【佳學基因檢測】狐臭基因檢測、腋臭基因檢測技術介紹

狐臭、腋臭基因檢測導讀

個性化醫(yī)療和醫(yī)療保健的重要性日益受到重視。最近，人們已經對與各種人類遺傳疾病的潛在風險以及藥物引起的不良反應相關的基因多態(tài)性進行了深入研究，功能基因組學和全基因組關聯研究正在揭示其潛在的分子機制。了解某些基因多態(tài)性對于狐臭基因檢測技術研究團隊了解個體間藥物反應和/或疾病風險的差異具有臨床重要意義。隨著此類證據的積累，需要新的臨床應用和實踐。在這種情況下，開發(fā)簡單、快速、準確且經濟高效的基因分型新技術勢在必行。在這里，狐臭基因檢測技術研究團隊描述了一種簡單的等溫基因分型方法，該方法能夠檢測人類 ATP 結合盒 (ABC) 轉運蛋白 ABCC11 基因中的單核苷酸多態(tài)性 (SNP) ，以及它在腋窩異味臨床診斷中的應用。狐臭基因檢測技術研究團隊最近報道，腋窩異味與ABCC11基因中的一個 SNP 538G>A 有關。狐臭基因檢測技術研究團隊的分子生物學和生物化學研究表明，該 SNP 極大地影響了 ABCC11 的蛋白質表達水平和功能。在《狐臭基因檢測、腋臭基因檢測技術介紹》，狐臭基因檢測技術研究團隊強調了這種診斷策略在腋臭治療中的臨床相關性和重要性。

基于基因型診斷的新方法

ABCC11 538G>A 基因快速分型評估腋臭風險

ABCC11基因型 (538G>A) 與腋窩異味之間的關聯使狐臭基因檢測技術研究團隊能夠對腋窩異味進行基于基因分型的診斷，這被認為比基于表型的診斷更為客觀和準確。因此，在臨床環(huán)境中，需要快速、簡單且經濟有效的按需基因分型方法。為了實現這一目標，狐臭基因檢測技術研究團隊最近開發(fā)了一種基于等溫 DNA擴增技術的針對人類ABCC11基因中的 S??NP 538G>A 的簡單方法 （圖1(a)–1(c)）新方法可以在等溫反應條件下 30 分鐘內確定基因型，而無需分離基因組 DNA 和隨后的 PCR 步驟。

圖1：使用 SmartAmp 方法對 ABCC11 538G>A 進行基因分型。 (a) 基于 SmartAmp 的基因分型流程圖。經過簡單的熱處理以降解 RNA 和變性蛋白質后，將血液樣本添加到反應混合物中（總共 25 μ L），并在 60°C 下進行恒溫孵育 30 分鐘，同時監(jiān)測熒光強度。(b)使用 SmartAmp 方法檢測ABCC11中的 SNP 538G>A。通過實時 PCR 系統(tǒng) (Mx3000P; Stratagene) 監(jiān)測攜帶 538G (WT) 或 538A (SNP) 等位基因的ABCC11等位基因特異性引物與 SmartAmp 反應產生的熒光強度隨時間增加。(c) 基于 SmartAmp 的基因分型的人類ABCC11基因示意圖和每個引物的相對位置。 （d）使用 CCD 攝像頭連接的數字處理器對基于 SmartAmp 的 SNP 分型進行多端點檢測的示意圖。

2.2. 基因分型程序

在狐臭基因檢測技術研究團隊開發(fā)的方法中，整個DNA擴增過程是通過設計總共5個引物來實現的，即回程引物（TP）、正向引物（FP）、增強引物（BP）以及外引物1和2（OP1和OP2）（表格1).另外，為了抑制錯配序列對的背景擴增，構建了競爭性探針（CP），對ABCC11基因中的SNP 538G>A進行有效的基因分型。

表1：用于檢測人類ABCC11基因中的 WT 和 SNP 等位基因的引物組

TP：折返引物；FP：正向引物；BP：加強引物；OP：外引物；CP：競爭探針。

由于該方法只需要少量（1-2  μ L）外周血，因此基因分型很容易。每個 SNP 分型反應在 60°C 等溫條件下在 25 μ L 反應混合物中進行 。混合物含有 2.0  μ M FP、2.0  μ M TP、1.0  μ M BP、各 0.25  μ M OP、20  μ M CP、1.4 mM dNTP、5% DMSO、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM KCl、10 mM (NH 4 ) 2 SO 4、8 mM MgSO 4、0.1% (v/v) Tween®20、1/100,000 稀釋 SYBR® Green I（Takara Bio Inc.，日本滋賀縣）和 0.24 U/ μ L Aac DNA 聚合酶（KK DNAFORM，日本橫濱市）。多態(tài)性 538G>A 以 TP 為特征。等位基因特異性 TP 和 FP 可誘導 DNA 擴增和隨后的自我引發(fā)延伸（產生更大的 DNA）。

