加醇沉淀

用醇沉淀的目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì)–主要是鹽的分離。就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說(shuō)這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實(shí)際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達(dá)到一定水平后，單獨(dú)使用醇也可以使核酸沉淀下來(lái)；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來(lái)，這樣的話，得率可能會(huì)降低。當(dāng)碰到問(wèn)題，判斷其主要是純度原因時(shí)，有效可以通過(guò)調(diào)整沉淀?xiàng)l件來(lái)改善。
 

洗滌

洗滌原理與目的： 洗滌是非常重要的，首先一定要將沉淀懸浮起來(lái)；第二就是要控制一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(shí)；第三是少量多次；第四則是去上清要有效。對(duì)于質(zhì)量好的離心管，上清可以去除得非常有效，否則其殘留量多到會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。可以通過(guò)倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。

由于殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時(shí)去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會(huì)被揮發(fā)去除的。另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強(qiáng)，洗滌越要有效：放置時(shí)間相對(duì)要長(zhǎng)一點(diǎn)，洗滌次數(shù)也要考慮增加。當(dāng)然，乙醇濃度的選擇也非常重要，一般情況，洗滌要用室溫的 75% 乙醇。

核酸溶解與保存

       核酸溶解： DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，其中原因是有人認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來(lái)的 DNase 降解的風(fēng)險(xiǎn)。如果操作過(guò)程控制得當(dāng)，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，有效可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。

核酸保存：基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般在-20℃保存。如果溫度不合適，核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個(gè)原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導(dǎo)致的水解 ，RNA 在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適。
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