【佳學(xué)基因檢測(cè)】腫瘤耐藥性基因檢測(cè)的藥物抗性因素鑒定

治療對(duì)PIK3CA 突變的選擇

對(duì)于 PIK3CA，考慮到兩個(gè)治療組，在第 1 天的樣本中鑒定出 37 名患者的 39 種變異 (37/195, 19.0%)（圖 2A），這與之前的發(fā)現(xiàn)一致并表明多克隆性水平較低。 在第 1 天出現(xiàn)的幾乎所有 PIK3CA 突變?cè)谥委熀蠖嫉玫搅司S持 (37/39, 95.7%)，這與其中大多數(shù)是克隆/主干突變一致（圖 2C）。 治療結(jié)束時(shí)，檢測(cè)到來(lái)自兩個(gè)治療組的 52 名患者的 55 種 PIK3CA 變異 (52/195, 26.7%)，與第 1 天相比有所增加（圖 2A，p = 0.00069，McNemar 檢驗(yàn)）。 總體而言，8.2% 的患者獲得了 PIK3CA 突變（16/195，其中一名患者獲得了 2 個(gè)單獨(dú)的突變，另一名患者獲得了一個(gè)額外的 PIK3CA 變體（圖 2C）。獲得的 PIK3CA 突變已通過(guò) ddPCR 對(duì) H1047R、H1047L、E545K 進(jìn)行了驗(yàn)證 和 E542K（賊常見(jiàn)，占 16/18 的獲得性變異），其中 100% (16/16) 驗(yàn)證并顯示與測(cè)序等位基因分?jǐn)?shù)估計(jì)密切一致 (r = 0.97)?？紤]到特定的 PIK3CA 突變，有一些 E542K 陽(yáng)性選擇的證據(jù)有限（p = 0.041，McNemar 的連續(xù)性校正檢驗(yàn)，q = 0.41，Bonferroni 校正）。使用數(shù)字 PCR 測(cè)試第 1 天的樣本，少數(shù)獲得的 PIK3CA 突變?cè)?第 1 天通過(guò)數(shù)字 PCR（6/18，33.3%，），其中大多數(shù)的等位基因頻率非常低，低于 ctDNA 測(cè)序的檢測(cè)限，為一些患者提供了先前存在的輕微 PIK3CA 生長(zhǎng)的證據(jù) 突變亞克隆。 在包含第 1 天數(shù)字 PCR 數(shù)據(jù)的分析中，治療結(jié)束時(shí) PIK3CA 突變患者比例的增加仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p = 0.016，McNemar 檢驗(yàn)）。 獲得新檢測(cè)到的 PIK3CA 突變的患者比例在治療組之間似乎沒(méi)有差異（圖 2C）。 這些數(shù)據(jù)與賊初 PIK3CA 野生型腫瘤的一部分一致，要么積極選擇流行率非常低的 PIK3CA 突變亞克隆，要么在用氟維司群治療時(shí)新獲得它們。

腫瘤靶向藥物治療對(duì)ESR1 Y537S的選擇

在治療開(kāi)始時(shí) 25.1% 的患者中觀察到 ESR1 突變（49/195，25.1%，圖 2A），在治療結(jié)束時(shí)具有 ESR1 突變的患者總數(shù)相似（61/195，31.3%） , p = 0.07 McNemar 檢驗(yàn)）。 然而，6.7% (13/195) 的患者在基線時(shí)檢測(cè)到 ESR1 突變，但在進(jìn)展時(shí)未檢測(cè)到 ESR1 突變，同樣，在基線時(shí)未檢測(cè)到 ESR1 突變的患者中有 12.8% (25/195) 有新獲得的突變 在進(jìn)展中（補(bǔ)充圖 14）。 通過(guò)數(shù)字 PCR 評(píng)估基線時(shí)的 ESR1 突變狀態(tài)顯示與測(cè)序結(jié)果總體一致。

