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圖1：配對(duì)的循環(huán)腫瘤 DNA (ctDNA) 外顯子組測(cè)序揭示了氟維司群和哌柏西利的頻繁克隆選擇

A – 使用液滴數(shù)字 PCR 和靶向 SNP 測(cè)序方法篩選來(lái)自 PALOMA-3 試驗(yàn)的第 1 天和治療結(jié)束時(shí)的血漿樣本，以確定來(lái)自 palbociclib 加氟維司群組的患者，這些患者的血漿樣本具有足夠的腫瘤純度（>10% ) 用于血漿外顯子組測(cè)序。

B – 對(duì) 390 號(hào)患者進(jìn)行的配對(duì) ctDNA 外顯子組測(cè)序分析了克隆組成。在 EOT 處檢測(cè)到新出現(xiàn)的 RB1 突變克隆，其中包含兩個(gè)失活的 RB1 突變。

C – 來(lái)自 ctDNA 的患者 390 的乳腺癌系統(tǒng)發(fā)育樹推斷。黃色 - 存在于所有癌細(xì)胞中的軀干突變；第 1 天出現(xiàn)的紫色亞克隆隨后在治療中消退：灰色 - 一種新出現(xiàn)的抗性克隆，其特征在于兩個(gè) RB1 突變，分別產(chǎn)生于紫色亞克隆。

D – 在患者 390 的每個(gè)亞克隆中識(shí)別的突變特征的表示。原始數(shù)據(jù)顯示在補(bǔ)充表 3 中。

E – 在患者 390 的抗治療亞克隆中鑒定的兩個(gè) RB1 突變 Q257X 和 N519fs 的數(shù)字 PCR 驗(yàn)證。顯示第 1 天和 EOT 的結(jié)果，Y 軸突變體探針?lè)群?X 軸野生型探針?lè)取?/div>

F – 患者 253 的配對(duì) ctDNA 外顯子組測(cè)序分析了克隆組成。在 EOT 檢測(cè)到在第 1 天檢測(cè)不到的新 FGFR2 突變體克隆。

G——從 ctDNA 中推斷出的來(lái)自患者 253 的乳腺癌系統(tǒng)發(fā)育樹。黃色 - 存在于所有癌細(xì)胞中的軀干突變；紫色 - 以第 1 天出現(xiàn)的 ESR1 D538G 突變?yōu)樘卣鞯膩喛寺?，隨后在治療中消退；橙色——以 FGFR2 激酶結(jié)構(gòu)域突變?yōu)樘卣鞯男鲁霈F(xiàn)的抗性克隆，與紫色亞克隆分開產(chǎn)生；灰色——由以 Q75E ESR1 突變?yōu)樘卣鞯?FGFR2 突變亞克隆產(chǎn)生的亞克隆。

H – 在來(lái)自患者 253 的每個(gè)個(gè)體克隆中識(shí)別的突變特征的表示。原始數(shù)據(jù)顯示在補(bǔ)充表 3 中。

I – 來(lái)自患者 253 的 FGFR2 突變的數(shù)字 PCR 驗(yàn)證顯示第 1 天和 EOT 的血漿結(jié)果。

EOT – 治療結(jié)束，HR – 同源重組，MMR – 錯(cuò)配修復(fù)，ctDNA – 循環(huán)腫瘤 DNA

血漿 DNA 外顯子組測(cè)序的中位深度為 164X（范圍 139-212），種系 DNA 的中位深度為 47X（范圍 34-58）。第 1 天的兩個(gè)樣品有污染證據(jù)，這些對(duì)被排除在比較、配對(duì)分析之外。第 1 天樣本中可檢測(cè)到的非同義變異的數(shù)量在患者之間差異很大（范圍 19 – 254）。對(duì)所有樣本的突變特征分析表明，最普遍的是特征 1（年齡）和 3（同源重組缺陷），這與現(xiàn)有的乳腺癌數(shù)據(jù)一致 (16)。第 1 天的外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)還揭示了除 ESR1 突變外可能與內(nèi)分泌耐藥性發(fā)展相關(guān)的遺傳標(biāo)記——4/14 (28.6%) 患者的 NOTCH 家族受體 NOTCH2、NOTCH3 和 NOTCH4 突變，以及 2/14 患者的 NF1 突變 (14.3%)。大多數(shù)患者的基因組不穩(wěn)定性指數(shù)在第 1 天和治療結(jié)束之間大致穩(wěn)定，但從突變負(fù)荷來(lái)看，患者之間存在相當(dāng)大的差異。