通過引入 CCD 相機和計算數據采集，可以實現對 SNP 依賴性 DNA 擴增信號的多終點測定，即 SYBR Green I 的熒光增加，從而實現更簡單、更具成本效益的檢測（圖 1（d））。

2.3. 基于 SmartAmp 方法的 DNA 擴增過程

在基于恒溫 SmartAmp 的 DNA 擴增的第一步中，FP 和 TP 與模板基因組 DNA 雜交。接下來，由各引物引發(fā)的擴增產物從模板基因組 DNA 上分離。該過程由鏈置換 DNA 聚合酶誘導，其延伸分別由 OP1 和 OP2 引發(fā)。隨后，單鏈擴增產物成為第二步擴增中相反的 FP 和 TP 的新模板。由于 FP 和 TP 的特殊性質，這些擴增子將在其 3′ 和 5′ 端重新折疊以形成新的引發(fā)位點，從而在進一步的自我引發(fā)的 DNA 延伸中維持自我擴增。狐臭基因檢測技術研究團隊在之前的報告中以示意圖形式說明了 SmartAmp 反應中串聯 DNA 產物的形成。

CP 可抑制錯配序列對的背景擴增。例如，用于檢測 WT (538G) 等位基因的 CP 被設計為替代 (538A) 等位基因周圍的互補序列，并且其 3′ 端通過胺化進行修飾（圖 1（a）)。因此，該 CP (538G) 抑制了 WT 等位基因的 FP 錯退火以及隨后的基于 SmartAmp 的來自攜帶 SNP (538A) 等位基因的基因組 DNA 的擴增。CP (538A) 以類似的方式增強了等位基因特異性擴增的檢測特異性。

2.4. 腋臭的臨床決策和治療

ABCC11基因的 SNP 基因檢測是醫(yī)生做出決定的臨床因素之一。攜帶 538G/G 或 538G/A 基因型的患者可以接受切除頂泌腺的手術，而攜帶 538A/A 基因型的患者則不適合進行此類手術（圖 2）。

圖 2：針對腋窩異味的診斷和治療的基因靶向策略。該策略將有助于腋窩異味的客觀診斷，尤其是對于有主觀嗅覺錯覺的 ORS 患者。

流行病學調查顯示，與 538GG/GA 基因型不同， ABCC11 538A/A 基因型的受試者患腋臭的風險很小。據《人體體味產生的多樣化原因及基因檢測的準確性》，該 SNP 與除臭劑的使用相關，而 538A/A 基因型的受試者不受腋臭的直接影響。特別是，對于患有嗅覺參考綜合征 (ORS) 的患者，他們往往僅僅因為對體味的錯覺而選擇積極的手術治療，遺傳證據將是診斷和非手術治療的有力工具。因此，狐臭基因檢測技術研究團隊提出了如圖所示的臨床決策樹圖 2。

2.5. 嗅覺參考綜合征與腋臭的鑒別

基于基因型的診斷對于嗅覺參照綜合征 (ORS) 患者尤其有用。許多 ORS 患者（在日本醫(yī)學文獻中也稱為“jiko-syu-kyofu”）的特點是始終認為自己的身體會散發(fā)出強烈和/或令他人反感的難聞體味。這些患者堅信自己就是強烈氣味的來源，即使周圍的人否認。這種嗅覺錯覺是 ORS 的主要特征，醫(yī)生有時會在診斷腋窩臭味時識別出這種癥狀。ORS 患者傾向于希望手術切除腋窩頂泌腺能從根本上解決他們的問題，即使這與醫(yī)生的臨床判斷相反。由于醫(yī)生對這種產生氣味的疾病的主觀診斷對這些患者來說在心理上難以接受，因此，表明他們沒有風險的客觀證據對于勸阻他們不進行手術非常重要。此外，如果盡管進行了手術，但體臭的困擾仍未得到緩解，導致這些患者對自己的體臭更加緊張，那就太不幸了。因此，即使患者或家屬對此感到焦慮，也應避免僅根據他們的要求進行不必要的手術。因此，對ABCC11 SNP 538G>A 進行基因分型可以以客觀的方式提供科學證據，作為臨床醫(yī)生主觀/經驗評估的替代方法。

