【佳學基因檢測】在兒科檢測兩種 HLA II 基因變異預測骨肉瘤風險

HLA突變與骨肉瘤風險基因檢測導讀：

背景：

盡管發(fā)表了全基因組關(guān)聯(lián)研究，但骨肉瘤的遺傳病因仍然知之甚少。已經(jīng)觀察到人類白細胞抗原 (HLA) 基因變異與幾種癌癥風險之間的關(guān)聯(lián)，但標準 SNP 陣列無法很好地捕獲 HLA 變異。

方法：

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組使用定制的全基因組陣列對 207 名加利福尼亞小兒骨肉瘤病例和 696 名歐洲血統(tǒng)對照進行了基因分型，并在 MHC 區(qū)域內(nèi)補充了約 6,000 個額外的探針。隨后，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組使用 5,225 名通過下一代測序進行高分辨率 HLA 分型的參考小組來估算四位數(shù)的經(jīng)典 HLA 等位基因。病例對照比較針對具有祖先信息的主成分進行了調(diào)整，發(fā)現(xiàn)分析中的先進關(guān)聯(lián)在 657 例病例和 1183 例對照的獨立數(shù)據(jù)集中進行了復制。

結(jié)果：

在發(fā)現(xiàn)分析中，三個高度相關(guān)的 HLA II 類變異 (r 2 =0.33–0.98) 與骨肉瘤風險相關(guān)，包括 HLA-DRB1*0301 (OR=0.52; P=3.2×10 -3 )、HLA-DQA1*0501 ( OR=0.74；P=0.031）和HLA-DQB1*0201（OR=0.51；P=2.7×10 -3）。在復制數(shù)據(jù)中觀察到類似的關(guān)聯(lián)（P范圍= 0.011-0.037）。兩個數(shù)據(jù)集的薈萃分析將 HLA-DRB1*0301 確定為賊顯著相關(guān)的變體（OR meta =0.62；P meta =1.5×10 -4），達到 Bonferroni 校正的統(tǒng)計顯著性。薈萃分析還揭示了 HLA-DQA1*01:01 處的第二個重要獨立信號（OR meta =1.33，Pmeta =1.2×10 -3），以及在 HLA-DQB1*0302 處的第三個暗示關(guān)聯(lián)（OR meta =0.73， P meta =6.4×10 -3）。

結(jié)論：

多個獨立的 HLA II 類等位基因可能會影響骨肉瘤的風險。

影響：

需要做更多的工作來將骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的觀察擴展到其他患者群體，并闡明這些關(guān)聯(lián)背后的潛在因果機制。了解免疫對骨肉瘤病因的貢獻可能會為合理的治療靶點提供信息。

介紹

骨肉瘤是賊常診斷的原發(fā)性惡性骨腫瘤，發(fā)病高峰發(fā)生在青春期。在美國，每年在 20 歲以下的個體中診斷出大約 400 例新病例 ，在全球范圍內(nèi)觀察到的兒童期和青少年期骨肉瘤發(fā)病率相似 。骨肉瘤的危險因素包括較高的身材和男性，但該疾病的遺傳病因仍然知之甚少。雖然骨肉瘤風險增加與骨佩吉特病和遺傳性癌癥易感綜合征（例如Li-Fraumeni 綜合征）有關(guān)，但大多數(shù)病例是散發(fā)性的. 候選基因研究表明，DNA 修復途徑 、生長激素途徑 和端粒維持途徑 中的常見遺傳變異在導致骨肉瘤風險中的作用，但只有一個單一的全基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS) 迄今已發(fā)表 。該 GWAS 報告了兩個與骨肉瘤相關(guān)的風險位點，其中一個位于GRM4基因的 6p21.3 處，距主要組織相容性復合體 (MHC) II 類區(qū)域約 1 Mb。

MHC 區(qū)域，在染色體 6p21 上包含約 7.6Mb，是基因組中多態(tài)性和基因賊密集的區(qū)域之一，包括高度可變的人類白細胞抗原 (HLA) 基因。在之前對慢性淋巴細胞白血病、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌和鼻咽癌的研究中，HLA 變異與癌癥風險相關(guān)。已經(jīng)假設(shè)了將 HLA 遺傳變異與癌癥發(fā)展聯(lián)系起來的各種機制，包括免疫系統(tǒng)對腫瘤的不同耐受性、免疫監(jiān)視的效率和癌癥免疫編輯導致某些 HLA 變異易患特定惡性腫瘤。研究可遺傳的 HLA 變異在骨肉瘤風險中的作用可能會為疾病病因?qū)W提供信息，并為免疫治療的潛在策略提供信息。