考慮到個(gè)體 ESR1 突變，有強(qiáng)有力的證據(jù)表明通過(guò)兩個(gè)治療組的治療，ESR1 Y537S 的特異性陽(yáng)性選擇（p = 0.0037，McNemar 檢驗(yàn)，q = 0.047，Bonferroni 校正圖 3A）。 所有獲得的 Y537S 突變都在治療樣本結(jié)束時(shí)通過(guò)數(shù)字 PCR 重復(fù)測(cè)試進(jìn)行了驗(yàn)證（17/17，圖 3B）。 考慮到在任一時(shí)間點(diǎn)都有 Y537S 調(diào)用的樣本，有少數(shù)獲得性 ESR1 Y537S 突變?cè)诘?1 天可通過(guò)數(shù)字 PCR 檢測(cè)到“獲得性”突變（3/17，17.6%，圖 3C），提供證據(jù) 在一些患者中生長(zhǎng)出一個(gè)較小的預(yù)先存在的 ESR1 Y537S 突變體亞克隆。 在包括第 1 天和治療結(jié)束時(shí)的數(shù)字 PCR 數(shù)據(jù)的分析中，治療結(jié)束時(shí) ESR1 Y537S 突變患者比例的增加仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p = 0.0019，McNemar 檢驗(yàn)）。 對(duì)第 1 天有 Y537S 突變的患者與在治療結(jié)束時(shí)獲得 Y537S 的患者進(jìn)行無(wú)進(jìn)展生存期探索性分析顯示，盡管數(shù)量較少，但仍具有顯著性趨勢(shì)（對(duì)數(shù)秩 p = 0.011）。 治療組之間在獲得特定 ESR1 突變方面沒(méi)有明顯差異。 總之，這些數(shù)據(jù)與 ESR1 Y537S 在臨床上促進(jìn)對(duì)氟維司群的耐藥性一致。

治療過(guò)程中突變克隆的演變過(guò)程

接下來(lái)，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)對(duì)比了在兩個(gè)治療組的不同基因中觀察到的克隆變化，分別考慮了單個(gè)克隆的過(guò)程，以及具有不同亞克隆組合的患者（圖 4A，圖 4B）。 具有強(qiáng)烈獲取新變體（如 RB1 和 PIK3CA）模式的基因在治療中往往會(huì)丟失相對(duì)較少的克隆（圖 4C，圖 4D）。 相比之下，ESR1 突變?cè)谥委熯^(guò)程中表現(xiàn)出顯著變化，通過(guò)治療經(jīng)常丟失和獲得不同的突變（圖 4E、圖 4F），以及高水平的 ESR1 多克隆性 (13)。 與第 1 天相比，患者通常在 EOT 檢測(cè)到不同的 ESR1 突變組合（圖 4F，補(bǔ)充圖 14），并且在任何時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的 ESR1 變異只有 35.6% 在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都被檢測(cè)到，因此在治療中得以維持 (42/118) . 在 ESR1 突變中觀察到的這種多克隆流模式支持了個(gè)體 ESR1 突變標(biāo)記個(gè)體腫瘤亞克隆的觀察結(jié)果（圖 1），證明了治療提供的頻繁克隆選擇壓力。

為了將拷貝數(shù)概況評(píng)估擴(kuò)展到外顯子組測(cè)序之外，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)使用靶向測(cè)序組對(duì)來(lái)自兩個(gè)治療組的第 1 天和治療結(jié)束樣本的一組更大的匹配對(duì)進(jìn)行了評(píng)估，該組評(píng)估了 RB1、PTEN 和 CDKN2A 的丟失、腫瘤純度和評(píng)估 乳腺癌中常見(jiàn)的 12 個(gè)基因的拷貝數(shù)（材料和方法）。 總共對(duì) 324 個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序以評(píng)估拷貝數(shù)，中位覆蓋率為 1329X，包括 163 個(gè)第 1 天樣本和 154 個(gè)配對(duì)的 EOT 樣本。

由于評(píng)估血漿 DNA 中的拷貝數(shù)，特別是拷貝數(shù)丟失，高度依賴于具有足夠的腫瘤純度，因此僅使用具有至少 20% 腫瘤純度的樣本子集來(lái)評(píng)估丟失。 在第 1 天的樣品中，37 個(gè)估計(jì)純度≥20%，其中 51 個(gè) EOT 樣品純度≥20%，17 名患者進(jìn)行配對(duì)分析。 疾病部位數(shù)量與腫瘤含量 >10% 之間存在關(guān)聯(lián)（p = 0.039，Cochran-Armitage 檢驗(yàn)）。 第 1 天樣本中的 6/37 名患者 (16.2%) 和治療結(jié)束樣本中的 14/51 名患者 (27.4%) 發(fā)現(xiàn) RB1 丟失（p = 0.30，F(xiàn)isher 正確檢驗(yàn)）。 在這些損失中，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的方法也可以識(shí)別亞基因缺失。 在 EOT 樣本中，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了 3.8% (2/51) 的亞基因缺失，其中一個(gè)也有配對(duì)的第 1 天樣本缺失，表明這些缺失預(yù)先存在，并且不是在治療期間獲得的。 在配對(duì) >20% 純度的 17 個(gè)樣本中，沒(méi)有證據(jù)表明選擇 RB1 治療損失（補(bǔ)充圖 24，p = 0.25，McNemar 檢驗(yàn)），盡管該分析受到樣本量的限制。 對(duì)于 PTEN 和 CDKN2A 也觀察到一致的拷貝數(shù)雖然處理。

