【佳學(xué)基因檢測(cè)】NANA貯積病基因檢測(cè)

 

NANA貯積病基因檢測(cè)患者介紹

2020年12月，一個(gè)來(lái)自河北的男孩，在兒科遺傳病專(zhuān)家會(huì)診的建議下，來(lái)到佳學(xué)基因進(jìn)行咨詢。這個(gè)男孩是一對(duì)經(jīng)過(guò)親緣關(guān)系基因檢測(cè)后確定沒(méi)有血親的父母所生的第一個(gè)孩子。除了母親在懷孕第 7 個(gè)月期間描述說(shuō)存在暫時(shí)性胎動(dòng)減少外，懷孕期間平安無(wú)事。男嬰孕37周后出生，出生體重2630克，身長(zhǎng)49厘米，頭圍32厘米。 Apgar 評(píng)分為 10-10-10，圍產(chǎn)期無(wú)并發(fā)癥。由于雙側(cè)內(nèi)斜視，這名男孩在 9 個(gè)月大時(shí)新穎入院。然后他還被發(fā)現(xiàn)患有遠(yuǎn)視（+7-8）。定期眼科檢查未發(fā)現(xiàn)其他變化。由于精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩，他在 13 個(gè)月大時(shí)再次入院。他可以坐著，用他的整只手抓住并在它們之間移動(dòng)，并用兩個(gè)音節(jié)喋喋不休，對(duì)應(yīng)于大約 6-7 個(gè)月的發(fā)育年齡。肌張力和腱反射正常。他在 3 歲左右學(xué)會(huì)了說(shuō)幾句話和獨(dú)立行走。他的溝通能力在 5 歲時(shí)達(dá)到頂峰，當(dāng)時(shí)他可以組合 2-3 個(gè)單詞，而他的最佳運(yùn)動(dòng)功能是在 9 歲時(shí)，當(dāng)時(shí)他可以在沒(méi)有支撐的情況下上下坡。從那以后，他慢慢失去了發(fā)育技能，變得越來(lái)越僵硬。左旋多巴治療試驗(yàn)沒(méi)有效果。由于吞咽困難，他在 11 歲時(shí)接受了有效性胃造口術(shù)，盡管他仍然能夠自己吃小塊食物。在 16 歲的最后一次評(píng)估中，他是一個(gè)非?？鞓?lè)和隨和的年輕人，能夠通過(guò)手勢(shì)、聲音、指點(diǎn)和大約 30 個(gè)手勢(shì)和幾句話進(jìn)行交流。他能夠在支持下行走約 100 米，并且具有相對(duì)良好的雙側(cè)鉗抓精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能。檢查時(shí)，他的肌張力普遍增加，被認(rèn)為是痙攣和強(qiáng)直的混合體，伴有大關(guān)節(jié)攣縮和右側(cè)脊柱側(cè)凸。肌腱反射通常隨著左側(cè)踝陣攣和右側(cè) Babinski 征而增強(qiáng)。沒(méi)有不自主運(yùn)動(dòng)或共濟(jì)失調(diào)跡象。他沒(méi)有癲癇發(fā)作，腦電圖也正常。頭圍和身高一直正常，沒(méi)有其他器官受累的跡象。包括代謝篩查分析在內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查是正常的。在 8 歲時(shí)對(duì)大腦進(jìn)行了 3 T MRI，顯示出髓鞘形成不足和胼胝體變薄的輕度特征（圖 1）。鑒于不尋常的表型，對(duì) SLC17A5 功能的進(jìn)一步分析表明是由尿液和成纖維細(xì)胞中游離唾液酸的升高驅(qū)動(dòng)的。 軸位 T2 序列顯示幕上中央白質(zhì) (a) 的 T2 信號(hào)略有增加，而小腦白質(zhì)看起來(lái)正常 (b)。 軸位 T1 加權(quán)成像顯示幕上白質(zhì)信號(hào)正常（c）。 矢狀位 T2 加權(quán)成像顯示胼胝體有點(diǎn)薄，松果體有一個(gè)小囊腫（1.2 厘米）(d)
 