雖然之前的骨肉瘤 GWAS 沒有報告 MHC 區(qū)域的任何信號，但由于 MHC 中序列和拷貝數(shù)變異的獨特特征，標準全基因組 SNP 陣列不能很好地捕獲 HLA 基因中的遺傳變異和單倍型結(jié)構(gòu)地區(qū)。使用定制的 Affymetrix Axiom 陣列，并輔以跨越 MHC 區(qū)域的約 6,000 個額外探針，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組以四位數(shù)分辨率鍵入經(jīng)典 HLA 等位基因（例如 HLA-DRB1*1501) 并測試與小兒骨肉瘤風險的關(guān)聯(lián)。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組隨后嘗試在一組獨立的骨肉瘤病例和對照中進行復制，并對這兩個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析，總共 864 例病例和 1879 例對照。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組進一步評估了 MHC 區(qū)域中的非加性遺傳關(guān)聯(lián)作為一種補充方法，因為觀察到 HLA 變體對許多疾病的廣泛非加性和上位效應(yīng)，以及受試者性別的任何潛在修飾或臨床表現(xiàn)（例如腫瘤位置、轉(zhuǎn)移的存在、診斷時的年齡）以進一步了解這種侵襲性癌癥的病因、進展和預后。

材料和方法

發(fā)現(xiàn)樣本：

該研究得到了加州大學伯克利分校和舊金山分校的機構(gòu)審查委員會以及加州公共衛(wèi)生部 (CDPH) 的批準。本研究中使用的生物樣本和/或數(shù)據(jù)來自加利福尼亞生物銀行計劃（SIS 請求編號 550）。CDPH，遺傳疾病篩查部門從該州出生的所有新生兒中獲取新生兒血液樣本，以進行疾病篩查。自 1982 年以來，篩選后殘留的血斑已在 -20°C 下存檔，并可供批準的研究使用。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組將 CDPH 維護的全州出生記錄（1982-2009 年）與加州癌癥登記處（CCR，1988-2011 年）的癌癥診斷數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。根據(jù) CCR 記錄，該分析包括 1982 年至 2009 年期間在加利福尼亞出生并在 19 歲時被診斷出患有骨肉瘤（ICD-O-3 代碼 9180-9183、9185-9187 和 9192-9195）的非西班牙裔白人兒童。選擇同一時期在加利福尼亞州出生且未向 CCR 報告患有任何兒童癌癥的兒童作為對照。

DNA提取：

將 12mm 干血斑的三分之一分成三個均勻的部分，并在提取前置于 2mL 微量離心管中，使用 QIAamp DNA Investigator Kit (Qiagen) 進行提取。簡而言之，將 280 μL Buffer ATL 和 20 μL 蛋白酶 K 添加到每個樣品中。渦旋樣品，然后在干浴振蕩器中以 900rpm 和 56°C 孵育一小時。孵育后，將樣品短暫離心，將裂解液轉(zhuǎn)移到新的 2mL 微量離心管中，同時丟棄固體殘留物。將 1μL 的 1ng/μL 載體 RNA 添加到裂解物中，然后短暫渦旋。加入載體 RNA 后，將樣品放入 Qiagen Qiacube 自動化工作站進行 DNA 分離。Qiacube 提取方案的結(jié)果是 ATE 緩沖液中的純化 DNA 樣品。

Discovery 樣本基因分型和質(zhì)量控制：

根據(jù)病例對照狀態(tài)、報告的種族和性別，使用封閉式隨機化將 DNA 標本分配到基因分型板。DNA 在 Affymetrix Axiom Latino Array 上進行基因分型，具有高覆蓋率的歐洲血統(tǒng)，并在 MHC 區(qū)域補充了約 6,000 個額外的 SNP 探針。DNA 樣本在 Affymetrix TITAN 系統(tǒng)上進行基因分型，并使用 Affymetrix Genetools 處理原始圖像文件以調(diào)用基因型。

