【佳學(xué)基因檢測】循環(huán)腫瘤DNA為什么可以用來做靶向藥物基因檢測？

循環(huán)腫瘤DNA是一種微創(chuàng)基因檢測技術(shù)

循環(huán)腫瘤DNA檢測可以反映腫瘤DNA的穩(wěn)定性

在1948年，人們在人類血漿中發(fā)現(xiàn)了一種無分?jǐn)?shù)的DNA片段，稱為cfDNA。ctDNA是與腫瘤發(fā)展相關(guān)的一種cfDNA。然而，ctDNA的來源并未明確指出，通過一系列的來源比較結(jié)果，主要推測ctDNA主要來源于腫瘤細(xì)胞的程序性凋亡或壞死。這個概念一直深入研究者的心中，但是通過基因解碼發(fā)現(xiàn)，癌癥患者的血液樣本中的循環(huán)外泌體也含有與ctDNA相同的突變位點，如KRAS基因的G12A。而且，循環(huán)外泌體中的基因突變比例高于血液中的ctDNA，這表明含有多種組分的循環(huán)外泌體可能是ctDNA的另一個來源，拓寬了ctDNA的來源，并為正確的ctDNA分析提供了新的思路。更深入地了解ctDNA的來源，可以進一步澄清各種類型癌癥在特定基因水平上的變化，這有利于后續(xù)的靶向藥物研究和治療。ctDNA揭示了腫瘤相關(guān)的基因水平的DNA變化，包括基因突變、DNA甲基化、MSI、基因重排和雜合性喪失。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是指腫瘤中的一個微衛(wèi)星位點與正常組織相比，由于重復(fù)單位的插入或刪除，產(chǎn)生了新的微衛(wèi)星等位基因的現(xiàn)象。MSI的發(fā)生是由于腫瘤組織中的DNA錯配修復(fù)功能缺陷，而且與DNA錯配修復(fù)缺陷的MSI是一個重要的臨床腫瘤標(biāo)記。腫瘤穩(wěn)定性基因解碼基因檢測新穎在前列腺癌患者的cfDNA和ctDNA中檢測到MSI，結(jié)果與轉(zhuǎn)移病人組織全外顯子測序的結(jié)果一致。此外，在給予了抗CTLA-4抑制劑nivolumab和美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的一線藥物pembrolizumab治療的三名Mismatch repair deficiency/high MSI metastatic colorectal cancer患者中，觀察到ctDNA水平急劇下降，這表明MSI在ctDNA中仍然是一個臨床生物標(biāo)志物。此外，腫瘤基因檢測的人工智能分析人員開發(fā)了一個基于cfDNA測序數(shù)據(jù)的MSI生物信息學(xué)工具，其靈敏度為100%，檢測限值為0.05%的ctDNA含量。

循環(huán)腫瘤DNA基因檢測是否可以發(fā)現(xiàn)雜全性缺失

雜合性喪失意味著，在同源染色體上特定位點的一對等位基因中，一側(cè)有有害突變，而另一側(cè)正常，導(dǎo)致半純合子或純合子基因位點。雜合性喪失是NF1基因突變的主要形式。之前的一項研究顯示，14例侵襲性小葉或?qū)Ч?a href='http://www.lucasfraser.com/cp/zhongliu/zltaocan/' target='_blank'>乳腺癌患者中有11例出現(xiàn)NF1基因的雜合性喪失，這種變異與內(nèi)分泌治療抵抗和RAS/RAF激酶的激活相關(guān)，表明患者在用適當(dāng)?shù)募っ敢种苿┲委熀?，預(yù)后會更好?；蛑嘏攀且环N常見的基因水平變化形式，是DNA雙鏈斷裂后的基因內(nèi)或基因間重排的修復(fù)結(jié)果，包括基因融合。在來源于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的血液和尿液的ctDNA的二代測序光譜中，發(fā)現(xiàn)了CAD-ALK基因融合。CAD基因的外顯子35和ALK基因的外顯子20的聯(lián)合重排，以及CAD-ALK基因融合的動態(tài)變化，與患者的臨床進展一致。

循環(huán)腫瘤DNA與基因突變檢測

基因突變被認(rèn)為是基因結(jié)構(gòu)中堿基配對組成或排列順序的改變，包括點突變、移碼突變、缺失突變和插入突變。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化。S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，甲基被選擇性地加到胞嘧啶的兩個CG核苷酸的DNA上。主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），這在基因5′-CG-3′序列中很常見。DNA甲基化可能導(dǎo)致基因組相應(yīng)區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致DNA失去核糖酶或限制性內(nèi)切酶的切割位點和DNA酶的敏感位點。這導(dǎo)致形成的染色質(zhì)高度螺旋并凝聚成團，失去其轉(zhuǎn)錄活性。

