【佳學基因檢測】在兒科檢測兩種 HLA II 基因變異預測骨肉瘤風險

HLA突變與骨肉瘤風險基因檢測導讀：

背景：

盡管發(fā)表了全基因組關聯(lián)研究，但骨肉瘤的遺傳病因仍然知之甚少。已經(jīng)觀察到人類白細胞抗原 (HLA) 基因變異與幾種癌癥風險之間的關聯(lián)，但標準 SNP 陣列無法很好地捕獲 HLA 變異。

方法：

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組使用定制的全基因組陣列對 207 名加利福尼亞小兒骨肉瘤病例和 696 名歐洲血統(tǒng)對照進行了基因分型，并在 MHC 區(qū)域內(nèi)補充了約 6,000 個額外的探針。隨后，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組使用 5,225 名通過下一代測序進行高分辨率 HLA 分型的參考小組來估算四位數(shù)的經(jīng)典 HLA 等位基因。病例對照比較針對具有祖先信息的主成分進行了調(diào)整，發(fā)現(xiàn)分析中的先進關聯(lián)在 657 例病例和 1183 例對照的獨立數(shù)據(jù)集中進行了復制。

結果：

在發(fā)現(xiàn)分析中，三個高度相關的 HLA II 類變異 (r 2 =0.33–0.98) 與骨肉瘤風險相關，包括 HLA-DRB1*0301 (OR=0.52; P=3.2×10 -3 )、HLA-DQA1*0501 ( OR=0.74；P=0.031）和HLA-DQB1*0201（OR=0.51；P=2.7×10 -3）。在復制數(shù)據(jù)中觀察到類似的關聯(lián)（P范圍= 0.011-0.037）。兩個數(shù)據(jù)集的薈萃分析將 HLA-DRB1*0301 確定為賊顯著相關的變體（OR meta =0.62；P meta =1.5×10 -4），達到 Bonferroni 校正的統(tǒng)計顯著性。薈萃分析還揭示了 HLA-DQA1*01:01 處的第二個重要獨立信號（OR meta =1.33，Pmeta =1.2×10 -3），以及在 HLA-DQB1*0302 處的第三個暗示關聯(lián)（OR meta =0.73， P meta =6.4×10 -3）。

結論：

多個獨立的 HLA II 類等位基因可能會影響骨肉瘤的風險。

影響：

需要做更多的工作來將骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的觀察擴展到其他患者群體，并闡明這些關聯(lián)背后的潛在因果機制。了解免疫對骨肉瘤病因的貢獻可能會為合理的治療靶點提供信息。

介紹

骨肉瘤是賊常診斷的原發(fā)性惡性骨腫瘤，發(fā)病高峰發(fā)生在青春期。在美國，每年在 20 歲以下的個體中診斷出大約 400 例新病例 ，在全球范圍內(nèi)觀察到的兒童期和青少年期骨肉瘤發(fā)病率相似 。骨肉瘤的危險因素包括較高的身材和男性，但該疾病的遺傳病因仍然知之甚少。雖然骨肉瘤風險增加與骨佩吉特病和遺傳性癌癥易感綜合征（例如Li-Fraumeni 綜合征）有關，但大多數(shù)病例是散發(fā)性的. 候選基因研究表明，DNA 修復途徑 、生長激素途徑 和端粒維持途徑 中的常見遺傳變異在導致骨肉瘤風險中的作用，但只有一個單一的全基因組關聯(lián)研究 (GWAS) 迄今已發(fā)表 。該 GWAS 報告了兩個與骨肉瘤相關的風險位點，其中一個位于GRM4基因的 6p21.3 處，距主要組織相容性復合體 (MHC) II 類區(qū)域約 1 Mb。

MHC 區(qū)域，在染色體 6p21 上包含約 7.6Mb，是基因組中多態(tài)性和基因賊密集的區(qū)域之一，包括高度可變的人類白細胞抗原 (HLA) 基因。在之前對慢性淋巴細胞白血病、肺鱗狀細胞癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌和鼻咽癌的研究中，HLA 變異與癌癥風險相關。已經(jīng)假設了將 HLA 遺傳變異與癌癥發(fā)展聯(lián)系起來的各種機制，包括免疫系統(tǒng)對腫瘤的不同耐受性、免疫監(jiān)視的效率和癌癥免疫編輯導致某些 HLA 變異易患特定惡性腫瘤。研究可遺傳的 HLA 變異在骨肉瘤風險中的作用可能會為疾病病因?qū)W提供信息，并為免疫治療的潛在策略提供信息。