陣列中包含的重復樣本 (n = 34) 的平均基因型一致性 > 99%。如前所述 迭代地執(zhí)行 SNP 和樣本的調(diào)用率過濾，不包括調(diào)用率 <97% 的 SNP 和調(diào)用率 <97% 的樣本。在歐洲血統(tǒng)對照和報告性別與基因分型性別不匹配的樣本中，SNP顯示出明顯偏離Hardy-Weinberg平衡（P<1.0×10 -5 ）被排除在外。發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)中排除了來自每個受試者對的一個個體，其身份認同（IBD）比例> 0.18。使用來自 1184 個 HapMap Phase 3 樣本的全基因組 SNP 陣列數(shù)據(jù)，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組使用等位基因頻率>0.05 的未鏈接常染色體雙等位基因 SNP 進行主成分分析，并從分析中刪除任何顯示非歐洲血統(tǒng)證據(jù)的樣本（平均 CEPH 值 >3 SD在 PC 1-3 上）。

復制數(shù)據(jù)集：

骨肉瘤復制數(shù)據(jù)集來自 dbGaP 研究加入 phs000734.v1.p1（骨肉瘤風險的全基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS)）和 phs000381.v1.p1（eMERGE Geisinger eGenomic Medicine MyCode Project Controls）。病例和對照在 Illumina OmniExpress 陣列上進行基因分型，并如前所述進行質(zhì)量控制過濾 。簡而言之，調(diào)用率 <0.98 的 SNP 和基因分型調(diào)用率 <0.97 的受試者被刪除。使用 Eigenstrat  和 HapMap 參考樣本和前五個主成分的平均值是在 HapMap CEPH 樣本中計算的。具有非歐洲血統(tǒng)證據(jù)的受試者（平均 CEPH 值 > 3 SD）被排除在外。具有 Hardy-Weinberg 平衡P <1.0×10 -5的 SNP其中控件被刪除。比較了發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集中的骨肉瘤病例，并從復制數(shù)據(jù)集中排除了重復和隱匿相關(guān)（IBD>0.18）樣本（n=22 重復患者，0 例隱匿相關(guān)患者）。賊終復制數(shù)據(jù)集中總共包含 657 個不重疊的歐洲血統(tǒng)病例和 1183 個對照。來自 dbGaP 的骨肉瘤患者主要是兒童和青少年（年齡 < 21 歲），盡管無法獲得個體水平的年齡數(shù)據(jù)，并且賊初的出版物并不限于特定的年齡范圍。這些骨肉瘤患者是先前 GWAS 出版物中包含的患者的一個子集 。

HLA基因型的插補：

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組估算了三個主要 I 類基因（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）和五個 II 類基因（HLA-DRB1、-DPA1、-DPB1、-DQA1 和-DQB1)，以及使用 SNP2HLA 的 5,695 個 HLA 基因內(nèi) SNP，它使用來自 1 型糖尿病遺傳學聯(lián)盟的 5,225 名歐洲血統(tǒng)個體的參考小組，這些人通過下一代測序進行了高分辨率 HLA 分型。如前所述，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組使用 SNP2HLA 推算的等位基因劑量數(shù)據(jù)進行主要的 MHC 范圍關(guān)聯(lián)分析，并使用分階段的賊佳猜測基因型進行非加性效應(yīng)分析。關(guān)聯(lián)分析僅限于經(jīng)典的四位數(shù) HLA I 類和 II 類等位基因，插補質(zhì)量評分 INFO>0.80，等位基因頻率>0.05（19 個 I 類等位基因，27 個 II 類等位基因）。對于非加性效應(yīng)分析，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組僅限于在每個分析的 HLA 基因上具有兩個賊佳猜測單倍型的個體。

