和卵巢癌旁組織（BOTS）患者隊(duì)列中的多態(tài)性狀態(tài)，還發(fā)現(xiàn)了這兩組腫瘤的預(yù)測(cè)和/或預(yù)后標(biāo)志物，并分析了特定多態(tài)性對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。
出乎意料的是，佳學(xué)基因檢測(cè)對(duì) 44 個(gè)基因面板獲得的 NGS 結(jié)果顯示，與 BOT.V600E、低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）或高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）相比，BOT 中對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和/或功能具有高度或中度或僅有中度影響的 SNP 數(shù)量更高。相反，當(dāng)僅分析選定基因中的熱點(diǎn)時(shí)，BOT 中具有這些影響的 SNP 變體的頻率明顯低于兩個(gè) OvCa 組。這種明顯的差異可以通過(guò)本基因解碼中調(diào)查的兩個(gè)面板包含不同的基因集來(lái)解釋。如本基因解碼所證明的，與其他腫瘤組（FANCB、SEM1、FANCA、BRCA2、CHEK2、MUTYH、RAD50）相比，BOT 中 44 個(gè)基因面板中突變更頻繁的基因列表比熱點(diǎn)面板（僅KRAS ）中類(lèi)似改變的基因長(zhǎng)得多。此外，熱點(diǎn)組的設(shè)計(jì)初衷是基因解碼眾所周知的基因變異。相比之下，44基因組覆蓋的基因組區(qū)域大約大10倍，能夠檢測(cè)出通常在診斷方法中被忽略的罕見(jiàn)遺傳變異。然而，當(dāng)僅考慮對(duì)蛋白質(zhì)功能和/或結(jié)構(gòu)影響較大的多態(tài)性時(shí)，兩個(gè)組中鑒定出的遺傳變異數(shù)量在hgOvCa中最高，從而支持了關(guān)于卵巢癌的普遍認(rèn)識(shí)。
TP53的突變狀態(tài)可被認(rèn)為是區(qū)分 hgOvCa（ TP53頻繁突變）與 BOTS（無(wú)突變或非常罕見(jiàn)突變）和 lgOvCa（相對(duì)罕見(jiàn)突變）的最佳標(biāo)記之一。與這些報(bào)告一致，TP53 是本基因解碼中最常見(jiàn)的變異基因之一，主要在高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中。相比之下，除了在 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）樣本中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)覆蓋率較低且影響較大的 SNP 外，佳學(xué)基因檢測(cè)在 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）病例中未發(fā)現(xiàn)TP53變異。有趣的是，這些 SNP 僅在熱點(diǎn)面板中檢測(cè)到，利用了一種新穎的 NGS 雜交捕獲技術(shù)（稱(chēng)為引物延伸靶向富集，KAPA HyperPETE，Roche），比 44 基因面板中使用的較舊的基于雜交的捕獲方法（KAPA HyperCap，Roche）提供了更好的測(cè)序覆蓋均勻性。至于 BOTS，本基因解碼發(fā)現(xiàn)的TP53中僅有的兩個(gè)錯(cuò)義變體是在兩個(gè)粘液亞型的 BOT 樣本中觀察到的。鑒于 Kang 等人報(bào)道 19.4％ 的粘液 BOTS 中存在 TP53 突變，這與較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，該結(jié)果也與當(dāng)前的知識(shí)狀態(tài)相符。佳學(xué)基因檢測(cè)的兩名TP53突變攜帶 BOT 患者中始終有一名進(jìn)展為 OvCa。值得注意的是，本文佳學(xué)基因檢測(cè)還通過(guò)觀察高影響非SNP變異樣本中TP53的缺失以及含有TP53錯(cuò)義SNP的腫瘤中TP53的積累，在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證了TP53的NGS結(jié)果。這些結(jié)果與佳學(xué)基因檢測(cè)之前對(duì)TP53表達(dá)的免疫組織化學(xué)評(píng)估結(jié)果一致。