雖然之前的骨肉瘤 GWAS 沒有報告 MHC 區(qū)域的任何信號，但由于 MHC 中序列和拷貝數(shù)變異的獨特特征，標準全基因組 SNP 陣列不能很好地捕獲 HLA 基因中的遺傳變異和單倍型結構地區(qū)。使用定制的 Affymetrix Axiom 陣列，并輔以跨越 MHC 區(qū)域的約 6,000 個額外探針，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組以四位數(shù)分辨率鍵入經(jīng)典 HLA 等位基因（例如 HLA-DRB1*1501) 并測試與小兒骨肉瘤風險的關聯(lián)。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組隨后嘗試在一組獨立的骨肉瘤病例和對照中進行復制，并對這兩個數(shù)據(jù)集進行薈萃分析，總共 864 例病例和 1879 例對照。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組進一步評估了 MHC 區(qū)域中的非加性遺傳關聯(lián)作為一種補充方法，因為觀察到 HLA 變體對許多疾病的廣泛非加性和上位效應，以及受試者性別的任何潛在修飾或臨床表現(xiàn)（例如腫瘤位置、轉(zhuǎn)移的存在、診斷時的年齡）以進一步了解這種侵襲性癌癥的病因、進展和預后。

材料和方法

發(fā)現(xiàn)樣本：

該研究得到了加州大學伯克利分校和舊金山分校的機構審查委員會以及加州公共衛(wèi)生部 (CDPH) 的批準。本研究中使用的生物樣本和/或數(shù)據(jù)來自加利福尼亞生物銀行計劃（SIS 請求編號 550）。CDPH，遺傳疾病篩查部門從該州出生的所有新生兒中獲取新生兒血液樣本，以進行疾病篩查。自 1982 年以來，篩選后殘留的血斑已在 -20°C 下存檔，并可供批準的研究使用。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組將 CDPH 維護的全州出生記錄（1982-2009 年）與加州癌癥登記處（CCR，1988-2011 年）的癌癥診斷數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。根據(jù) CCR 記錄，該分析包括 1982 年至 2009 年期間在加利福尼亞出生并在 19 歲時被診斷出患有骨肉瘤（ICD-O-3 代碼 9180-9183、9185-9187 和 9192-9195）的非西班牙裔白人兒童。選擇同一時期在加利福尼亞州出生且未向 CCR 報告患有任何兒童癌癥的兒童作為對照。

DNA提?。?/h3>

將 12mm 干血斑的三分之一分成三個均勻的部分，并在提取前置于 2mL 微量離心管中，使用 QIAamp DNA Investigator Kit (Qiagen) 進行提取。簡而言之，將 280 μL Buffer ATL 和 20 μL 蛋白酶 K 添加到每個樣品中。渦旋樣品，然后在干浴振蕩器中以 900rpm 和 56°C 孵育一小時。孵育后，將樣品短暫離心，將裂解液轉(zhuǎn)移到新的 2mL 微量離心管中，同時丟棄固體殘留物。將 1μL 的 1ng/μL 載體 RNA 添加到裂解物中，然后短暫渦旋。加入載體 RNA 后，將樣品放入 Qiagen Qiacube 自動化工作站進行 DNA 分離。Qiacube 提取方案的結果是 ATE 緩沖液中的純化 DNA 樣品。

Discovery 樣本基因分型和質(zhì)量控制：

根據(jù)病例對照狀態(tài)、報告的種族和性別，使用封閉式隨機化將 DNA 標本分配到基因分型板。DNA 在 Affymetrix Axiom Latino Array 上進行基因分型，具有高覆蓋率的歐洲血統(tǒng)，并在 MHC 區(qū)域補充了約 6,000 個額外的 SNP 探針。DNA 樣本在 Affymetrix TITAN 系統(tǒng)上進行基因分型，并使用 Affymetrix Genetools 處理原始圖像文件以調(diào)用基因型。