第 1 天和治療結(jié)束時(shí)的拷貝數(shù)增加數(shù)據(jù)在那些腫瘤純度 >10% 的樣本中進(jìn)行評(píng)估，并且與原發(fā)性乳腺癌中觀察到的光譜基本一致，在 CCND1、MYC 和 FGFR1 中鑒定出擴(kuò)增，沒(méi)有選擇的證據(jù)或 配對(duì)純度 >10% 的 43 個(gè)樣本在處理結(jié)束時(shí)損失（補(bǔ)充圖 25）。 兩名患者在治療結(jié)束時(shí)獲得了 FGFR2 擴(kuò)增（補(bǔ)充圖 25）。 治療結(jié)束時(shí)沒(méi)有獲得性 CCNE1 或 CCNE2 擴(kuò)增的患者。
 

遺傳變異的選擇發(fā)生在 palbociclib 加氟維司群的后期

為了研究與治療突變選擇相關(guān)的臨床因素，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)探討了治療時(shí)間 (PFS) 與接受哌柏西利加氟維司群（圖 5）和安慰劑加氟維司群的患者在 EOT 時(shí)獲得新突變之間的關(guān)系。 與未獲得突變的患者相比，治療結(jié)束時(shí)任何獲得性突變的存在與更長(zhǎng)的 PFS 相關(guān)（圖 5A，中位數(shù) 14.3 個(gè)月獲得性與 5.5 個(gè)月未獲得性，對(duì)數(shù)秩 p = 0.0018，），表明新 接受更長(zhǎng)時(shí)間治療的患者更有可能發(fā)生突變。 這種趨勢(shì)也分別出現(xiàn)在獲得性 ESR1 突變和 PIK3CA 突變中，這兩個(gè)基因的突變占獲得性突變的大部分（圖 5B）。 獲得性 RB1 突變太少，無(wú)法有意義地評(píng)估與 PFS 的關(guān)系。 對(duì)已獲得突變的患者的基線臨床病理特征進(jìn)行的評(píng)估揭示了與骨轉(zhuǎn)移的存在相關(guān)的一些證據(jù)（p = 0.013，q = 0.15）。

臨床前工作已將 RB1 突變 (9,11) 確定為 CDK4/6 抑制的耐藥機(jī)制，這與 CDK4/6 抑制劑的功效需要功能性 Rb 的文獻(xiàn)一致 (18)。 在這些潛在的耐藥機(jī)制中，只有 RB1 中的突變已在臨床上得到鑒定，盡管它們?cè)诮邮苤委煹娜巳褐械牧餍新噬胁磺宄?(11)。 Condorelli 及其同事賊近報(bào)道了 3 名在接受 CDK4/6 抑制治療后出現(xiàn) RB1 突變的患者，其中 2 名在之前的內(nèi)分泌治療中接受了 palbociclib 和 fulvestrant，而其他 ribociclib 和來(lái)曲唑作為晚期疾病的一線治療 (11)。 憑借分析無(wú)偏倚注冊(cè)研究的優(yōu)勢(shì)，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的研究證實(shí)了 RB1 畸變對(duì) palbociclib 加氟維司群的明顯陽(yáng)性選擇，但證明它們僅在少數(shù)患者中明顯（圖 2A）。 在這些患者中，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了多克隆 RB1 畸變，提示在選擇性壓力下表型收斂，例如內(nèi)分泌治療響應(yīng)的 ESR1 突變 (13,19)。 有趣的是，RB1 突變僅在 ESR1 突變的野生型腫瘤中被選擇（圖 2D）。 盡管腫瘤耐藥物基因檢測(cè)無(wú)法排除偶然發(fā)現(xiàn)，但這確實(shí)可能表明，當(dāng) ESR1 突變不損害氟維司群療效時(shí)，可以選擇 RB1 突變，表明產(chǎn)生耐藥性的不同途徑。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)對(duì)相對(duì)不常見(jiàn)的 RB1 突變的發(fā)現(xiàn)很重要，這表明后續(xù)的基于內(nèi)分泌的治療線有可能對(duì)進(jìn)展有效，這與目前可用的進(jìn)展后臨床數(shù)據(jù)一致 (15)。

