【佳學(xué)基因-基因檢測】核酸提取技術(shù)簡述(上)
核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),都是極性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。
細(xì)胞裂解
在核酸提取過程中,裂解細(xì)胞是非常重要的。經(jīng)典的試劑則是 SDS、EDTA和鹽 。鹽提供了一個合適的裂解環(huán)境 ,同時也抑制樣品中的核酸酶對核酸的破壞 、使核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。通過使蛋白質(zhì)變性,破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì),從而實現(xiàn)核酸游離出來。體系中加入蛋白酶K,是利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段,促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開,同時,也便于后面的純化操作以及獲得純度更高的核酸。
裂解細(xì)胞的方法有:機(jī)械方法(超聲波處理法、研磨法、勻漿法)、化學(xué)試劑法(SDS、CTAB、NaOH)、酶解法(溶菌酶或蝸牛酶、蛋白酶K)等。含蛋白酶的裂解方法,可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的優(yōu)選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小,故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用;同時,蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后,有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除,使賊終獲得的基因組 DNA 的純度更高。裂解液的用量應(yīng)盡力做到能有效裂解樣品,同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低,將導(dǎo)致沉淀效率低,影響得率;濃度過高,去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不有效,導(dǎo)致純度下降。
核酸純化
進(jìn)行核酸的純化時,苯酚/氯仿抽提是經(jīng)典的純化技術(shù),細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀。也可以使用離子交換介質(zhì)和吸附介質(zhì)。
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