陣列中包含的重復樣本 (n = 34) 的平均基因型一致性 > 99%。如前所述 迭代地執(zhí)行 SNP 和樣本的調(diào)用率過濾，不包括調(diào)用率 <97% 的 SNP 和調(diào)用率 <97% 的樣本。在歐洲血統(tǒng)對照和報告性別與基因分型性別不匹配的樣本中，SNP顯示出明顯偏離Hardy-Weinberg平衡（P<1.0×10 -5 ）被排除在外。發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)中排除了來自每個受試者對的一個個體，其身份認同（IBD）比例> 0.18。使用來自 1184 個 HapMap Phase 3 樣本的全基因組 SNP 陣列數(shù)據(jù)，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組使用等位基因頻率>0.05 的未鏈接常染色體雙等位基因 SNP 進行主成分分析，并從分析中刪除任何顯示非歐洲血統(tǒng)證據(jù)的樣本（平均 CEPH 值 >3 SD在 PC 1-3 上）。

復制數(shù)據(jù)集：

骨肉瘤復制數(shù)據(jù)集來自 dbGaP 研究加入 phs000734.v1.p1（骨肉瘤風險的全基因組關聯(lián)研究 (GWAS)）和 phs000381.v1.p1（eMERGE Geisinger eGenomic Medicine MyCode Project Controls）。病例和對照在 Illumina OmniExpress 陣列上進行基因分型，并如前所述進行質(zhì)量控制過濾 。簡而言之，調(diào)用率 <0.98 的 SNP 和基因分型調(diào)用率 <0.97 的受試者被刪除。使用 Eigenstrat  和 HapMap 參考樣本和前五個主成分的平均值是在 HapMap CEPH 樣本中計算的。具有非歐洲血統(tǒng)證據(jù)的受試者（平均 CEPH 值 > 3 SD）被排除在外。具有 Hardy-Weinberg 平衡P <1.0×10 -5的 SNP其中控件被刪除。比較了發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集中的骨肉瘤病例，并從復制數(shù)據(jù)集中排除了重復和隱匿相關（IBD>0.18）樣本（n=22 重復患者，0 例隱匿相關患者）。賊終復制數(shù)據(jù)集中總共包含 657 個不重疊的歐洲血統(tǒng)病例和 1183 個對照。來自 dbGaP 的骨肉瘤患者主要是兒童和青少年（年齡 < 21 歲），盡管無法獲得個體水平的年齡數(shù)據(jù)，并且賊初的出版物并不限于特定的年齡范圍。這些骨肉瘤患者是先前 GWAS 出版物中包含的患者的一個子集 。

HLA基因型的插補：

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組估算了三個主要 I 類基因（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）和五個 II 類基因（HLA-DRB1、-DPA1、-DPB1、-DQA1 和-DQB1)，以及使用 SNP2HLA 的 5,695 個 HLA 基因內(nèi) SNP，它使用來自 1 型糖尿病遺傳學聯(lián)盟的 5,225 名歐洲血統(tǒng)個體的參考小組，這些人通過下一代測序進行了高分辨率 HLA 分型。如前所述，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組使用 SNP2HLA 推算的等位基因劑量數(shù)據(jù)進行主要的 MHC 范圍關聯(lián)分析，并使用分階段的賊佳猜測基因型進行非加性效應分析。關聯(lián)分析僅限于經(jīng)典的四位數(shù) HLA I 類和 II 類等位基因，插補質(zhì)量評分 INFO>0.80，等位基因頻率>0.05（19 個 I 類等位基因，27 個 II 類等位基因）。對于非加性效應分析，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組僅限于在每個分析的 HLA 基因上具有兩個賊佳猜測單倍型的個體。