NANA貯積病基因檢測(cè)患者的生化分析樣本

根據(jù)常規(guī)程序獲得皮膚成纖維細(xì)胞，并在補(bǔ)充有 10% 胎牛血清和 1% PEST 的 Eagle 最低限度必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)胰蛋白酶消化收集匯合的細(xì)胞并儲(chǔ)存在-20℃直至分析。
尿液樣本作為早晨等分試樣收集并儲(chǔ)存在-20°C直至分析。
 

NANA貯積病基因檢測(cè)患者的唾液酸分析

將成纖維細(xì)胞懸浮在水中并使用玻璃/聚四氟乙烯勻漿器勻漿。添加氯化鈉至終濃度為 0.15 M 后，將細(xì)胞在 +4 °C 下以 20 000xg 離心 30 分鐘，收集上清液用于測(cè)定游離唾液酸。細(xì)胞蛋白濃度通過(guò) BCA 方法（Pierce 實(shí)驗(yàn)室）測(cè)定。通過(guò)薄層色譜分析尿液中的游離唾液酸。板在 1-丁醇/乙酸/水（2:1:1 體積比）中顯影，并用間苯二酚試劑顯影。在用 0.05 M 硫酸水解并用離子交換色譜純化后，使用間苯二酚法測(cè)定尿液中的總（游離和結(jié)合）唾液酸。尿液和成纖維細(xì)胞中的游離唾液酸在離子交換色譜純化后，根據(jù) Aminoff [10] 的硫代巴比妥酸法進(jìn)行分析。
 

NANA貯積病基因檢測(cè)患者基因檢測(cè)中的SLC17A5的Sanger測(cè)序

使用 ABI 3730XL 自動(dòng)測(cè)序儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）通過(guò) Sanger 測(cè)序?qū)?SLC17A5 的所有編碼外顯子（包括外顯子前后的 30 個(gè)核苷酸）進(jìn)行突變分析。使用 SeqPilot 軟件（版本 4.2.1 build 506；JSI medical systems GmbH，Ettenheim，德國(guó)）分析數(shù)據(jù)。
 

NANA貯積病基因檢測(cè)患者的全外顯子組測(cè)序基因檢測(cè)

鑒于唾液酸的輕度升高和 SLC17A5 編碼外顯子的初始 Sanger 測(cè)序結(jié)果，懷疑是一種新的先天性代謝錯(cuò)誤，因此通過(guò)神經(jīng)科致病基因鑒定基因解碼項(xiàng)目進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序（WES） H12-00067）。使用 Agilent SureSelect 試劑盒和 Illumina HiSeq 2000（Perkin-Elmer，美國(guó)）對(duì)患者及其未受影響的父母進(jìn)行了 WES基因解碼基因檢測(cè)。使用佳學(xué)基因的半自動(dòng)生物信息學(xué)分析方案分析數(shù)據(jù)。簡(jiǎn)而言之，將測(cè)序讀數(shù)與人類(lèi)參考基因組版本 hg19 進(jìn)行比對(duì)，并鑒定和評(píng)估稀有變異體破壞蛋白質(zhì)功能的潛力，隨后在一系列遺傳模型下進(jìn)行篩選：純合子、半合子、復(fù)合雜合子和新發(fā)突變。
 

NANA貯積病基因檢測(cè)患者的SLC17A5 RNA/cDNA 檢測(cè)

使用 AllPrep DNA/RNA Mini 試劑盒 (Qiagen) 從培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中提取總 RNA。 RT-PCR 使用一步式 RT-PCR 試劑盒 (Qiagen) 進(jìn)行，正向引物 5'-TATTCCTGGTAGCTGCTGGC-3' 和反向引物 5'-TCTGGCAACTAGTGATATTTCATGA-3' 預(yù)測(cè)擴(kuò)增長(zhǎng)度為 517 bp 的產(chǎn)物 NM_012434.4; SLC17A5 cDNA (c.1130 – c.1646)。
 
PCR 產(chǎn)物在用 GelStar® 染色的瓊脂糖凝膠上分離，并在 Dark Reader 藍(lán)光透照儀上顯現(xiàn)。使用 ABI PRISM® 3100 基因檢測(cè)儀和 BigDye Terminator v.1.1 循環(huán)測(cè)序試劑盒（Applied Biosystems）進(jìn)行測(cè)序分析檢測(cè)。
 