根據(jù)文獻(xiàn)，除了TP53的遺傳畸變外， BRCA1/2的突變?cè)诟呒?jí)別卵巢癌（hgOvCa）中也很常見(jiàn)，而在 BOTS 和 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中很少見(jiàn)。佳學(xué)基因檢測(cè)使用 44 個(gè)基因面板獲得的結(jié)果似乎與文獻(xiàn)并不完全一致，因?yàn)榧褜W(xué)基因檢測(cè)在許多非高級(jí)別卵巢腫瘤中發(fā)現(xiàn)BRCA1/2基因變異。然而，需要強(qiáng)調(diào)的是，除了單個(gè) BOT 中的一個(gè) SNP 外，這些只是中等影響的變異。與高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）相比，這些變異解釋了BOT 中BRCA1/BRCA2中發(fā)現(xiàn)的遺傳變異數(shù)量顯著增加。然而，當(dāng)只考慮高影響變異時(shí)，與所有其余腫瘤組相比， BRCA1（而不是BRCA2）在高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中的改變頻率如預(yù)期的那樣更高。相比之下，在熱點(diǎn)組（僅集中于已確定的變異，而忽略了大多數(shù)基因解碼不足的基因變異）中，BOT 或 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中未發(fā)現(xiàn)具有高/中等影響的BRCA1多態(tài)性，而在一個(gè) BOT.V600E 樣本中僅存在一個(gè)中等影響的變異。因此，當(dāng)僅考慮BRCA1基因中常見(jiàn)的熱點(diǎn)時(shí)，佳學(xué)基因檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)工作流程證實(shí)了與 BOT 相比，hgOvCa 中該基因序列變異普遍占優(yōu)勢(shì)這一事實(shí)。盡管如此，根據(jù)最近一項(xiàng)針對(duì)大型隊(duì)列（包含 1333 名 OvCa 患者和 152 名 BOTS 患者）進(jìn)行的 NGS 基因解碼，高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）和 BOTS 中BRCA1/2突變的患病率相似（分別為 30.9% 和 28.9%）。因此，本文似乎證實(shí)了佳學(xué)基因檢測(cè)利用 44 個(gè)基因面板得出的結(jié)論，即如果應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)（不僅限于已知的熱點(diǎn)），則可以在 BOTS 中檢測(cè)到BRCA1中的大量遺傳變異。至于BRCA2 ，與BRCA1類(lèi)似，與高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）相比，該基因的中等影響變異在 BOT 中占主導(dǎo)地位。相反，佳學(xué)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在所基因解碼的卵巢腫瘤組之間，高強(qiáng)度BRCA2多態(tài)性的頻率沒(méi)有差異。盡管如此，在本基因解碼中， BRCA2成為高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中有希望的、有利的預(yù)測(cè)和預(yù)后標(biāo)志物。BRCA2序列變異的存在改善了患者的 OS、CR 和 PS，尤其是在沒(méi)有 TP53 積累的腫瘤中。雖然考慮到該基因的腫瘤抑制能力，這種結(jié)果可能看起來(lái)很奇怪，但早些時(shí)候在小細(xì)胞肺癌中也觀察到了類(lèi)似的現(xiàn)象，其中引用的基因解碼的作者報(bào)告了BRCA2突變的發(fā)生與腫瘤對(duì)化療的更高敏感性之間的聯(lián)系。與這些結(jié)果一致，體外獲得的數(shù)據(jù)也為 BRCA 缺陷腫瘤對(duì)鉑類(lèi)藥物的反應(yīng)更好提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，體外基因解碼進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，其中BRCA突變攜帶者在接受鉑類(lèi)藥物治療后表現(xiàn)出更好的生存期和更長(zhǎng)的無(wú)病間隔。