統(tǒng)計分析：

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組對 HLA I 類和 II 類等位基因中的每一個進行了邏輯回歸分析，使用 SNP2HLA 輸出的推算等位基因劑量和 PLINK 1.9 中的“邏輯”命令，調(diào)整 Eigenstrat 生成的前 10 個祖先信息主成分。作為二次探索性調(diào)查，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組還對 MHC 區(qū)域中的 5,695 個估算的 HLA 基因內(nèi) SNP 進行了關聯(lián)分析。分析在發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集中分別進行，并使用 PLINK 中的“元分析”命令進行元分析。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組通過重復調(diào)整頂部信號的邏輯回歸來進行條件分析。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組還針對 SNP rs1906953 進行了調(diào)整，這是一種先前發(fā)現(xiàn)的骨肉瘤 GWAS 在 6p21 命中。3 位于距 MHC 區(qū)域約 1 Mb 的位置，以評估骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組分析中存在的頂部信號的任何衰減。對于性別分層分析，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組分別檢查了男性和女性的關聯(lián)信號，并測試了效應的異質(zhì)性。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組還進行了僅病例分析，評估病例對照分析中確定的先進 HLA 關聯(lián)信號是否與臨床表現(xiàn)的差異相關，包括：診斷年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、擴展、分化和轉(zhuǎn)移的存在。有關臨床變量的信息僅可用于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集，編碼如前所述（評估病例對照分析中確定的先進 HLA 關聯(lián)信號是否與臨床表現(xiàn)的差異相關，包括：診斷年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、擴展、分化和轉(zhuǎn)移的存在。有關臨床變量的信息僅可用于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集，編碼如前所述（評估病例對照分析中確定的先進 HLA 關聯(lián)信號是否與臨床表現(xiàn)的差異相關，包括：診斷年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、擴展、分化和轉(zhuǎn)移的存在。有關臨床變量的信息僅可用于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集，編碼如前所述。

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組通過評估先前研究中描述的優(yōu)勢效應模型來研究 HLA 等位基因的非加性效應 。簡而言之，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組測試了模型擬合的改進，將加性效應模型與另外包括一個表示所研究的每個 HLA 等位基因的雜合狀態(tài)的顯性項的模型進行比較。來自 χ2 檢驗的模型改進的 P 值表示與加性模型的偏差的顯著性。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組還測試了檢測到的每個獨立信號中的先進變體與每個剩余的 II 類變體之間的相互作用。

在發(fā)現(xiàn)分析中達到標稱統(tǒng)計學意義的 HLA I 類和 II 類等位基因 (P<0.05) 被用于復制。在兩個數(shù)據(jù)集中實現(xiàn)名義顯著性并且在薈萃分析中實現(xiàn)超過 Bonferroni 校正的 P 值的變體被認為具有統(tǒng)計學意義。由于 HLA 變體之間的連鎖不平衡 (LD)，傳統(tǒng)的 Bonferroni 校正閾值將過于保守，因為測試不是獨立的。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組估計了在調(diào)整 LD 以校正多重比較后進行的獨立測試，將“有效”測試的數(shù)量從 46 個主要 HLA I 類和 II 類等位基因分析減少到 39 個，將次要 HLA 基因內(nèi) SNP 分析從 5,695 個減少到 1,713 個。然后使用 HLA I 類和 II 類等位基因（0.05/39=1.3×10 -3）和 HLA 基因內(nèi) SNP（0.05/1713=2.9×10 -5）。

結果

發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中共有 13,103 個 MHC 區(qū)域的 SNP 在陣列上成功進行基因分型，其中包括 207 例小兒骨肉瘤病例和 696 例歐洲血統(tǒng)對照。使用這些數(shù)據(jù)來估算 HLA I 類和 II 類等位基因，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到 19 個 I 類等位基因和 27 個 II 類等位基因，頻率>0.05。在邏輯回歸分析中，三個 I 類等位基因名義上與骨肉瘤風險相關，包括：HLA-A*0201（OR=1.35；95% CI=1.05-1.74；P=0.020）、HLA-A*0301（OR=0.66） ；95% CI=0.46–0.94；P=0.023）和 HLA-B*0801（OR=0.60；95% CI=0.38–0.92；P=0.021）（表1）。此外，三個 II 類等位基因名義上與骨肉瘤風險相關，包括 HLA-DRB1*0301 (OR=0.52；95% CI=0.34–0.81；P=3.2×10 -3 )、HLA-DQA1*0501 (OR=0.74 ；95% CI=0.56–0.97；P=0.031）和HLA-DQB1*0201（OR=0.51；95% CI=0.33–0.79；P=2.7×10 -3）（表1）。