NANA貯積病基因檢測(cè)患者的基因組 DNA 的 PCR 和 Sanger 測(cè)序
使用 SLC17A5 DNA 參考序列（Ensembl 基因 ID ENST00000355773）設(shè)計(jì)引物。使用跨越可疑插入位置的引物進(jìn)行初始遠(yuǎn)程 PCR（正向引物：5' - CTT CTG GAT TTA GCA TCA ACC A - 3' 和反向引物：5' - AGT ATT CCT GGT AGC TGC TG – 3').所得 PCR 產(chǎn)物用作以下嵌套 PCR 的模板：
 
1）長(zhǎng)距離 PCR（正向引物：5' - CTT CTG GAT TTA GCA TCA ACC A - 3' 和反向引物：5' - CAA CTT CCT GCT TTA ATT ATT GTG – 3'）以確定所識(shí)別的位置和序列使用 Sanger 測(cè)序插入
2）基于 PCR 的測(cè)定，使用插入外的兩個(gè)引物確認(rèn)插入的存在/不存在（正向引物：5' - CTT CTG GAT TTA GCA TCA ACC A - 3' 和反向引物：5' - CAA CTT CCT GCT TTA ATT ATT GTG – 3') 和位于插入內(nèi)部的第三個(gè)引物（正向引物：5' - AAT ATT CGG GTG GGA GTG AC – 3'）。
使用 BigDye® Terminator v3.1 循環(huán)測(cè)序化學(xué)（Life Technologies）進(jìn)行 Sanger 測(cè)序，隨后使用 Prism 3130xl 16 毛細(xì)管自動(dòng)遺傳分析儀（Applied Biosystems）通過(guò) CMMT/CFRI DNA 測(cè)序核心設(shè)施進(jìn)行毛細(xì)管電泳。使用 (i) RepeatMasker [12] 和 (ii) NetGene2 [13] 和替代剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)器 (ASSP) [14] 進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析以確定轉(zhuǎn)座子的類(lèi)別和對(duì)剪接的影響。
 

NANA貯積病基因檢測(cè)結(jié)果——唾液酸

在患者 11 歲時(shí)進(jìn)行了兩次唾液酸（總和游離）分析（表 1)。雖然尿液中的總唾液酸接近正常，但薄層色譜顯示異常模式，含有大量游離唾液酸。隨后的定量分析顯示尿液和成纖維細(xì)胞中的游離唾液酸含量升高（表1).

表1：尿液和成纖維細(xì)胞中的唾液酸

分析物	樣品 1	樣品 2	普通范圍
唾液酸（總計(jì)）——尿 nmol/mol 肌酐	68	69	31–69
唾液酸（游離）尿液 nmol/mol 肌酐	60	57	7–21
唾液酸（游離）成纖維細(xì)胞 nmol/mg 蛋白質(zhì)	16	-	<1,3

NANA貯積病基因檢測(cè)結(jié)果——SLC17A5編碼區(qū)的 Sanger 測(cè)序

在為節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用而在其他機(jī)構(gòu)進(jìn)行的SLC17A5基因檢測(cè)時(shí)，對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行了 Sanger 測(cè)序，沒(méi)有找到任何致病基因突變，此時(shí)，也沒(méi)有對(duì)外顯子 9 進(jìn)行測(cè)序。