來源于腫瘤細(xì)胞的ctDNA，含有腫瘤特異性的基因突變位點和甲基化位點，如非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的EGFR基因，乳腺癌中的BRCA1/2突變和甲基化，結(jié)直腸癌中的KRAS基因突變，以及甲狀腺癌中的BRAF基因突變。此外，在ctDNA檢測過程中，可以通過測序結(jié)果或相應(yīng)的感測信號，包括電流變化、光學(xué)變化和吸收度，來識別和確定突變或甲基化?；蛲蛔兒虳NA甲基化是腫瘤基因檢測中的兩個方面。

佳學(xué)基因腫瘤基因檢測如何獲取循環(huán)腫瘤DNA

ctDNA提取

ctDNA檢測的過程包括ctDNA的提取，相關(guān)庫的建立，分析，以及數(shù)據(jù)的整合和對比。在此過程中，ctDNA的提取是先進步，也是改善結(jié)果的決定因素。首先，ctDNA的來源是一個關(guān)鍵因素，它有多種可能，如血液，尿液，糞便，唾液，腹水，腦脊液，和胸腔積液。其次，針對不同來源選擇提取ctDNA的方法也是至關(guān)重要的。提取階段主要分為兩個步驟：樣本處理和ctDNA的提取。

3血液

在幾乎所有的實體瘤中，血液是提取ctDNA的賊常見來源，如食管癌，非小細(xì)胞肺癌，結(jié)直腸癌，肝細(xì)胞癌，以及早期乳腺癌。首先，從被檢查的對象中抽取血液，并收集在EDTA血液收集管中，如果樣本將在2小時內(nèi)處理，或者在防腐管中，如果樣本將在抽血后的46-72小時內(nèi)處理。有趣的是，不同來源的ctDNA的檢測效率是不同的，如血漿，血清，和外周血。血漿的檢測效率被發(fā)現(xiàn)比其他來源更好，其檢測特異性和靈敏度分別為0.96和0.78。此外，收集效率受管子選擇的影響，適當(dāng)?shù)墓茏涌梢詳U大臨床上的血液收集范圍。例如，EDTA，CellSave管，和Streck BCT在血樣采集后6小時內(nèi)具有相似的保存血液的能力，而CellSave管和Streck BCT可以在48小時內(nèi)穩(wěn)定野生型DNA和ctDNA。然后，將樣品在1600× g的離心力下離心10分鐘，收集上清液，并在16,000× g的離心力下離心10分鐘。其次，使用提取試劑盒正確地獲得ctDNA，目前有許多商業(yè)上可用的ctDNA提取試劑盒用于臨床基因檢測和科學(xué)研究，如QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)，QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，以及EliteHealth cfDNA提取Kit (EliteHealth, Pembroke Pines, FL, USA)。幾種提取試劑盒在表1中列出。

ctDNA來源   選擇性試劑盒

血液               QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit

MagMAX™   Cell-Free DNA Isolation Kit

DSP               Circulating DNA Kit

QIAamp         Circulating Nucleic Acid Kit

EliteHealth     cfDNA提取Kit

尿液 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

腦脊液 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

QIAsymphony    DSP Virus/Pathogen Midi Kit

QIAsymphony    DSP Circulating DNA Kit

糞便                   Fast DNA Stool Mini Kit

腹水                   QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

胸腔積液           QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

尿液

尿液是比血液更方便的ctDNA來源，特別是對于腎癌，結(jié)直腸癌，膀胱癌，和尿路上皮癌，因為樣本的收集不會對患者造成不適。尿液分為尿液上清液(USN)和尿液細(xì)胞沉淀(UCP)進行ctDNA的收集。通常，從患者體內(nèi)收集30-50毫升的尿液在50毫升的Falcon試管中，然后在收集后的一個小時內(nèi)向Falcon試管中添加0.5 M的EDTA。在EDTA溶解后，將樣品在2400× g的離心力下離心10分鐘。然后，使用獨立的凍存管存放上清液，存儲在-80 °C的條件下。如果想獲得UCP收集，以上的1毫升上清液添加到含有UCP的原始Falcon試管中，然后在輕輕攪拌后將懸浮物轉(zhuǎn)移到2毫升的無菌微離心管中。沉淀物通過在13,300轉(zhuǎn)每分鐘的離心速度下存放在-80 °C的條件下。此外，QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)也可以用于從尿液中提取ctDNA。

腦脊液

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病占據(jù)了大部分影響患者生活質(zhì)量的疾病。血液來源的ctDNA逐漸成為癌癥的新型生物標(biāo)志物，但腦瘤患者的腦脊液中ctDNA的濃度高于血漿?？偟膩碚f，腦脊液與CNS腫瘤的來源更為密切相關(guān)[52,53]。腦脊液樣本通常從患者的腰椎穿刺中獲得，離心后，可以使用QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (Qiagen, Hilden, Germany)，以及QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)進行ctDNA的提取。

糞便，腹水，和胸腔積液

糞便，腹水，和胸腔積液是提取ctDNA的補充來源。通過相對離心，使用Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)  和 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)  收集上清液。所有選擇性的ctDNA提取試劑盒都在表1中顯示。