統(tǒng)計分析：

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組對 HLA I 類和 II 類等位基因中的每一個進行了邏輯回歸分析，使用 SNP2HLA 輸出的推算等位基因劑量和 PLINK 1.9 中的“邏輯”命令，調(diào)整 Eigenstrat 生成的前 10 個祖先信息主成分。作為二次探索性調(diào)查，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組還對 MHC 區(qū)域中的 5,695 個估算的 HLA 基因內(nèi) SNP 進行了關(guān)聯(lián)分析。分析在發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集中分別進行，并使用 PLINK 中的“元分析”命令進行元分析。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組通過重復調(diào)整頂部信號的邏輯回歸來進行條件分析。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組還針對 SNP rs1906953 進行了調(diào)整，這是一種先前發(fā)現(xiàn)的骨肉瘤 GWAS 在 6p21 命中。3 位于距 MHC 區(qū)域約 1 Mb 的位置，以評估骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組分析中存在的頂部信號的任何衰減。對于性別分層分析，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組分別檢查了男性和女性的關(guān)聯(lián)信號，并測試了效應(yīng)的異質(zhì)性。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組還進行了僅病例分析，評估病例對照分析中確定的先進 HLA 關(guān)聯(lián)信號是否與臨床表現(xiàn)的差異相關(guān)，包括：診斷年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、擴展、分化和轉(zhuǎn)移的存在。有關(guān)臨床變量的信息僅可用于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集，編碼如前所述（評估病例對照分析中確定的先進 HLA 關(guān)聯(lián)信號是否與臨床表現(xiàn)的差異相關(guān)，包括：診斷年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、擴展、分化和轉(zhuǎn)移的存在。有關(guān)臨床變量的信息僅可用于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集，編碼如前所述（評估病例對照分析中確定的先進 HLA 關(guān)聯(lián)信號是否與臨床表現(xiàn)的差異相關(guān)，包括：診斷年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、擴展、分化和轉(zhuǎn)移的存在。有關(guān)臨床變量的信息僅可用于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集，編碼如前所述。

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組通過評估先前研究中描述的優(yōu)勢效應(yīng)模型來研究 HLA 等位基因的非加性效應(yīng) 。簡而言之，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組測試了模型擬合的改進，將加性效應(yīng)模型與另外包括一個表示所研究的每個 HLA 等位基因的雜合狀態(tài)的顯性項的模型進行比較。來自 χ2 檢驗的模型改進的 P 值表示與加性模型的偏差的顯著性。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組還測試了檢測到的每個獨立信號中的先進變體與每個剩余的 II 類變體之間的相互作用。

在發(fā)現(xiàn)分析中達到標稱統(tǒng)計學意義的 HLA I 類和 II 類等位基因 (P<0.05) 被用于復制。在兩個數(shù)據(jù)集中實現(xiàn)名義顯著性并且在薈萃分析中實現(xiàn)超過 Bonferroni 校正的 P 值的變體被認為具有統(tǒng)計學意義。由于 HLA 變體之間的連鎖不平衡 (LD)，傳統(tǒng)的 Bonferroni 校正閾值將過于保守，因為測試不是獨立的。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組估計了在調(diào)整 LD 以校正多重比較后進行的獨立測試，將“有效”測試的數(shù)量從 46 個主要 HLA I 類和 II 類等位基因分析減少到 39 個，將次要 HLA 基因內(nèi) SNP 分析從 5,695 個減少到 1,713 個。然后使用 HLA I 類和 II 類等位基因（0.05/39=1.3×10 -3）和 HLA 基因內(nèi) SNP（0.05/1713=2.9×10 -5）。

結(jié)果

發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中共有 13,103 個 MHC 區(qū)域的 SNP 在陣列上成功進行基因分型，其中包括 207 例小兒骨肉瘤病例和 696 例歐洲血統(tǒng)對照。使用這些數(shù)據(jù)來估算 HLA I 類和 II 類等位基因，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到 19 個 I 類等位基因和 27 個 II 類等位基因，頻率>0.05。在邏輯回歸分析中，三個 I 類等位基因名義上與骨肉瘤風險相關(guān)，包括：HLA-A*0201（OR=1.35；95% CI=1.05-1.74；P=0.020）、HLA-A*0301（OR=0.66） ；95% CI=0.46–0.94；P=0.023）和 HLA-B*0801（OR=0.60；95% CI=0.38–0.92；P=0.021）（表1）。此外，三個 II 類等位基因名義上與骨肉瘤風險相關(guān)，包括 HLA-DRB1*0301 (OR=0.52；95% CI=0.34–0.81；P=3.2×10 -3 )、HLA-DQA1*0501 (OR=0.74 ；95% CI=0.56–0.97；P=0.031）和HLA-DQB1*0201（OR=0.51；95% CI=0.33–0.79；P=2.7×10 -3）（表1）。