NANA貯積病基因檢測(cè)結(jié)果——全外顯子組測(cè)序

使用佳學(xué)基因致病基因鑒定基因解碼生物信息學(xué)方法時(shí)，確定了 20 個(gè)受罕見(jiàn)變異影響的候選基因，這些變異預(yù)計(jì)會(huì)影響蛋白質(zhì)功能并根據(jù)孟德?tīng)栠z傳模型進(jìn)行分離。根據(jù)遺傳模式，這些可分為：純合子（SPTY2D1、LRP2和ERCC5）、半合子（FLNA、ZNF275、GRIPAP1、AMER1、PLXNB3、TAS2R43、ARSH、MAGEA11和NLGN4X）、復(fù)合雜合子（PLXND1、NHSL1、COBL、PIEZO1、NUP153和MYH7B）和新發(fā)突變（TCTE1和PUSL1）。然而，這些候選基因中沒(méi)有一個(gè)可以合理地假設(shè)導(dǎo)致該指數(shù)的生化和臨床表型。有趣的是，除此之外，WES 分析還揭示了在SLC17A5的內(nèi)含子 9 中存在指示大小和來(lái)源未知的純合子錯(cuò)配簇的存在，斷點(diǎn)之一位于距內(nèi)含子/外顯子邊界 24 bp 處。鑒于先前描述的SLC17A5中的 Salla 致病變異譜并且外顯子 9 無(wú)法通過(guò) Sanger 測(cè)序擴(kuò)增，因此基因解碼分析該插入突變是最佳候選位點(diǎn)并被進(jìn)一步分析。

NANA貯積病基因檢測(cè)結(jié)果——SLC17A5 RNA/cDNA 分析

來(lái)自培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞的SLC17A5 cDNA的 RT-PCR ，跨越 cDNA c.1130 – c.1646，隨后進(jìn)行凝膠電泳，揭示了三種產(chǎn)物，而不是患者中預(yù)期的 517 bp 單一轉(zhuǎn)錄本，但對(duì)照受試者中沒(méi)有（圖 2A). 一個(gè)附加片段約為 620 bp，另一個(gè)約為 1000 bp。所有三個(gè)條帶均被切下并通過(guò) Sanger 測(cè)序進(jìn)行測(cè)序。620 bp 片段的測(cè)序分析顯示插入長(zhǎng)度為 106 bp，其中前 24 bp 對(duì)應(yīng)于緊鄰?fù)怙@子 9 剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子序列，隨后是對(duì)應(yīng)于先前描述的位置 6033-5952 的 82 bp 序列轉(zhuǎn)座因子KF425758.1 （圖 2b). 由于噪音和背景太多，來(lái)自 > 1000 bp 產(chǎn)品分析的測(cè)序數(shù)據(jù)不可讀。517 bp 的產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于患者和對(duì)照（未顯示）的參考序列NM_012434.4。

 
 
圖 2:基因檢測(cè)分析。從培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中提取 RNA ，RT-PCR 隨后對(duì)跨越SLC17A5基因中 cDNA 位置 c.1130 – c.1646 的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，顯示除了患者預(yù)期的 517 bp 片段之外還有兩個(gè)異常大小的額外片段。對(duì)照樣本 ( a )中不存在異常轉(zhuǎn)錄本。620 bp 片段的直接測(cè)序顯示長(zhǎng)度為 106 bp 的明顯純合插入，其中前 24 bp 對(duì)應(yīng)于緊鄰?fù)怙@子 9 剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子序列，隨后是對(duì)應(yīng)于 6033-5952 位點(diǎn)的 82 bp 序列轉(zhuǎn)座因子KF425758.1 ( b )

NANA貯積病基因檢測(cè)結(jié)果——基因組 DNA 的 PCR 和 Sanger 測(cè)序基因檢測(cè)

隨后對(duì)通過(guò)外顯子組測(cè)序和 RNA/cDNA 分析鑒定的區(qū)域進(jìn)行 Sanger 測(cè)序，證實(shí)存在 6040 bp 插入，該插入位于SLC17A5的內(nèi)含子 9 （外顯子 9 下游 24 bp）（圖 3a). RepeatMasker 分析顯示該插入是一個(gè)長(zhǎng)散布元素 1 (LINE-1, L1) 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。正如基于外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)和 RT-PCR 分析所預(yù)期的那樣，該插入是純合的，而未受影響的父母是雜合的（圖  3b).

