【佳學(xué)基因檢測】兒童缺乏維生素D做基因檢測正確嗎?

什么是維生素D缺乏癥？

根據(jù)《人體疾病及健康異常的基因解碼及遺傳性分析》，維生素D缺乏引起的健康問題被分為維生素D缺乏癥和生化性骨軟化癥。維生素D缺乏癥是指血液25OHD濃度<30 nmol/L（12µg/l），維生素D不足是指25OHD血液濃度為為30-50 nmol/L（12-20µg/l），維生素D充足是指血液濃度為>50 nmol/L（>20µg/l）。而25 nmol/L（10µg/l）是人體健康所需要的臨界水平。

生化性骨軟化癥是指維生素D缺乏癥結(jié)合堿性磷酸酶（ALP）升高和/或甲狀旁腺激素（PTH）升高。由于直到晚期階段才通過補(bǔ)償機(jī)制維持正常血鈣水平，因此未將其作為生化性骨軟化癥的必要條件。

維生素D缺乏癥的非基因檢測方法

在臨床上，可以采用定量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（AB Sciex API4000 MS/MS分析儀）測定血清25OHD濃度，也可以采用放射免疫測定法（Roche Cobas C6000）進(jìn)行測定。進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)測定的實(shí)驗(yàn)室接受國家臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心的質(zhì)量抽查與控制。兩種方法的批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）均小于10%。

血清堿性磷酸酶（ALP）活性采用基于染料的測定方法確定，該方法在182 Olympus AU640分析儀上，通過監(jiān)測在鎂存在下p-硝基苯基磷酸鹽水解為p-硝基苯酚的速率（在410/480 nm處）來測定酶活性。

采用Immulite 2000 PTH測定法（德國埃爾朗根的西門子醫(yī)療診斷產(chǎn)品）測定全段甲狀旁腺激素（PTH），這是一種固相、雙位點(diǎn)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附測定法。ALP和PTH的參考范圍是根據(jù)CALIPER參考范圍和基于制造商推薦的特定測定參考范圍綜合得出的。

維生素D缺乏癥的遺傳表現(xiàn)

家庭成員之間的微量營養(yǎng)素攝入量往往相似，并且有證據(jù)表明，父母尤其是母親的飲食不良與后代的飲食不良密切相關(guān)，這是遺傳性的一個常見證據(jù)。根據(jù)《維生素D缺乏癥的基因解碼》，后代的微量營養(yǎng)素缺乏癥受母親教育水平的強(qiáng)烈影響。同樣，補(bǔ)充劑的攝入，如兒童維生素D的攝入，也受到母親因素如年齡和教育程度的影響。年齡和教育程度是影響維生素D缺乏癥基因檢測接受度的重要因素，也是科學(xué)選擇基因檢測項(xiàng)目的重要因素。不同的基因檢測結(jié)果對糾下維生素D缺乏癥有著明顯的差異。在高緯度國家，由于紫外線B（UVB）輻射減少，維生素D缺乏癥非常普遍，因?yàn)槠渲饕獊碓词瞧つw在UVB暴露后的合成。因此，人們對維生素D補(bǔ)充劑的依賴程度很高。大多數(shù)高緯度國家和地區(qū)，包括英國中國北方，都需要遵循維生素D補(bǔ)充指南，尤其是在深色皮膚人群等高風(fēng)險群體中。然而，維生素的攝入量差異很大，這導(dǎo)致了幾個高緯度地區(qū)營養(yǎng)性佝僂病的流行情況，尤其是那些沒有使用按要求使用添加維生素D食品的人群。

維生素D缺乏是兒童營養(yǎng)性佝僂病賊常見的原因之一。維生素D缺乏會導(dǎo)致腸道對鈣的吸收減少，從而降低骨骼礦化所需的礦物質(zhì)供應(yīng)。骨骼礦化減少（骨軟化癥）會影響成人和兒童，而兒童還會發(fā)展為生長板紊亂的佝僂病。佝僂病不僅表現(xiàn)為骨骼畸形、骨折、生長遲緩和發(fā)育遲緩，還可能出現(xiàn)低鈣血癥并發(fā)癥，包括癲癇發(fā)作、手足搐搦，以及罕見的因擴(kuò)張型心肌病導(dǎo)致的心力衰竭。佳學(xué)基因解碼通過一系列基因檢測科普文章介紹了兒童維生素D缺乏癥的臨床表現(xiàn)、發(fā)病率和并發(fā)癥，并通過基因檢測明確缺乏癥發(fā)生的基因因素，從而降低維生素D缺乏癥對家庭健康的系列影響，并提高對兒童進(jìn)行合理看護(hù)的意識。