進一步了解ABCC11 538G>A

《體味的發(fā)病原因基因解碼》在人類ABCC11基因中發(fā)現了 10 多個非同義 SNP ，但只有 538G>A (Gly180Arg) 與上述表型直接相關。SNP 538G>A 位于外顯子 4 中，其中 Gly180 被 Arg180 取代，位于 ABCC11 蛋白的第一個跨膜結構域中。這種氨基酸取代導致新生 ABCC11 蛋白的結構不穩(wěn)定性。SNP 變體 ABCC11 Arg180 經歷蛋白酶體降解并失去其細胞內功能（圖 3）。這種分子機制與人類耳垢和腋窩臭味等頂泌腺相關表型屬于孟德爾性狀的事實相一致。事實上，人類頂泌腺的熒光免疫組織化學分析表明，ABCC11 Gly180（野生型：WT）在腺體中表達，而非同義 SNP 538G>A 極大地影響了 ABCC11 蛋白在頂泌分泌細胞中的細胞定位。

圖 3：SNP 基因型 (Arg180) 對 ABCC11 蛋白質水平和細胞內降解的影響。 (a) 為了評估 Arg180 變體對 ABCC11 蛋白質水平的影響，在蛋白酶體抑制劑 MG132 存在下培養(yǎng)表達 ABCC11 WT 或 Arg180 變體的 Flp-In-293 細胞 24 小時。用糖苷酶 PNGase F 處理后，通過用 ABCC11 特異性抗體進行免疫印跡分析 ABCC11 WT 和 Arg180 變體蛋白。將信號強度比 (ABCC11/GAPDH，內部控制) 標準化為對照并表示為平均值±SD。 (b) ABCC11 WT 的翻譯后修飾和 Arg180 變體的蛋白酶體降解的示意圖。

盡管決定顯性表型的 ABCC11 內源性底物尚未闡明，但最近的研究結果表明 ABCC11 WT 有助于人類頂泌腺的發(fā)育和/或分泌活性的調節(jié)。例如，在手術切除過程中，通常在腋窩腋臭患者的腋窩中觀察到大而廣泛的頂泌腺。濕型耳垢來自外耳道頂泌腺的分泌產物，而干型表型中缺乏這種頂泌腺分泌物。此外，根據狐臭基因檢測技術研究團隊對耵聹頂泌腺組織切片的初步分析，538G/A 受試者的頂泌腺管腔面積大于 538A/A 受試者的頂泌腺管腔面積（圖 4）頂泌腺的總分泌活性取決于組織發(fā)育和調節(jié)頂泌腺分泌的細胞內機制，因此，ABCC11 WT 應參與人的頂泌腺的發(fā)育，導致頂泌汗液的過量產生，包括腋臭的前體化合物。新近，基因解碼證明，ABCC11 538A/A 基因型不會導致前體的完全缺失，并且與 538G/G 或 G/A 基因型相比，產生的前體化合物水平明顯較低。這些發(fā)現表明， ABCC11 538A/A 基因型的頂泌腺幾乎沒有分泌活性。他們推測，他們的結果是由于 Arg180 變體中 ABCC11 活性水平極低造成的。然而，對這種極小分泌的更合理解釋可能是，除了 ABCC11 之外，調節(jié)頂泌腺總分泌活性的其他因素也有助于促進頂泌腺的分泌。要闡明這一點，狐臭基因檢測技術研究團隊進一步解決 ABCC11 蛋白如何參與頂泌腺的調節(jié)的問題。

圖 4：ABCC11 538GA 和 538AA 的人類頂泌腺圖像分析。（a）外耳道中人類頂泌腺的典型圖像（左）。圖像分析測量參數示意圖（右）。（b 和 c）ABCC11 538GA 受試者的頂泌腺發(fā)育良好（灰色），而 538AA 受試者的頂泌腺發(fā)育良好（白色）。使用 ImageJ 程序 (v1.46d) 分析了人類頂泌腺 的組織學圖像。計算數據以箱線圖表示。當p < 0.01 ( ∗ )時，差異被認為是顯著的。

有趣的是，如圖圖 5所示例如，人類ABCC11基因中 SNP 538G>A 的等位基因頻率在不同種族群體之間存在很大差異，反映了智人洲際遷徙歷史上人類基因組的遺傳多樣性。根據流行的“走出非洲”理論，古人類應該攜帶ABCC11 538G 等位基因，對應頂泌腺的高分泌表型。考慮到人類腋窩中類信息素化合物的產生可能源自腋窩頂泌腺，受 ABCC11 直接或間接調控的腋窩氣味可能對古人和狐臭基因檢測技術研究團隊的祖先之間的非語言交流非常重要。