 
 
圖 3：這個(gè) ~6 kb 片段的測(cè)序證實(shí)了 6040 bp LINE-1 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的存在，它被插入到內(nèi)含子 9 ( a ) 中。PCR 分析證實(shí)未受影響的父母對(duì)于此插入是雜合的，而患者是純合的 ( b )
除了位于外顯子-內(nèi)含子邊界的預(yù)測(cè)剪接位點(diǎn)之外，使用 NetGene2 進(jìn)行的剪接位點(diǎn)分析還揭示了插入 82 bp 處的另一個(gè)預(yù)測(cè)剪接位點(diǎn)，而 ASSP 分析確定了插入 679 bp 處的第三個(gè)預(yù)測(cè)剪接位點(diǎn)（圖. 4a). 由三個(gè)預(yù)測(cè)的剪接位點(diǎn)創(chuàng)建的轉(zhuǎn)錄本將擴(kuò)增一個(gè) 517 bp 片段（野生型）、一個(gè) 623 bp 片段和一個(gè) 1220 bp 片段，與 cDNA 分析一致。來(lái)自這兩個(gè)交替剪接位點(diǎn)的產(chǎn)物導(dǎo)致移碼，導(dǎo)致提前終止密碼子 4 bp 進(jìn)入內(nèi)含子 9。在翻譯異常轉(zhuǎn)錄本的情況下，提前終止將在氨基酸 421（圖  4b)。
 
圖 4：使用 NetGene2 和 ASSP 進(jìn)行的剪接位點(diǎn)分析表明，在存在插入的情況下，除了出現(xiàn)在外顯子內(nèi)含子邊界的正確剪接位點(diǎn)之外，插入中還存在另外兩個(gè)剪接位點(diǎn) ( a )。這些交替剪接事件導(dǎo)致移碼突變，從而導(dǎo)致氨基酸 421 處的過(guò)早終止密碼子，如箭頭 ( b ) 所示?；疑幱氨硎就僖核岬鞍椎?12 個(gè)跨膜區(qū)域
對(duì) 1000 基因組計(jì)劃/Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)構(gòu)變異的查詢沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在健康個(gè)體中存在這種基因檢測(cè)突變。