由于 BRCA1/BRCA2 蛋白負(fù)責(zé)修復(fù)雙鏈 DNA 斷裂 (DSB)，BRCA2中致病變異的存在會(huì)導(dǎo)致其蛋白產(chǎn)物活性受損，從而增加腫瘤細(xì)胞中發(fā)生 DSB 的風(fēng)險(xiǎn)。如果這樣的細(xì)胞表達(dá)功能性 TP53（未觀察到 TP53 積累），則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而改善鉑類(lèi)治療的效果，如本文所示。
至于低侵襲性卵巢腫瘤的基因變異特征，與高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）相比，BOTS 和 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中多態(tài)性數(shù)量最多的基因是KRAS、BRAF和NRAS，這與科學(xué)文獻(xiàn) 。鑒于攜帶BRAF V600E 變異的 BOTS 患者比未攜帶該變異的患者年輕得多，因此本文對(duì)這兩組腫瘤分別進(jìn)行了分析。有趣的是， BOT 和 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中KRAS的突變頻率高于 BOT.V600E 或 hgOvCa，而 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）和 BOT 中KRAS變異的頻率相當(dāng)。這證實(shí)了這兩組腫瘤之間的分子相似性。同時(shí)，這一結(jié)果還表明，在缺乏BRAF V600E 變異（這是該基因最常見(jiàn)的多態(tài)性，本基因解碼中約 72% 的BRAF缺陷型腫瘤中發(fā)現(xiàn)）的 BOTS 中存在 KRAS 激活突變。KRAS 依賴(lài)的致癌機(jī)制主要取決于該基因 Gly12 (G12) 編碼區(qū)的突變，在佳學(xué)基因檢測(cè)的基因解碼中，這種突變?cè)?BOT 和 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中都占主導(dǎo)地位。相比之下，佳學(xué)基因檢測(cè)在少數(shù)高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）腫瘤中發(fā)現(xiàn)的KRAS多態(tài)性均不影響 Gly12。此外，值得一提的是，佳學(xué)基因檢測(cè)所有三個(gè)具有除 V600E 之外的BRAF變異（即 K601E、G466R 和 G466V）的 BOT 病例都同時(shí)含有KRAS G12 變異。這表明，在所有BRAF多態(tài)性中，只有BRAF V600E 具有足夠強(qiáng)的促癌作用，可以獨(dú)立于KRAS突變發(fā)揮作用。至于NRAS變異體，它們的流行程度將 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）與佳學(xué)基因檢測(cè)基因解碼中調(diào)查的所有其他腫瘤組區(qū)分開(kāi)來(lái)。這一結(jié)果支持了其他人的發(fā)現(xiàn)，即NRAS突變存在于漿液性 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中，但在漿液性 BOTS 中沒(méi)有或很少 。與KRAS中的激活突變類(lèi)似， NRAS中的對(duì)應(yīng)突變也會(huì)加速腫瘤進(jìn)展。此外，在復(fù)發(fā)性漿液性 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）中也發(fā)現(xiàn)了此類(lèi)變異體。在此背景下，值得一提的是，佳學(xué)基因檢測(cè)的一個(gè)具有微浸潤(rùn)的漿液性 BOT 樣本含有 NRAS 激活變異體 (p.Gln61Arg) ，這在佳學(xué)基因檢測(cè)的 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）組中也最常發(fā)生。