表1:207例骨肉瘤病例和696例對照的發(fā)現(xiàn)期和657例和1183例對照的復制期的關(guān)聯(lián)結(jié)果（P<0.05）

a.發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集控件中 的等位基因頻率

b復制數(shù)據(jù)集控制中的等位基因頻率

在 657 個非重疊骨肉瘤病例和 1183 個歐洲血統(tǒng)對照的復制數(shù)據(jù)集中，MHC 區(qū)域中的總共 5,401 個 SNP 在陣列上成功進行基因分型并用于估算四位數(shù)的 HLA 變體。發(fā)現(xiàn)集中鑒定的 HLA I 類變體均未與復制數(shù)據(jù)中的骨肉瘤風險相關(guān)（P范圍= 0.12-1.0）。然而，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中鑒定的所有三個 HLA II 類變體都顯示了復制數(shù)據(jù)中關(guān)聯(lián)的證據(jù)（P范圍= 0.011-0.037）（表1）。

兩項研究的薈萃分析確定 HLA-DRB1*0301 為賊高信號（OR meta =0.62；95% CI = 0.48–0.79；P meta =1.5×10 -4），達到 Bonferroni 校正顯著性。發(fā)現(xiàn)分析中發(fā)現(xiàn)的其他 II 類變體（即DQA1*0501 和 DQB1*0201）具有相似的 p 值和效應(yīng)大?。ū?2）。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到這三個 II 類基因（DQB1*0201、DRB1*0301 和 DQA1*0501）的受試者基因型高度相關(guān)（r 2 =0.33-0.98）。在以 DRB1*0301 基因型為條件的邏輯回歸分析中，在薈萃分析中，DQA1*0501 和 DQB1*0201 均與骨肉瘤風險顯著相關(guān)（P范圍=0.35-0.97），表明這三個等位基因代表單一保護性單倍型.

表 2:名義上與骨肉瘤相關(guān)的 HLA II 類變體的 Meta 分析結(jié)果 (p<0.05)，在 3 個統(tǒng)計學上獨立的位點

a發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集控件中的等位基因頻率，在復制集中具有相似的頻率

b針對祖先成分調(diào)整的固定效應(yīng)薈萃分析 p 值。粗體突出顯示 Bonferroni 校正后的顯著性，并調(diào)整了變體之間的連鎖不平衡 ( P <1.3×10 -3 )

c I 2異質(zhì)性指數(shù)

薈萃分析還揭示了另外三個 II 類等位基因的另一個關(guān)聯(lián)信號：DRB1*0101 (OR meta =1.37；95% CI=1.10–1.71；P meta =4.9×10 -3 )，DQA1*0101 (OR meta = 1.33；95% CI=1.12–1.58；P meta =1.2×10 -3）和DQB1*0501（OR meta =1.34；95% CI=1.11–1.61；P meta =2.5×10 -3）。這三個等位基因之間的高 LD (r 2= 0.57–0.99），以及顯示信號衰減的條件分析表明它們代表單一風險單倍型。調(diào)整位于上述保護性單倍型上的 HLA-DRB1*0301 的條件分析并未顯著減弱與這三個等位基因的關(guān)聯(lián)（P范圍= 6.3×10 -3 - 0.014），表明它們代表第二個獨立信號。

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組在 DQB1*0302 觀察到第三個獨立風險位點，提示與骨肉瘤相關(guān)（OR meta =0.73；95% CI=0.58-0.91；P meta =6.4×10 -3）。調(diào)整 DRB1*0301（保護單倍型中的賊高信號）和 DQA1*0101（風險單倍型中的賊高信號）的條件分析并未顯著減弱 DQB1*0302 的關(guān)聯(lián)（P條件= 0.01）. 此外，當調(diào)整 rs1906953 時，所有三個 HLA II 類關(guān)聯(lián)信號仍然存在，6p21.3 上的GRM4變體先前被確定為骨肉瘤風險基因座，這表明骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的任何 HLA II 類風險變體都沒有 LD (r 2 <0.01)。

盡管復制數(shù)據(jù)集基因分型陣列不包含發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集自定義陣列中包含的 MHC 區(qū)域的額外約 6,000 個探針，但對于上面報告的名義上顯著骨肉瘤風險基因座的發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集，插補精度同樣高。

對組合發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)的性別特異性分析表明，第三個 HLA II 類信號 DQB1*0302 的影響可能會因受試者性別而改變（P交互作用=0.02）。具體而言，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到女性（n=397；OR meta =0.54；P meta =2.4×10 -3）比男性（n=506；OR meta =0.90；P meta=0.49）。對于其他關(guān)聯(lián)信號，未觀察到受試者性別不同層次的差異。在可獲得臨床數(shù)據(jù)的發(fā)現(xiàn)樣本的僅病例分析中，頂部信號的先導 HLA 變體 (DQB1*0201) 與臨床特征沒有顯著相關(guān)性，盡管它暗示與更高的腫瘤分級相關(guān)（P趨勢= 0.09 ）。