溶酶體游離唾液酸貯積癥具有廣泛的臨床表現(xiàn)。Salla病代表最溫和的表型，在芬蘭和瑞典和丹麥等其他北歐國(guó)家最常發(fā)生。嬰兒型唾液酸貯積病表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床表型，并且沒(méi)有地域差異。還存在嚴(yán)重程度介于 Salla 和嬰兒唾液酸貯積病ISSD 之間的 SASD 形式. Salla 患者通常在出生后第一年出現(xiàn)肌張力減退、共濟(jì)失調(diào)和眼球震顫，而NANA貯積病基因檢測(cè)患者在 3 歲時(shí)表現(xiàn)出精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育延遲和遠(yuǎn)視。隨著 Salla 疾病的進(jìn)展，共濟(jì)失調(diào)通常仍然是一個(gè)突出的特征，但在本病例中并未發(fā)生共濟(jì)失調(diào)。相反，NANA貯積病基因檢測(cè)患者在的患者表現(xiàn)出肌張力增加，很可能是由于痙攣和強(qiáng)直的混合。與 Salla 病重疊的唯一臨床癥狀實(shí)際上是早期精神運(yùn)動(dòng)遲緩和言語(yǔ)問(wèn)題，這本身并不是疾病特有的。MRI 結(jié)果進(jìn)一步支持較輕的臨床表型，具有髓鞘發(fā)育不良和胼胝體變薄的弱特征，而 Salla 患者的典型表現(xiàn)是大腦和小腦萎縮、髓鞘發(fā)育不良和胼胝體發(fā)育不全。因此，本文描述NANA貯積病基因檢測(cè)患者在的患者表現(xiàn)出比 Salla 病更輕微的唾液酸貯積病SASD臨床表型，這使得正確診斷變得困難。NANA貯積病基因檢測(cè)患者的研究結(jié)果表明，對(duì)于腦病和輕度髓鞘形成不足和胼胝體變薄的患者，需要考慮對(duì)游離唾液酸進(jìn)行分析。
游離尿唾液酸升高被認(rèn)為是唾液酸貯積病SASD的生化標(biāo)志，早在 3 日齡時(shí)就已觀察到. 因此，這些患者的總尿唾液酸（游離和結(jié)合）水平升高，并且該部分的比色測(cè)量通常用作唾液酸貯積病SASD和其他儲(chǔ)存唾液酸化寡糖的溶酶體疾病的第一個(gè)篩選生物標(biāo)志物。根據(jù)NANA貯積病基因檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)，絕大多數(shù)唾液酸貯積病SASD患者尿液中總唾液酸增加。然而，這里描述的患者在兩個(gè)單獨(dú)的采樣檢測(cè)顯示總唾液酸濃度處于臨界點(diǎn)。作為對(duì)定量測(cè)定的補(bǔ)充，尿樣中的寡糖篩查通常通過(guò)薄層色譜法進(jìn)行，在這種情況下，這表明游離唾液酸水平升高。這通過(guò)尿液和成纖維細(xì)胞中游離唾液酸的定量測(cè)量得到證實(shí)。這些結(jié)果進(jìn)一步突出了使用尿寡糖定性分析結(jié)合總唾液酸定量分析的重要性?？朔@些問(wèn)題的另一種可能性是使用質(zhì)譜法并同時(shí)測(cè)量總唾液酸和游離唾液酸，這是佳學(xué)對(duì)這一疾病的臨床所建議的新標(biāo)準(zhǔn)，不久的將來(lái)將成為黃金標(biāo)準(zhǔn)。還應(yīng)提及的是，已在兩個(gè)沒(méi)有唾液尿癥的兄弟姐妹中報(bào)告了唾液酸貯積病SASD，他們都是 SLC17A5 中 Lys136Glu 突變的純合子。通過(guò) H-NMR 光譜法檢測(cè)到腦脊液中存在增加的游離唾液酸，這一發(fā)現(xiàn)與髓鞘形成不足提示唾液酸貯積病SASD。
鑒于NANA貯積病基因檢測(cè)患者患者的異常表型，對(duì)SLC17A5的進(jìn)一步研究是由尿液和成纖維細(xì)胞中游離唾液酸的升高驅(qū)動(dòng)的。在新穎尋找致病變異的基因檢測(cè)中，對(duì)SLC17A5的編碼區(qū)進(jìn)行了 Sanger 測(cè)序，除了無(wú)法擴(kuò)增的外顯子 9 外，所有外顯子的結(jié)果均為陰性。因此，通過(guò)將家族納入神經(jīng)科致病基因鑒定基因檢測(cè)基因發(fā)現(xiàn)研究，使用非靶向診斷方法找出唾液酸貯積病SASD生物標(biāo)志物升高的原因。WES 分析確定了 20 個(gè)受罕見(jiàn)變異影響的候選基因，這些變異預(yù)計(jì)會(huì)影響蛋白質(zhì)功能，但這些變異中沒(méi)有一個(gè)被認(rèn)為可以很好地解釋患者觀察到的表型。有趣的是，仔細(xì)觀察SLC17A5基因，WES 基因檢測(cè)分析顯示內(nèi)含子 9 中存在未知大小或來(lái)源的純合插入。RT-PCR 和 Sanger 重測(cè)序基因檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)存在 6040 bp 插入（RefSeq KF425758.1），它位于SLC17A5的內(nèi)含子 9 （外顯子 9 下游 24 bp），并顯示該插入是 LINE-1 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。內(nèi)含子 9 中大片段插入的存在可能解釋了通過(guò)初始 Sanger 測(cè)序無(wú)法擴(kuò)增外顯子 9 的問(wèn)題。這種大的轉(zhuǎn)座子插入先前已在SLC25A13中描述，導(dǎo)致 citrin 缺乏. 此外，導(dǎo)致基因組缺失的 L1 元件的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座插入已被證明會(huì)導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶復(fù)合物缺乏。