表1:207例骨肉瘤病例和696例對照的發(fā)現(xiàn)期和657例和1183例對照的復制期的關聯(lián)結果（P<0.05）

a.發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集控件中 的等位基因頻率

b復制數(shù)據(jù)集控制中的等位基因頻率

在 657 個非重疊骨肉瘤病例和 1183 個歐洲血統(tǒng)對照的復制數(shù)據(jù)集中，MHC 區(qū)域中的總共 5,401 個 SNP 在陣列上成功進行基因分型并用于估算四位數(shù)的 HLA 變體。發(fā)現(xiàn)集中鑒定的 HLA I 類變體均未與復制數(shù)據(jù)中的骨肉瘤風險相關（P范圍= 0.12-1.0）。然而，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中鑒定的所有三個 HLA II 類變體都顯示了復制數(shù)據(jù)中關聯(lián)的證據(jù)（P范圍= 0.011-0.037）（表1）。

兩項研究的薈萃分析確定 HLA-DRB1*0301 為賊高信號（OR meta =0.62；95% CI = 0.48–0.79；P meta =1.5×10 -4），達到 Bonferroni 校正顯著性。發(fā)現(xiàn)分析中發(fā)現(xiàn)的其他 II 類變體（即DQA1*0501 和 DQB1*0201）具有相似的 p 值和效應大小（表 2）。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到這三個 II 類基因（DQB1*0201、DRB1*0301 和 DQA1*0501）的受試者基因型高度相關（r 2 =0.33-0.98）。在以 DRB1*0301 基因型為條件的邏輯回歸分析中，在薈萃分析中，DQA1*0501 和 DQB1*0201 均與骨肉瘤風險顯著相關（P范圍=0.35-0.97），表明這三個等位基因代表單一保護性單倍型.

表 2:名義上與骨肉瘤相關的 HLA II 類變體的 Meta 分析結果 (p<0.05)，在 3 個統(tǒng)計學上獨立的位點

a發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集控件中的等位基因頻率，在復制集中具有相似的頻率

b針對祖先成分調(diào)整的固定效應薈萃分析 p 值。粗體突出顯示 Bonferroni 校正后的顯著性，并調(diào)整了變體之間的連鎖不平衡 ( P <1.3×10 -3 )

c I 2異質(zhì)性指數(shù)

薈萃分析還揭示了另外三個 II 類等位基因的另一個關聯(lián)信號：DRB1*0101 (OR meta =1.37；95% CI=1.10–1.71；P meta =4.9×10 -3 )，DQA1*0101 (OR meta = 1.33；95% CI=1.12–1.58；P meta =1.2×10 -3）和DQB1*0501（OR meta =1.34；95% CI=1.11–1.61；P meta =2.5×10 -3）。這三個等位基因之間的高 LD (r 2= 0.57–0.99），以及顯示信號衰減的條件分析表明它們代表單一風險單倍型。調(diào)整位于上述保護性單倍型上的 HLA-DRB1*0301 的條件分析并未顯著減弱與這三個等位基因的關聯(lián)（P范圍= 6.3×10 -3 - 0.014），表明它們代表第二個獨立信號。

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組在 DQB1*0302 觀察到第三個獨立風險位點，提示與骨肉瘤相關（OR meta =0.73；95% CI=0.58-0.91；P meta =6.4×10 -3）。調(diào)整 DRB1*0301（保護單倍型中的賊高信號）和 DQA1*0101（風險單倍型中的賊高信號）的條件分析并未顯著減弱 DQB1*0302 的關聯(lián)（P條件= 0.01）. 此外，當調(diào)整 rs1906953 時，所有三個 HLA II 類關聯(lián)信號仍然存在，6p21.3 上的GRM4變體先前被確定為骨肉瘤風險基因座，這表明骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的任何 HLA II 類風險變體都沒有 LD (r 2 <0.01)。

盡管復制數(shù)據(jù)集基因分型陣列不包含發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集自定義陣列中包含的 MHC 區(qū)域的額外約 6,000 個探針，但對于上面報告的名義上顯著骨肉瘤風險基因座的發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集，插補精度同樣高。

對組合發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)的性別特異性分析表明，第三個 HLA II 類信號 DQB1*0302 的影響可能會因受試者性別而改變（P交互作用=0.02）。具體而言，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到女性（n=397；OR meta =0.54；P meta =2.4×10 -3）比男性（n=506；OR meta =0.90；P meta=0.49）。對于其他關聯(lián)信號，未觀察到受試者性別不同層次的差異。在可獲得臨床數(shù)據(jù)的發(fā)現(xiàn)樣本的僅病例分析中，頂部信號的先導 HLA 變體 (DQB1*0201) 與臨床特征沒有顯著相關性，盡管它暗示與更高的腫瘤分級相關（P趨勢= 0.09 ）。