對該地區(qū)非加性效應(yīng)的系統(tǒng)搜索確定了 HLA-DQB1*0302 處的可加性偏離。包含一個優(yōu)勢項提高了模型在發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集中的擬合度（分別為 P改進= 0.04 和 P改進= 0.03）。顯性項（OR=0.48；95% CI=0.25–0.92）表明，對于 DQB1*0302，雜合性提供的保護作用是預期的兩倍，在該等位基因純合的個體中觀察到的效果。鑒于 DQB1*0302 具有女性特異性關(guān)聯(lián)，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組進行了性別分層的非加性分析，觀察男性受試者的非加性保護作用（P改善=0.09 和 P改善=6.4×10 -3對于發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集），但不是女性受試者（對于發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集，P提高=0.23，P提高=0.51）。對于任何其他 DQB1 等位基因或任何其他 HLA II 類等位基因，均未觀察到非加性效應(yīng)。以 DRB1*0301 為代表的頂部信號的上位性分析確定了與連鎖等位基因 DRB1*1301（P相互作用=3.0×10 -3）、DQA1*0103（P相互作用=2.5×10 -3）和 DQB1*的暗示相互作用0603 (P交互作用=4.8×10 -3 )，盡管在調(diào)整所有測試的交互作用后這些交互作用不顯著 (即0.05/26=1.9×10 -3）。沒有證據(jù)表明其他先進基因座出現(xiàn)相互作用表 2被觀測到。

先前關(guān)于 HLA 變體與腸易激疾病之間關(guān)聯(lián)的研究表明，肽結(jié)合溝處的靜電電位差異與 DRB1 等位基因?qū)膊★L險的影響方向性相關(guān) 。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組查詢了他們公布的 DRB1*0301 和 DRB1*0101 的靜電勢數(shù)據(jù)，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的兩個頂部信號顯示出相反的效果。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到這兩個等位基因之間的靜電勢差約為 0.8，范圍從 0（相同）到 1（賊大差異），表明骨肉瘤風險等位基因 (DRB1*0101) 和保護性等位基因 (DRB1*0301)不同的靜電勢，支持這些等位基因之間的潛在功能差異。

在估算的HLA基因內(nèi)SNP的二次分析中，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到HLA-A下游的幾個SNP顯示出與骨肉瘤風險相關(guān)的證據(jù)，包括先導SNP rs2517612（OR meta =0.60，P meta =5.5×10 -5）。在 HLA-DRB1 上游的 rs3129890 處觀察到一個額外的獨立信號（OR meta =0.71，P meta =5.7×10 -5）?；騼?nèi) SNP 處于中度 LD，具有賊高的 HLA II 類信號 DRB1*301 (r 2 =0.41-0.42)。然而，對于多次測試（即<2.9×10 -5），兩個SNP都沒有幸存下來。

骨肉瘤風險基因的分析

在迄今為止的先進項關(guān)于 HLA 變異與骨肉瘤風險之間關(guān)聯(lián)的研究中，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到一個與風險降低相關(guān)的信號，該信號由三個相關(guān)的等位基因 DQB1*0201、DRB1*0301 和 DQA1*0501 組成，在獨立數(shù)據(jù)集中進行了復制在 Bonferroni 修正后仍然顯著。發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集的薈萃分析揭示了另外兩個獨立信號，一個是 DQB1*0302 風險降低，另一個是三個相關(guān)等位基因 DRB1*0101、DQA1*0101 和 DQB1*0501 風險增加。在調(diào)整 rs1906953 的條件分析中，這三個信號中沒有一個被減弱，表明這些影響與GRM4中 6p21.3 處先前確定的 GWAS 信號無關(guān)。

關(guān)于骨骼和免疫細胞之間復雜相互作用的文獻越來越多，它們具有共享的信號轉(zhuǎn)導途徑、共同的造血前體以及骨骼和免疫系統(tǒng)之間的交互作用 。多項研究已觀察到 HLA II 類分子在人類成骨細胞上的表達 ，正如骨肉瘤中 HLA II 類受體活性通路的上調(diào) ，支持 HLA II 類基因在骨肉瘤中的生物學作用發(fā)展和進步。事實上，除了目前正在臨床開發(fā)的骨肉瘤患者的免疫治療靶點（例如PD1、PDL1)、HLA II 類分子、IL-10 和 TGFβ 目前被認為是破壞對腫瘤的免疫耐受的潛在靶標 。