BOT 樣本中存在這種突變，不僅進(jìn)一步證實(shí)了 BOT 與 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）之間的分子相似性，而且還意味著如果沒(méi)有完全切除，這種 BOT 腫瘤可能會(huì)轉(zhuǎn)變并復(fù)發(fā)為 lgOvCa。根據(jù)文獻(xiàn)，在晚期卵巢癌中，NRAS突變很少見(jiàn)。佳學(xué)基因檢測(cè)在高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）系列中始終沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此類(lèi)基因改變。值得注意的是，在其他人類(lèi)惡性腫瘤（例如結(jié)直腸癌和子宮內(nèi)膜癌）中也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)KRAS、NRAS和BRAF基因突變。
編碼參與泛素化的蛋白質(zhì)的基因在 BOT 中也更頻繁地發(fā)生改變，并將這些腫瘤與 OvCa 區(qū)分開(kāi)來(lái)（但與 BOT.V600E 無(wú)區(qū)別）。其中一個(gè)基因SEM1編碼 26S 蛋白酶體亞基，在所有腫瘤組中都經(jīng)常發(fā)生改變。盡管在所有腫瘤組中發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)變體 p.Gln59Pro 在人類(lèi)群體中廣泛存在（最大等位基因頻率 (AF max ) 為 0.88）；但 BOT 中SEM1變體的總數(shù)明顯高于 低級(jí)別卵巢癌（lgOvCa）或 hgOvCa。目前，還沒(méi)有關(guān)于這種多態(tài)性在腫瘤中的作用的科學(xué)報(bào)告。第二個(gè)基因FANCB編碼的是 FANCD2 泛素化所必需的 DNA 修復(fù)相關(guān)蛋白質(zhì)，關(guān)于 OvCa 的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)很少，而其在 BOTS 中的功能迄今尚未基因解碼。FANCB錯(cuò)義突變已被證明會(huì)導(dǎo)致催化模塊不穩(wěn)定和范康尼貧血 (FA) 核心復(fù)合物功能障礙。相比之下，F(xiàn)ANCB 3′UTR中的 SNP不會(huì)影響蛋白質(zhì)的表達(dá)或功能。鑒于佳學(xué)基因檢測(cè)基因解碼中發(fā)現(xiàn)的所有FANCB多態(tài)性都位于基因的編碼序列中，它們的出現(xiàn)可能會(huì)損害 FANCB 功能，如上述基因解碼所證實(shí)。有趣的是，根據(jù)目前的知識(shí)水平，F(xiàn)ANCB在癌癥中的作用似乎存在分歧。一方面，在遺傳性乳腺癌/卵巢癌中未發(fā)現(xiàn)該基因突變，也未證明FANCB與BRCA1/2陰性家族性癌癥的發(fā)展之間有任何關(guān)聯(lián)。另一方面，Matta等人揭示了在DNA修復(fù)能力下降的老年患者中， FANCB的表達(dá)與乳腺癌之間的關(guān)系。在此背景下，佳學(xué)基因檢測(cè)的基因解碼結(jié)果似乎為FANCB的臨床重要性提供了新的見(jiàn)解，表明該基因在BOTS中可能比在OvCa中發(fā)揮更重要的作用。
佳學(xué)基因檢測(cè)的回歸分析顯示， PARP1基因變異是 BOTS 預(yù)后不良的標(biāo)志。該基因編碼一種由 DNA 損傷激活的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)包括 TP53 在內(nèi)的許多腫瘤抑制因子的功能。文獻(xiàn)中關(guān)于PARP1在 BOTS 中的作用的數(shù)據(jù)有限；然而，其在 OvCa 中的意義已被深入基因解碼。因此，PARP 抑制劑已被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)性鉑敏感的BRCA1 / 2缺陷型 OvCa的維持治療。然而，較新的數(shù)據(jù)顯示，除了BRCA1/2突變患者外，其他腫瘤也具有治療益處。值得注意的是，在本文分析的所有腫瘤組中最常見(jiàn)的PAPR1多態(tài)性 p.Val762Ala 與導(dǎo)致對(duì) PARP 抑制劑之一奧拉帕尼產(chǎn)生耐藥性的多態(tài)性不同。