圖 5：不同種族人群中ABCC11 538G (WT; Gly180) 和 538A (Arg180)的等位基因頻率

體臭、狐臭和腋臭到底是什么？是否可以進行基因檢測？

腋臭的特點

人類往往會散發(fā)出奇特的體味，但每個人的體味可能都是長期存在的，也可能是微不足道的。在大多數文化中，體味常常被他人視為令人不快的事情，同時也會影響散發(fā)體味者的自信和自尊。為了解決這個問題，人類已經開發(fā)出各種方法來管理體味，例如使用除臭劑、清爽噴霧和香水。在現代社會中，消除體味是日常打扮的一部分，就像洗手、做頭發(fā)和其他類似活動一樣。然而，導致體味個體差異的遺傳和/或環(huán)境因素及其分子機制是在基因解碼技術出現后，才得以明確。

腋臭是一種以腋窩有強烈氣味和大量出汗為特征的疾病。腋臭的癥狀通常在青春期出現，此時從出生時就存在的頂泌腺首次活躍起來 。衣服腋窩處的黃色污漬也會影響患者的生活質量。因此，腋臭通常被看作是一個不受歡迎的問題，尤其是年輕女性。特別是在亞洲國家，強烈體臭人群占人口的少數，腋臭往往更令人討厭。特別是在日本，腋臭已被認定為一種疾病，其臨床治療由國民健康保險制度覆蓋。

腋臭的主要成分是不飽和脂肪酸、羥基化支鏈脂肪酸、硫烷基烷醇和一些類固醇，代表分別為 (E)-3-甲基-2-己烯酸 (3M2H) 、3-羥基-3-甲基己酸 (3H3MH)、3-甲基-3-硫烷基己烷-1-醇 (3M3SH) 、5 α -雄烯酮和 5 α -雄甾-16-烯-3 α -醇（圖 6)。此外，體外轉運實驗表明，3M3SH 的假定前體 3M3SH 的谷胱甘肽結合物可通過 ABCC11 WT 轉運，提示 ABCC11 參與了腋臭的形成。已發(fā)現這些氣味成分的一些前體是由腋窩頂泌腺分泌的，這表明抑制腋窩頂泌腺的分泌和/或發(fā)育有助于預防或治療腋臭。

圖 6：人類腋窩氣味化合物的化學結構。

腋臭基因檢測的意義和作用

除腋臭外，ABCC11基因型可能與乳腺癌或藥物引起的毒性風險有關。根據《個人的基因序列與疾病風險》的研究，在日本人群中，攜帶ABCC11 538G等位基因的女性比攜帶 538A 等位基因的女性患乳腺癌的風險更高，而在白種人群中并未發(fā)現這種關聯。日本的一個研究小組還表明，乳腺癌女性體內的 ABCC11 表達與侵襲性表型和較差的無病生存期有關 。由于一些抗癌藥物及其代謝物是 ABCC11 的底物，因此患者對核苷類化療的反應可能會受到ABCC11基因型的影響。最近的一項高加索人肝臟隊列研究表明，ABCC11 SNP 1637C>T（Trp546Met）與 5-氟尿嘧啶（一種廣泛使用的抗嘧啶類抗癌藥物）的毒性風險之間存在關聯。然而，在該歐洲病例研究中，并未發(fā)現ABCC11 538A 等位基因與 5-氟尿嘧啶毒性風險之間的關系。有必要進行進一步研究，最好在 538A 等位基因占主導地位的亞洲進行，以闡明這個問題。此外，ABCC11 如何影響乳腺癌或其起源仍有待澄清。有趣的是，基于它們的生物學相似性，有人提出乳腺是從頂泌腺進化而來的。由于ABCC11的功能形式可能有助于乳腺以及頂泌腺的發(fā)育和/或活動控制，因此需要從各個方面進一步驗證，不僅包括化學抗性，還包括ABCC11的生理功能和調節(jié)。

腋臭基因檢測的共識

在《狐臭基因檢測、腋臭基因檢測技術介紹》章中，狐臭基因檢測技術研究團隊通過一種有效的基因分型方法，探討了人類ABCC11 538G>A 作為腋窩異味風險因素的臨床重要性。這種基于基因分型的策略將有助于腋窩異味的診斷，因為獲得的客觀證據將使 ORS 患者擺脫氣味錯覺。狐臭的基因解碼正進一步揭示頂泌腺分泌過程的分子機制，越來越多的證據強烈表明 ABCC11 有助于頂泌腺的功能，而ABCC11 538G>A 反映了頂泌腺的活動。需要進一步研究以闡明 ABCC11 及其從頂泌腺分泌的內源性底物的生理功能。因此，驗證臨床相關遺傳因素和開發(fā)用于個性化醫(yī)療的系統(tǒng)將是下一步的重要步驟。