通過(guò)捕獲蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行基因檢測(cè)，全外顯子組測(cè)序基因檢測(cè)僅分析人類(lèi)基因組的一小部分（~1%），這種方法的缺點(diǎn)之一是“致病”變異可能位于捕獲區(qū)域之外，例如遺漏外顯子區(qū)域、深層內(nèi)含子變異、調(diào)控元件或基因組的其他非編碼區(qū)域。此外，WES 基因檢測(cè)不是檢測(cè)較大變異的最佳選擇，例如拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異。使用全基因組測(cè)序 (WGS) 基因檢測(cè)代替 WES基因檢測(cè) 可以克服這些問(wèn)題，因?yàn)?WGS 基因檢測(cè)指的是對(duì)整個(gè)人類(lèi)基因組的分析。在佳學(xué)基因的患者中，轉(zhuǎn)座子插入相對(duì)靠近外顯子-內(nèi)含子邊界（在 24 bp 以內(nèi)），神經(jīng)科系統(tǒng)致病基因鑒定基因解碼能夠使用 WES 基因檢測(cè)檢測(cè)到它，強(qiáng)調(diào)了對(duì) NGS 數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析和解釋以及進(jìn)一步基因解碼分析的重要性分析以驗(yàn)證使用 NGS 數(shù)據(jù)在疑似遺傳疾病和持續(xù)存在的獨(dú)特生化表型患者中發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)。
通過(guò)計(jì)算機(jī)分析研究了患者中這種純合子插入的可能后果。這些分析預(yù)測(cè)，除了外顯子 9 和內(nèi)含子 9 之間的正常剪接位點(diǎn)之外，該序列 24 bp 插入內(nèi)含子 9 會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)剪接位點(diǎn)，出現(xiàn)在插入序列的 82 bp 和 679 bp 處。cDNA 基因檢測(cè)分析證實(shí)存在患者中的三個(gè)SLC17A5轉(zhuǎn)錄本為該區(qū)域所有三個(gè)剪接位點(diǎn)的存在提供支持。在計(jì)算機(jī)中由交替剪接位點(diǎn)產(chǎn)生的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的翻譯預(yù)示著提前終止密碼子 4 bp 進(jìn)入內(nèi)含子 9 并在氨基酸 421 處被截短。唾液酸蛋白由 12 個(gè)跨膜區(qū)域組成，在神經(jīng)系統(tǒng)致病基因鑒定基因解碼的患者中發(fā)現(xiàn)的基因突變應(yīng)該導(dǎo)致兩個(gè)缺失蛋白質(zhì)羧基末端的跨膜結(jié)構(gòu)域。
先前在SLC17A5 發(fā)現(xiàn)的 32 個(gè)突變顯示出廣泛的范圍（錯(cuò)義和無(wú)義突變、剪接位點(diǎn)突變、插入和缺失），但是SLC17A5基因檢測(cè)并沒(méi)有提出直接的突變熱點(diǎn)。在唾液酸貯積病SASD中觀察到的表型變異似乎在某種程度上與 Arg39Cys 突變的存在相關(guān)，與復(fù)合雜合子患者中發(fā)現(xiàn)的其他突變相比，該變異似乎導(dǎo)致唾液酸蛋白功能得到更好的保留。因此，其他SLC17A5對(duì)唾液酸蛋白功能具有更多破壞性影響的基因突變被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致 嬰兒唾液酸貯積病ISSD。然而，其他基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)這一假設(shè)提出了質(zhì)疑。例如，已發(fā)現(xiàn) Lys136Glu 基因檢測(cè)突變的純合性會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的 Salla 病和輕度唾液酸貯積病SASD表型?；蚪獯a分析報(bào)告了具有相同純合錯(cuò)義突變的單一近交系受影響患者的唾液酸貯積病SASD表型變異性。這些發(fā)現(xiàn)表明SLC17A5中的多態(tài)性或其他參與游離唾液酸代謝的基因可能是同一基因檢測(cè)突變而產(chǎn)生不同的臨床癥狀的原因。《神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其基因序列變化》已記錄到導(dǎo)致外顯子 10 和 11 缺失的突變會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果，這與NANA貯積病基因檢測(cè)案例 中的患者較溫和的表型形成對(duì)比。此處討論的案例對(duì)所觀察到的較溫和的表型提出了有趣的解釋?zhuān)M管可以假定外顯子 10 和 11 無(wú)法翻譯。因此，神經(jīng)系統(tǒng)致病基因鑒定基因解碼提出以下解釋?zhuān)涸贜ANA貯積病基因檢測(cè)的案例的患者中，除了導(dǎo)致異常轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)新剪接位點(diǎn)之外，基因檢測(cè)確實(shí)確定了正常轉(zhuǎn)錄本，這是保留正常剪接位點(diǎn)的結(jié)果。低水平野生型蛋白的存在可能提供一些運(yùn)輸唾液酸的能力，盡管不足以保持患者健康。
 

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