盡管 p.Val762Ala 變異在人類(lèi)中占主導(dǎo)地位（AF最大值約為 45%），但此前已發(fā)現(xiàn)該變異與多種癌癥相關(guān)，包括膽囊癌。同樣的多態(tài)性也增加了沙特和亞洲人群患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)降低了白種人患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。有趣的是，盡管其他科學(xué)家報(bào)告稱(chēng)漿液性 OvCa 中的PARP1表達(dá)高于 BOTS，但在佳學(xué)基因檢測(cè)的高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）系列中，該基因的改變頻率既沒(méi)有更高，也沒(méi)有被確定為潛在的生物標(biāo)志物。
本文將另外兩個(gè)編碼參與 FA 通路的蛋白質(zhì)的基因 FANCF 和 FANCI 的多態(tài)性確定為高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）中有希望的結(jié)果預(yù)測(cè)因子。值得注意的是，根據(jù) AUC 值評(píng)估，F(xiàn)ANCI中的變異表現(xiàn)出明顯優(yōu)于FANCF中的變異的判別能力。FANCI 蛋白與 FANCD2 形成異二聚體，隨后被 FA 核心復(fù)合物單泛素化。這種異二聚體定位到受損的染色質(zhì)并促進(jìn)鏈間交聯(lián)修復(fù)。在佳學(xué)基因檢測(cè)的分析中， FANCI基因變異的存在增加了接受 TP 治療但腫瘤缺乏 TP53 積累的患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)考慮文獻(xiàn)數(shù)據(jù)時(shí)， FANCI的作用似乎不明確，因?yàn)閾?jù)報(bào)道該基因既具有致癌作用，又具有抑癌作用。此外，F(xiàn)ANCI最近被認(rèn)為是FANCI p.Leu605Phe 變異攜帶者的一種新的卵巢癌易感基因，事實(shí)證明，在BRCA1/2基因正常的卵巢癌易感家族中，這種基因的頻率明顯較高。體外基因解碼表明，F(xiàn)ANCI 的 Leu605Phe 異構(gòu)體表達(dá)水平降低，并導(dǎo)致 HeLa 和卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感，但對(duì) PARP 抑制劑不敏感。與此一致的是，佳學(xué)基因檢測(cè)的 WB 分析顯示，攜帶FANCI p.Leu605Phe 變異和BRCA1/2基因正常的腫瘤不表達(dá)突變的 FANCI，而在BRCA1/2缺陷型腫瘤中檢測(cè)到了 FANCI 表達(dá)。此外，相同的 WB 分析揭示了 FANCI 和 FANCD2 蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性。所有這些結(jié)果清楚地表明， FANCI的作用取決于細(xì)胞中由關(guān)鍵腫瘤抑制因子（例如 BRCA1/2 和 TP53）控制的分子背景。
佳學(xué)基因檢測(cè)最后一個(gè)值得討論的結(jié)果是關(guān)于CHEK1 的無(wú)義變體 (chr11:g.125625996G>A, p.Trp79Ter)，佳學(xué)基因檢測(cè)觀察到 CHEK1 蛋白的意外高表達(dá)。有趣的是，這兩種分子現(xiàn)象似乎呈正相關(guān)（變異等位基因的比例越高，膜上 CHEK1 的信號(hào)越強(qiáng)）。該 SNP 位于CHEK1的第一個(gè)外顯子/5'UTR 區(qū)域。如果考慮 CHEK1 的最長(zhǎng)異構(gòu)體 ( XP_011540862.1 )，則討論的多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致提前終止密碼子的形成。在這種情況下，使用位于新形成的終止密碼子下游的替代起始密碼子，不僅可以恢復(fù) CHEK1 以較短異構(gòu)體的形式表達(dá)，還會(huì)同時(shí)影響其在細(xì)胞中的水平。文獻(xiàn)一致表明，短的 CHEK1 異構(gòu)體可能由于選擇性剪接或蛋白質(zhì)裂解而出現(xiàn)。CHEK1 在腫瘤發(fā)生中的作用尚不明確。