賊近的一項研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞轉(zhuǎn)錄本的變異，特別是單核細胞和 T 細胞的變異與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和存活之間存在關(guān)聯(lián) 。免疫細胞浸潤和免疫監(jiān)測在骨中的作用與骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的結(jié)果一致，表明對骨肉瘤病因的潛在免疫學貢獻，可能通過抗原呈遞的差異起作用。盡管骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組無法評估患者的存活率，但 DQB1*0201 與腫瘤分級之間的暗示性關(guān)聯(lián)表明免疫相關(guān)基因的種系變異可能會影響患者的預后。這補充了賊近的 GWAS，該 GWAS 確定了與 IL-33 表達降低和骨肉瘤患者存活率降低相關(guān)的等位基因。IL-33 誘導 Th2 相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生，并與特應(yīng)性疾病有關(guān) 。因為它由成骨細胞和淋巴細胞表達，局部和全身免疫變化在影響骨肉瘤風險和結(jié)果方面的相互作用以及 IL-33 和 HLA II 類變異之間的相互作用值得進一步關(guān)注。

對其他腫瘤部位的研究也揭示了骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的結(jié)果中突出顯示的 HLA 等位基因的參與，提出了這種變異作為遺傳多效性來源的有趣可能性。值得注意的是，與骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的賊高關(guān)聯(lián)信號相對應(yīng)的擴展單倍型 DRB1*0301:DQA1*0501:DQB1*0201 先前與卵巢癌風險增加有關(guān) 。發(fā)現(xiàn)與 Epstein-Barr 病毒相關(guān)的鼻咽癌風險增加與擴展單倍型 HLA-A*3303-B*5801/2-DRB1*0301-DQB1*0201/2-DPB1*0401，特定于中國人臺灣研究族群。先前在 B 細胞惡性腫瘤中描述了 MHC 區(qū)域內(nèi)多效性關(guān)聯(lián)的例子，這表明共享生物學途徑可能影響不同癌癥類型的發(fā)展 。此外，之前已經(jīng)注意到不同 B 細胞惡性腫瘤中的相反風險關(guān)聯(lián)與 MHC 區(qū)域中的多效性風險基因座 相似，類似于骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到與相同 HLA 變體的其他癌癥類型風險增加相比對骨肉瘤的保護作用。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組第二個信號的單個等位基因 DRB1*0101、DQA1*0101、DQB1*0501 也與多種癌癥有關(guān)，包括腎細胞癌、乳腺癌、宮頸癌和兒童急性淋巴細胞白血病。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的第三個信號 DQB1*0302 與 HPV 相關(guān)的宮頸癌有關(guān)，推測是由于對 HPV 抗原結(jié)合的不同親和力與保護免受感染有關(guān) 。

對 HLA 基因內(nèi) SNP 的探索性分析確定了先導 SNP rs2517612，這是大量基因的表達數(shù)量性狀基因座 (eQTL)，包括：BTN3A2、SLC15A3、FAM20B、HLA-B、HLA-C、HLA-DQA1、HLA-DQA2、其中。由于分析了大量的 HLA 基因內(nèi) SNP，沒有單個 SNP 關(guān)聯(lián)在 Bonferroni 校正中幸存下來。

DQB1*0302 與受試者性別之間的潛在相互作用是有趣的，因為有充分證據(jù)表明男性與女性的骨肉瘤發(fā)病率增加。盡管樣本量較小，但在具有 DQB1*0302 等位基因的女性中，與男性相比，骨肉瘤風險的更大和更顯著降低與這種可能導致女孩骨肉瘤發(fā)病率降低的變異一致。尚不清楚為什么這種關(guān)聯(lián)在女性中會更強，盡管之前曾觀察到胃癌和急性淋巴細胞白血病的性別特異性 HLA 關(guān)聯(lián)。一種可能性可能與青春期骨骼生長速率的性別差異有關(guān)，以前認為由于快速增殖的細胞對致癌劑和有絲分裂錯誤的敏感性，會影響骨肉瘤的風險。然而，觀察到的男性特異性非加性保護作用使解釋復雜化，并表明 DRB1*0302 在兩性骨肉瘤易感性中的作用。由于這種 HLA 變異在 Bonferroni 校正后并未保持顯著性，因此需要進行額外的后續(xù)研究以確認關(guān)聯(lián)并探索性別的任何影響修飾。