對該地區(qū)非加性效應的系統(tǒng)搜索確定了 HLA-DQB1*0302 處的可加性偏離。包含一個優(yōu)勢項提高了模型在發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集中的擬合度（分別為 P改進= 0.04 和 P改進= 0.03）。顯性項（OR=0.48；95% CI=0.25–0.92）表明，對于 DQB1*0302，雜合性提供的保護作用是預期的兩倍，在該等位基因純合的個體中觀察到的效果。鑒于 DQB1*0302 具有女性特異性關聯(lián)，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組進行了性別分層的非加性分析，觀察男性受試者的非加性保護作用（P改善=0.09 和 P改善=6.4×10 -3對于發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集），但不是女性受試者（對于發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集，P提高=0.23，P提高=0.51）。對于任何其他 DQB1 等位基因或任何其他 HLA II 類等位基因，均未觀察到非加性效應。以 DRB1*0301 為代表的頂部信號的上位性分析確定了與連鎖等位基因 DRB1*1301（P相互作用=3.0×10 -3）、DQA1*0103（P相互作用=2.5×10 -3）和 DQB1*的暗示相互作用0603 (P交互作用=4.8×10 -3 )，盡管在調(diào)整所有測試的交互作用后這些交互作用不顯著 (即0.05/26=1.9×10 -3）。沒有證據(jù)表明其他先進基因座出現(xiàn)相互作用表 2被觀測到。

先前關于 HLA 變體與腸易激疾病之間關聯(lián)的研究表明，肽結合溝處的靜電電位差異與 DRB1 等位基因?qū)膊★L險的影響方向性相關 。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組查詢了他們公布的 DRB1*0301 和 DRB1*0101 的靜電勢數(shù)據(jù)，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的兩個頂部信號顯示出相反的效果。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到這兩個等位基因之間的靜電勢差約為 0.8，范圍從 0（相同）到 1（賊大差異），表明骨肉瘤風險等位基因 (DRB1*0101) 和保護性等位基因 (DRB1*0301)不同的靜電勢，支持這些等位基因之間的潛在功能差異。

在估算的HLA基因內(nèi)SNP的二次分析中，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到HLA-A下游的幾個SNP顯示出與骨肉瘤風險相關的證據(jù)，包括先導SNP rs2517612（OR meta =0.60，P meta =5.5×10 -5）。在 HLA-DRB1 上游的 rs3129890 處觀察到一個額外的獨立信號（OR meta =0.71，P meta =5.7×10 -5）。基因內(nèi) SNP 處于中度 LD，具有賊高的 HLA II 類信號 DRB1*301 (r 2 =0.41-0.42)。然而，對于多次測試（即<2.9×10 -5），兩個SNP都沒有幸存下來。

骨肉瘤風險基因的分析

在迄今為止的先進項關于 HLA 變異與骨肉瘤風險之間關聯(lián)的研究中，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到一個與風險降低相關的信號，該信號由三個相關的等位基因 DQB1*0201、DRB1*0301 和 DQA1*0501 組成，在獨立數(shù)據(jù)集中進行了復制在 Bonferroni 修正后仍然顯著。發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集的薈萃分析揭示了另外兩個獨立信號，一個是 DQB1*0302 風險降低，另一個是三個相關等位基因 DRB1*0101、DQA1*0101 和 DQB1*0501 風險增加。在調(diào)整 rs1906953 的條件分析中，這三個信號中沒有一個被減弱，表明這些影響與GRM4中 6p21.3 處先前確定的 GWAS 信號無關。

關于骨骼和免疫細胞之間復雜相互作用的文獻越來越多，它們具有共享的信號轉(zhuǎn)導途徑、共同的造血前體以及骨骼和免疫系統(tǒng)之間的交互作用 。多項研究已觀察到 HLA II 類分子在人類成骨細胞上的表達 ，正如骨肉瘤中 HLA II 類受體活性通路的上調(diào) ，支持 HLA II 類基因在骨肉瘤中的生物學作用發(fā)展和進步。事實上，除了目前正在臨床開發(fā)的骨肉瘤患者的免疫治療靶點（例如PD1、PDL1)、HLA II 類分子、IL-10 和 TGFβ 目前被認為是破壞對腫瘤的免疫耐受的潛在靶標 。