最初，由于 CHEK1 在 DNA 損傷反應(yīng)和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)反應(yīng)中發(fā)揮作用，它被認(rèn)為是一種抑癌基因。然而，并未發(fā)現(xiàn)人類(lèi)癌癥中存在純合CHEK1功能喪失突變體的證據(jù)。此外， CHEK1基因在多種實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤分級(jí)和疾病復(fù)發(fā)相關(guān)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是， CHEK1的完全缺失會(huì)抑制化學(xué)誘導(dǎo)的致癌作用，而CHEK1水平升高的腫瘤細(xì)胞可能由于能夠抵抗化療引起的 DNA 損傷而獲得生存優(yōu)勢(shì)。因此，據(jù)報(bào)道，在膀胱癌、腦癌、肺癌、卵巢癌和乳腺癌中，CHEK1高表達(dá)患者的生存率較低。雖然佳學(xué)基因檢測(cè)的基因解碼結(jié)果未能闡明 CHEK1 在卵巢腫瘤中的作用機(jī)制究竟更像致癌基因還是抑癌基因，但進(jìn)一步基因解碼其變異體似乎對(duì)利用選擇性 CHEK1 抑制劑 Prexasertib 進(jìn)行靶向治療具有重要意義。Prexasertib 單藥或與 PARP 抑制劑聯(lián)合使用，均可促進(jìn)腫瘤消退并延長(zhǎng)高級(jí)別卵巢癌（hgOvCa）患者的生存期。由于PARP1多態(tài)性已被確定為此類(lèi)腫瘤的負(fù)面預(yù)后標(biāo)志物，且部分 BOTS 也含有上述CHEK1 p.Trp79Ter 變異體，因此此類(lèi)抑制劑組合可能對(duì) BOTS 具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
最后，與每項(xiàng)基因解碼一樣，本基因解碼也存在一些局限性，應(yīng)該在此提及。盡管佳學(xué)基因檢測(cè)設(shè)法識(shí)別出許多遺傳變異，但由于財(cái)務(wù)和時(shí)間方面的限制，佳學(xué)基因檢測(cè)僅對(duì)這些多態(tài)性的一小部分進(jìn)行了功能驗(yàn)證。因此，列出的許多已識(shí)別變異的臨床意義仍不清楚，應(yīng)在未來(lái)的基因解碼中予以解決。此外，需要強(qiáng)調(diào)的是，在佳學(xué)基因檢測(cè)的生物信息學(xué)工作流程中，所有頻率低于 10% 的序列變異都被過(guò)濾掉了。這種方法被用來(lái)降低假陽(yáng)性率，然而，假設(shè)一些罕見(jiàn)的、具有臨床重要性的多態(tài)性也被排除在分析之外。下一個(gè)值得一提的局限性在于佳學(xué)基因檢測(cè)分析了大量腫瘤樣本，而這些樣本只是整個(gè)腫瘤微環(huán)境的一部分，由于本基因解碼中采用的實(shí)驗(yàn)裝置的限制，可能無(wú)法完全捕捉到其復(fù)雜性和異質(zhì)性。此外，就腫瘤的復(fù)雜性和異質(zhì)性而言，佳學(xué)基因檢測(cè)注意到，在佳學(xué)基因檢測(cè)的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中，在同一凝膠上分析的不同 OvCa 樣本的裂解物時(shí)，上樣對(duì)照有時(shí)會(huì)有所不同。這種不一致不是由實(shí)驗(yàn)室錯(cuò)誤或不精確造成的，而是與卵巢腫瘤的巨大生物多樣性有關(guān)，尤其是高級(jí)別 OvCa，這是由此類(lèi)惡性腫瘤的基因組和蛋白質(zhì)組不穩(wěn)定性造成的。在本基因解碼中，為了減少得出錯(cuò)誤結(jié)論的風(fēng)險(xiǎn)，所有蛋白質(zhì)裂解物的濃度不僅通過(guò)麗春紅 S 染色評(píng)估，而且還用 BCA 方法和牛血清白蛋白 (BSA) 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)精確測(cè)量和標(biāo)準(zhǔn)化。最后，本基因解碼是在一組回顧性（而非前瞻性）患者中進(jìn)行的，這些患者收集了 20 年，進(jìn)行了細(xì)致的隨訪(fǎng)，并仔細(xì)檢查了所有臨床病理參數(shù)的兼容性。這種方法雖然被廣泛使用，但可能會(huì)引入一些難以定義的偏見(jiàn)，并限制控制潛在混雜因素的能力。