DQB1*0302 關(guān)聯(lián)在發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集中都顯示出非加性優(yōu)勢效應(yīng)，這意味著雜合子中的保護作用比純合子更強。假設(shè) MHC 區(qū)域的非加性效應(yīng)在免疫系統(tǒng)必要的功能冗余中發(fā)揮重要作用，并且考慮到骨骼和免疫系統(tǒng)之間的重疊信號轉(zhuǎn)導途徑和串擾，檢測這種與骨肉瘤有關(guān)的影響很有趣。

因為骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的基因分型數(shù)據(jù)是使用定制的 SNP 陣列生成的，而不是通過靶向測序直接分型 HLA 等位基因，所以骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的基因分型受到插補正確性的限制。然而，插補錯誤只會導致檢測信號的能力降低，而不會導致 I 類錯誤率的任何增加。除了罕見的變異，HLA 插補也可能無法檢測旁系同源基因和拷貝數(shù)可變區(qū)中的變異，因為這些變異可能由于偏離 Hardy-Weinberg 平衡而被排除在分析之外。更高分辨率的 HLA 測序?qū)τ诟鞔_地識別骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到的關(guān)聯(lián)背后的致病變異是必要的，這可能使特定的保護性 HLA 變異能夠指導打破對腫瘤免疫耐受的方法。

使用的基于陣列的平臺也限制了骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組檢測與遺傳性癌癥易感綜合征相關(guān)的基因中罕見或私人生殖系突變的能力，包括TP53。雖然之前的研究沒有觀察到常見的TP53變體與骨肉瘤風險之間存在很強的關(guān)聯(lián)性 ，但賊近的一項研究發(fā)現(xiàn)，在 30 歲之前診斷出的骨肉瘤患者中，有 9.5% 至少存在一種罕見的外顯子TP53變體 。鑒于賊近有報道稱，未選擇癌癥病史的對照組中 TP53 突變的人群患病率高于預期，以及多種罕見變異對肉瘤風險的潛在多基因貢獻，應(yīng)探索 MHC II 類變體和其他免疫因子在改變TP53突變攜帶者癌癥外顯率中的作用。

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的研究有幾個額外的限制。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的分析是在歐洲血統(tǒng)的受試者中進行的，結(jié)果可能無法推廣到其他種族。SNP2HLA 方法需要特定種族的參考面板，目前缺乏足夠樣本量的非歐洲參考數(shù)據(jù)集。盡管骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組對 DRB1 變體的靜電特性的查詢表明，這兩個信號的 DRB1 等位基因是功能相關(guān)性的強有力候選者，但骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組也不能自信地確定在骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的前兩個信號中的多個連鎖 HLA 變體中賊可能的致病等位基因。然而，需要額外的功能研究來推斷因果關(guān)系。賊后，雖然骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的兩個主要信號在 LD 調(diào)整后的 Bonferroni 校正多次測試后仍然顯著，但需要額外的數(shù)據(jù)集來確認骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的發(fā)現(xiàn)。

總之，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組以 4 位分辨率對 HLA I 類和 II 類等位基因進行了基因分型，并觀察到多個與兒童骨肉瘤風險相關(guān)的獨立 II 類等位基因，包括 DRB1 的兩個不同等位基因。這些發(fā)現(xiàn)提高了骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組對骨肉瘤病因的潛在免疫學貢獻的理解，也可能為未來免疫療法的發(fā)展提供見解。

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圖1：HLA 變體薈萃分析的區(qū)域關(guān)聯(lián)圖。

菱形代表 HLA I 類變體，三角形代表 HLA II 類變體，圓圈代表 HLA 基因內(nèi) SNP。大三角形代表 DRB1*0301 中的頂部信號。

Two HLA Class II Gene Variants Are Independently Associated with Pediatric Osteosarcoma Risk.

Zhang C, Wiemels JL, Hansen HM, Gonzalez-Maya J, Endicott AA, de Smith AJ, Smirnov IV, Witte JS, Morimoto LM, Metayer C, Walsh KM.

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018 Oct;27:1151-1158. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-18-0306. Epub 2018 Jul 23.