賊近的一項研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞轉(zhuǎn)錄本的變異，特別是單核細胞和 T 細胞的變異與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和存活之間存在關聯(lián) 。免疫細胞浸潤和免疫監(jiān)測在骨中的作用與骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的結果一致，表明對骨肉瘤病因的潛在免疫學貢獻，可能通過抗原呈遞的差異起作用。盡管骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組無法評估患者的存活率，但 DQB1*0201 與腫瘤分級之間的暗示性關聯(lián)表明免疫相關基因的種系變異可能會影響患者的預后。這補充了賊近的 GWAS，該 GWAS 確定了與 IL-33 表達降低和骨肉瘤患者存活率降低相關的等位基因。IL-33 誘導 Th2 相關細胞因子的產(chǎn)生，并與特應性疾病有關 。因為它由成骨細胞和淋巴細胞表達，局部和全身免疫變化在影響骨肉瘤風險和結果方面的相互作用以及 IL-33 和 HLA II 類變異之間的相互作用值得進一步關注。

對其他腫瘤部位的研究也揭示了骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的結果中突出顯示的 HLA 等位基因的參與，提出了這種變異作為遺傳多效性來源的有趣可能性。值得注意的是，與骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的賊高關聯(lián)信號相對應的擴展單倍型 DRB1*0301:DQA1*0501:DQB1*0201 先前與卵巢癌風險增加有關 。發(fā)現(xiàn)與 Epstein-Barr 病毒相關的鼻咽癌風險增加與擴展單倍型 HLA-A*3303-B*5801/2-DRB1*0301-DQB1*0201/2-DPB1*0401，特定于中國人臺灣研究族群。先前在 B 細胞惡性腫瘤中描述了 MHC 區(qū)域內(nèi)多效性關聯(lián)的例子，這表明共享生物學途徑可能影響不同癌癥類型的發(fā)展 。此外，之前已經(jīng)注意到不同 B 細胞惡性腫瘤中的相反風險關聯(lián)與 MHC 區(qū)域中的多效性風險基因座 相似，類似于骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到與相同 HLA 變體的其他癌癥類型風險增加相比對骨肉瘤的保護作用。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組第二個信號的單個等位基因 DRB1*0101、DQA1*0101、DQB1*0501 也與多種癌癥有關，包括腎細胞癌、乳腺癌、宮頸癌和兒童急性淋巴細胞白血病。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的第三個信號 DQB1*0302 與 HPV 相關的宮頸癌有關，推測是由于對 HPV 抗原結合的不同親和力與保護免受感染有關 。

對 HLA 基因內(nèi) SNP 的探索性分析確定了先導 SNP rs2517612，這是大量基因的表達數(shù)量性狀基因座 (eQTL)，包括：BTN3A2、SLC15A3、FAM20B、HLA-B、HLA-C、HLA-DQA1、HLA-DQA2、其中。由于分析了大量的 HLA 基因內(nèi) SNP，沒有單個 SNP 關聯(lián)在 Bonferroni 校正中幸存下來。

DQB1*0302 與受試者性別之間的潛在相互作用是有趣的，因為有充分證據(jù)表明男性與女性的骨肉瘤發(fā)病率增加。盡管樣本量較小，但在具有 DQB1*0302 等位基因的女性中，與男性相比，骨肉瘤風險的更大和更顯著降低與這種可能導致女孩骨肉瘤發(fā)病率降低的變異一致。尚不清楚為什么這種關聯(lián)在女性中會更強，盡管之前曾觀察到胃癌和急性淋巴細胞白血病的性別特異性 HLA 關聯(lián)。一種可能性可能與青春期骨骼生長速率的性別差異有關，以前認為由于快速增殖的細胞對致癌劑和有絲分裂錯誤的敏感性，會影響骨肉瘤的風險。然而，觀察到的男性特異性非加性保護作用使解釋復雜化，并表明 DRB1*0302 在兩性骨肉瘤易感性中的作用。由于這種 HLA 變異在 Bonferroni 校正后并未保持顯著性，因此需要進行額外的后續(xù)研究以確認關聯(lián)并探索性別的任何影響修飾。