除了 RB1 突變外，氟維司群和 palbociclib 組與氟維司群和安慰劑組之間的獲得性突變譜沒(méi)有明顯差異（圖 2C）。 這一隨機(jī)試驗(yàn)背景下的觀察結(jié)果表明，對(duì)氟維司群的耐藥性是對(duì)聯(lián)合治療耐藥的主要遺傳驅(qū)動(dòng)因素，可能是腫瘤能夠適應(yīng) CDK4/6 抑制，而不會(huì)抑制 ER 信號(hào)。 ESR1 突變是對(duì)芳香化酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制，配體結(jié)合域發(fā)生突變，尤其是螺旋 12，從而產(chǎn)生組成型活性蛋白 (20,21)。 然而，在基線檢測(cè)到多個(gè)耐藥亞克隆并不能預(yù)測(cè) palbociclib 在 PALOMA-3 中的活性 (13)。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的數(shù)據(jù)表明，第 1 天出現(xiàn)的 ESR1 突變中有很大一部分在哌柏西利聯(lián)合氟維司群中丟失，至少部分反映了治療的高水平克隆進(jìn)化，ESR1 突變丟失反映了敏感亞克隆的丟失（圖 1C，1G） )，在隨后的氟維司群治療期間，兩個(gè)治療組中的其他人以相同的速度和模式出現(xiàn)（圖 2C）。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在治療結(jié)束時(shí) Y537S 呈陽(yáng)性選擇的證據(jù)（圖 3A、圖 3D、圖 4E），這是在臨床前研究中確定為對(duì)氟維司群賊耐藥的配體結(jié)合域突變 (22)。 這表明對(duì) palbociclib 加氟維司群組合的耐藥機(jī)制的獨(dú)立、平行演變。

在生長(zhǎng)因子受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中觀察到進(jìn)一步獲得性驅(qū)動(dòng)突變（圖 5D）。 PIK3CA 突變是 ER 陽(yáng)性原發(fā)性乳腺癌的重要基礎(chǔ)變異 (12)，并且在大多數(shù)轉(zhuǎn)移性乳腺癌中保持克隆優(yōu)勢(shì) (23)。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)現(xiàn)在確定，6% 在第 1 天未檢測(cè)到 PIK3CA 突變的患者在使用 palbociclib 加氟維司群治療結(jié)束時(shí)獲得或積極選擇了新出現(xiàn)的明顯 PIK3CA 突變（圖 2C、4A、圖 4C、圖 4D），特別是 本研究中的 E542K（補(bǔ)充圖 11）。 出現(xiàn)的 PIK3CA 突變的流行率在治療組之間似乎沒(méi)有差異（補(bǔ)充圖 13），支持這些主要影響氟維司群耐藥性的假設(shè)（24）。 通過(guò)外顯子組測(cè)序，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)確定了 ABOPEC 在驅(qū)動(dòng)克隆多樣性和對(duì) palbociclib 加氟維司群的耐藥性方面的作用（圖 1D、1H）。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)注意到 E542K 是一個(gè)潛在的 APOBEC 位點(diǎn)，E542K 的優(yōu)勢(shì)可能提供進(jìn)一步的證據(jù)支持 APOBEC 誘變促進(jìn)晚期 ER 陽(yáng)性乳腺癌的遺傳多樣性 (25,26)。

腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的研究還有與現(xiàn)有關(guān)于 CDK4/6 抑制劑耐藥機(jī)制的臨床前文獻(xiàn)相關(guān)的潛在重要發(fā)現(xiàn)。 先前的臨床前工作分別在 palbociclib 和 abemaciclib 耐藥模型中確定了 CCNE1(9) 或 CDK6(10) 的獲得性擴(kuò)增。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)獲得性 CCNE1、CDK4 或 CDK6 擴(kuò)增與臨床相關(guān)的證據(jù)，盡管腫瘤耐藥物基因檢測(cè)確實(shí)注意到，由于腫瘤純度低的挑戰(zhàn)，循環(huán)腫瘤 DNA 分析在分析拷貝數(shù)方面受到限制。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)通過(guò)采用一種新的靶向測(cè)序方法來(lái)部分解決這一限制，以允許同時(shí)評(píng)估純度和拷貝數(shù)，將拷貝數(shù)分析限制為對(duì)腫瘤純度至少為 10% 的腫瘤進(jìn)行增益分析，對(duì)腫瘤純度至少為 20% 的腫瘤進(jìn)行損失分析 （補(bǔ)充圖 21-25）。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的血漿腫瘤純度觀察結(jié)果與 Adalsteinsson 等人 (27) 報(bào)道的大乳腺癌組中腫瘤含量 >10% 的三分之一患者相當(dāng)，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)研究中觀察到的純度比例略高（第 1 天的 42% 樣本，68/163，和 53% 的治療結(jié)束樣本，82/154）可能是由于所有樣本都在研究中規(guī)定的嚴(yán)格協(xié)議下處理。 然而，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)強(qiáng)調(diào) ctDNA 分析不太可能檢測(cè)到許多亞克隆擴(kuò)增或丟失。 此外，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn) CDK4 或 CDK6 中守門(mén)人突變的證據(jù)，并且可以有效地將其排除在常見(jiàn)的耐藥機(jī)制之外（圖 2A）。

這一個(gè)腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的研究還有許多進(jìn)一步優(yōu)化的地方。由于腫瘤含量的變化，很難在循環(huán)腫瘤 DNA 的縱向時(shí)間點(diǎn)之間進(jìn)行比較 - 無(wú)法識(shí)別突變可能是由于血漿中不存在腫瘤 DNA，或者存在于測(cè)序噪聲中的低水平。 腫瘤耐藥物基因檢測(cè)通過(guò)進(jìn)行二次分析來(lái)緩解這種擔(dān)憂——使用數(shù)字 PCR 分析基線血漿以發(fā)現(xiàn)新出現(xiàn)的突變，并對(duì)第 1 天腫瘤含量已知的患者進(jìn)行子集分析。 純度問(wèn)題對(duì)于評(píng)估基因組丟失特別具有挑戰(zhàn)性，對(duì)于需要在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)腫瘤內(nèi)容置信度的比較分析而言，純度問(wèn)題更加復(fù)雜。 這可能會(huì)限制對(duì) RB1 丟失的調(diào)查，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)建議需要基于組織的分析來(lái)對(duì)進(jìn)展中的拷貝數(shù)進(jìn)行明確分析。 盡管腫瘤耐藥物基因檢測(cè)通過(guò)配對(duì)外顯子組測(cè)序分析了 14 名患者，但為了發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的目標(biāo)組，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)無(wú)法解決是否存在未被腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的目標(biāo)組詢問(wèn)的罕見(jiàn)獲得性事件。 此外，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)從治療時(shí)間超過(guò) 2 年的患者中詢問(wèn)了相對(duì)較少的治療結(jié)束血漿樣本，因此腫瘤耐藥物基因檢測(cè)無(wú)法解決非常晚期的進(jìn)展是否可能具有不同的獲得性突變模式。 賊后，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)在本手稿中使用“獲得性”一詞來(lái)反映在 EOT 時(shí)可檢測(cè)到的突變，但在第 1 天檢測(cè)不到。評(píng)估這些突變是否可能在未成年人治療之前就已經(jīng)存在于腫瘤中是非常具有挑戰(zhàn)性的 和檢測(cè)不到的亞克隆。 使用非常高靈敏度的數(shù)字 PCR 對(duì) Y537S 進(jìn)行詳盡調(diào)查，腫瘤耐藥物基因檢測(cè)確實(shí)在非常低的水平上分別在第 1 天和治療結(jié)束時(shí)檢測(cè)到一些“獲得的”和“丟失的”突變，但表明這些在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間是平衡的，并且確實(shí) 不會(huì)顯著影響比較結(jié)果（圖 3D）。

腫瘤耐藥物基因檢測(cè)的工作展示了通過(guò)配對(duì) ctDNA 分析審問(wèn)大型注冊(cè)試驗(yàn)的價(jià)值，展示了乳腺癌驅(qū)動(dòng)因素中正在進(jìn)行的克隆進(jìn)化如何破壞 palbociclib 加氟維司群療法，強(qiáng)調(diào) APOBEC 誘變?cè)诖龠M(jìn)克隆進(jìn)化方面的潛在作用，并確定了可以改善的合理治療策略 CDK4/6 抑制的功效。