在第 1 天和 EOT 血漿中，85.7% 12/14 患者的克隆進(jìn)化和選擇在 palbociclib 加氟維司群中明顯可見（圖 1）。 390 號(hào)患者有兩個(gè) RB1 截短突變，p.Q257X 和 p.N519fs，僅在治療結(jié)束時(shí)檢測(cè)到（圖 1B）。使用 PyClone 進(jìn)行的克隆性分析 (17) 表明這些 RB1 突變存在于耐藥亞克隆中，或者可能是平行進(jìn)化導(dǎo)致表型收斂的獨(dú)立亞克隆，進(jìn)一步的治療敏感亞克隆明顯以 RUNXT1 突變?yōu)樘卣?，該突變?cè)谥委熀笸嘶▓D 1C). 由 PyClone 模型確定的每個(gè)亞克隆的突變計(jì)數(shù)為 155（簇 1）、64（簇 2）和 51（簇 3）。抗性亞克隆中的突變主要與 APOBEC 突變特征一致（圖 1D，補(bǔ)充表 3）。 RB1 突變通過(guò)數(shù)字 PCR 驗(yàn)證，并確認(rèn)在治療開始時(shí)不存在（圖 1E）。

第二名患者，253，在使用 palbociclib 加氟維司群治療期間表現(xiàn)出明顯的亞克隆選擇，該亞克隆具有 FGFR2 p.K569E 酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的激活突變，在第 1 天樣本中未檢測(cè)到（圖 1F）。由 PyClone 模型確定的每個(gè)亞克隆的突變計(jì)數(shù)為 51（簇 1）、49（簇 2）、54（簇 3）和 20（簇 4）。新的顯性抗性亞克隆，以及一個(gè)額外的 ESR1 突變體 Q75E 子克隆，取代了第 1 天 ESR1 D538G 突變體克隆，該克隆被處理負(fù)選擇（圖 1G）。由于 Q75E 不是公認(rèn)的芳香化酶抑制劑耐藥性原因，并且位于 ESR1 的配體結(jié)合域之外，因此本病例中的這些發(fā)現(xiàn)表明，第 1 天和 EOT 之間顯性 ESR1 突變的變化可能反映了亞克隆選擇可能與功能性無(wú)關(guān) ESR1 突變的后果，不同的 ESR1 突變標(biāo)記單個(gè)克隆而不是潛在出現(xiàn)的抗性克隆。正如患者 390 中的耐藥亞克隆所見，患者 253 中新顯性 FGFR2 突變亞克隆也有很大一部分突變與 APOBEC 特征一致，次要子克隆突變以錯(cuò)配修復(fù)特征為主（圖 1H） ). FGFR2 突變的選擇通過(guò)數(shù)字 PCR 驗(yàn)證（圖 1I）。在另外三名患者中，可能有證據(jù)表明在抗原呈遞途徑中選擇了緊急突變。

這些發(fā)現(xiàn)表明，在使用哌柏西利聯(lián)合氟維司群的乳腺癌中，克隆進(jìn)化很常見，有證據(jù)表明，出現(xiàn)的亞克隆的基因組可塑性可以由治療開始時(shí)占主導(dǎo)地位的大量疾病的不同突變過(guò)程驅(qū)動(dòng)。

【佳學(xué)基因檢測(cè)】血漿DNA的外顯子組測(cè)序揭示了哌柏西利,palbociclib加氟維司群治療后的基因變化

【佳學(xué)基因檢測(cè)】血漿DNA的外顯子組測(cè)序揭示了哌柏西 palbociclib加氟維司群治療后的基因變化