DQB1*0302 關聯(lián)在發(fā)現(xiàn)和復制數(shù)據(jù)集中都顯示出非加性優(yōu)勢效應，這意味著雜合子中的保護作用比純合子更強。假設 MHC 區(qū)域的非加性效應在免疫系統(tǒng)必要的功能冗余中發(fā)揮重要作用，并且考慮到骨骼和免疫系統(tǒng)之間的重疊信號轉(zhuǎn)導途徑和串擾，檢測這種與骨肉瘤有關的影響很有趣。

因為骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的基因分型數(shù)據(jù)是使用定制的 SNP 陣列生成的，而不是通過靶向測序直接分型 HLA 等位基因，所以骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的基因分型受到插補正確性的限制。然而，插補錯誤只會導致檢測信號的能力降低，而不會導致 I 類錯誤率的任何增加。除了罕見的變異，HLA 插補也可能無法檢測旁系同源基因和拷貝數(shù)可變區(qū)中的變異，因為這些變異可能由于偏離 Hardy-Weinberg 平衡而被排除在分析之外。更高分辨率的 HLA 測序?qū)τ诟鞔_地識別骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組觀察到的關聯(lián)背后的致病變異是必要的，這可能使特定的保護性 HLA 變異能夠指導打破對腫瘤免疫耐受的方法。

使用的基于陣列的平臺也限制了骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組檢測與遺傳性癌癥易感綜合征相關的基因中罕見或私人生殖系突變的能力，包括TP53。雖然之前的研究沒有觀察到常見的TP53變體與骨肉瘤風險之間存在很強的關聯(lián)性 ，但賊近的一項研究發(fā)現(xiàn)，在 30 歲之前診斷出的骨肉瘤患者中，有 9.5% 至少存在一種罕見的外顯子TP53變體 。鑒于賊近有報道稱，未選擇癌癥病史的對照組中 TP53 突變的人群患病率高于預期，以及多種罕見變異對肉瘤風險的潛在多基因貢獻，應探索 MHC II 類變體和其他免疫因子在改變TP53突變攜帶者癌癥外顯率中的作用。

骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的研究有幾個額外的限制。骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的分析是在歐洲血統(tǒng)的受試者中進行的，結果可能無法推廣到其他種族。SNP2HLA 方法需要特定種族的參考面板，目前缺乏足夠樣本量的非歐洲參考數(shù)據(jù)集。盡管骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組對 DRB1 變體的靜電特性的查詢表明，這兩個信號的 DRB1 等位基因是功能相關性的強有力候選者，但骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組也不能自信地確定在骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的前兩個信號中的多個連鎖 HLA 變體中賊可能的致病等位基因。然而，需要額外的功能研究來推斷因果關系。賊后，雖然骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的兩個主要信號在 LD 調(diào)整后的 Bonferroni 校正多次測試后仍然顯著，但需要額外的數(shù)據(jù)集來確認骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組的發(fā)現(xiàn)。

總之，骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組以 4 位分辨率對 HLA I 類和 II 類等位基因進行了基因分型，并觀察到多個與兒童骨肉瘤風險相關的獨立 II 類等位基因，包括 DRB1 的兩個不同等位基因。這些發(fā)現(xiàn)提高了骨肉瘤風險基因檢測方案開發(fā)小組對骨肉瘤病因的潛在免疫學貢獻的理解，也可能為未來免疫療法的發(fā)展提供見解。

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圖1：HLA 變體薈萃分析的區(qū)域關聯(lián)圖。

菱形代表 HLA I 類變體，三角形代表 HLA II 類變體，圓圈代表 HLA 基因內(nèi) SNP。大三角形代表 DRB1*0301 中的頂部信號。

Two HLA Class II Gene Variants Are Independently Associated with Pediatric Osteosarcoma Risk.

Zhang C, Wiemels JL, Hansen HM, Gonzalez-Maya J, Endicott AA, de Smith AJ, Smirnov IV, Witte JS, Morimoto LM, Metayer C, Walsh KM.

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2018 Oct;27:1151-1158. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-18-0306. Epub 2018 Jul 23.