什么樣的人應(yīng)當(dāng)作維生素D缺乏癥？

維生素D缺乏癥的的臨床表現(xiàn)及檢驗(yàn)科檢查指標(biāo)

維生素D缺乏癥的臨床表現(xiàn)存在季節(jié)性變化。在COVID封鎖限制后，維生素D缺乏癥的病例有所增加。

發(fā)現(xiàn)兩名受試者在無顯著維生素D缺乏癥的情況下出現(xiàn)癥狀，并懷疑這些患者同時存在鈣缺乏癥。這兩名患者都是嬰兒。已知在嬰兒中，多達(dá)60%的25OHD2或25OHD3可以以其C-3差向異構(gòu)體形式存在，這可能導(dǎo)致25OHD水平的高估。醫(yī)院常用的鈣測定通常無法區(qū)分這些差向異構(gòu)體，并且可能無法正確反映嬰兒的總維生素D狀態(tài)，從而造成診斷錯誤。因此，對于嬰兒，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋25OHD水平，并考慮使用基因檢測的方法來評估維生素D狀態(tài)結(jié)合如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。此外，在評估嬰兒維生素D狀態(tài)時，應(yīng)同時考慮鈣攝入量和營養(yǎng)狀況。

維生素D缺乏癥基因檢測案例分析

維生素D缺乏癥的一個臨床表現(xiàn)是佝僂病。在佳學(xué)基因所收錄錄的佝僂病兒童隊列中，包括27名散發(fā)性佝僂病兒童（血清25[OH]D濃度均值±標(biāo)準(zhǔn)差為12.1±4.8 ng/mL）和12名來自有多個一級親屬患有佝僂病的家庭（血清25[OH]D濃度為11.4±4.5 ng/mL）的兒童。12例指標(biāo)病例的22名一級親屬有與佝僂病相符的腿部畸形史，其中14名被納入佳學(xué)基因總結(jié)性分析。使用10分制嚴(yán)重程度量表上的佝僂病放射學(xué)評分大于1.5來確認(rèn)所有指標(biāo)病例和大多數(shù)患有佝僂病的兄弟姐妹。對照組由21名19至59個月大（均值±標(biāo)準(zhǔn)差為35.7±11.9個月）的正常兒童組成。檢測分析時收集了每位受試者的醫(yī)療和人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)，特別強(qiáng)調(diào)了與佝僂病相符的骨骼畸形，并測量了骨和礦物質(zhì)代謝的生化參數(shù)。所有參與分析的患者均獲得了機(jī)構(gòu)審查委員會的批準(zhǔn)，并且在納入研究之前，所有患者或其父母均簽署了書面知情同意書。

在兩個家族（家族1和家族2）的兩代人中，佳學(xué)基因檢測在八名受試者中發(fā)現(xiàn)了數(shù)據(jù)庫已收錄的CYP2R1基因c.296T>C（L99P）突變。該突變與CYP2R1基因座上45kb基因組DNA（gDNA）區(qū)域內(nèi)的一致單倍型處于連鎖不平衡狀態(tài)。在其他10個家族的59名受試者中，均未發(fā)現(xiàn)該單倍型，因此它非常罕見。因此，這兩個看似無關(guān)的山西家庭在突變?nèi)旧w上的CYP2R1基因座上表現(xiàn)出狀態(tài)一致性，并可能與數(shù)據(jù)庫記錄的另一名亞佝僂病的家族成員中發(fā)現(xiàn)的L99P等位基因有共同起源。

家族2中先證者的母親在CYP2R1基因第3外顯子的核苷酸位置726處發(fā)生了腺嘌呤（A）被胞嘧啶（C）替代的雜合子突變（c.726A>C）。這一錯義突變導(dǎo)致CYP2R1蛋白第242位氨基酸的賴氨酸（K）被天冬酰胺（N）取代（p.K242N）。

在佳學(xué)基因收錄的59名無關(guān)受試者以及1000基因組項(xiàng)目中的628名無關(guān)受試者的CYP2R1等位基因中，均未發(fā)現(xiàn)L99P和K242N這兩種突變，從而排除了所識別的突變代表特定人群序列變異的可能性。此外，亮氨酸99和賴氨酸242在哺乳動物、雞和魚類的CYP2R1酶中都是保守的，這表明這些殘基在蛋白質(zhì)功能或結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用。

維生素D缺乏癥基因解碼基因檢測使用生物信息學(xué)軟件Condel對這兩種點(diǎn)突變的影響進(jìn)行了分析，該軟件預(yù)測L99P和K242N氨基酸替換都是有害的。亮氨酸99的替換被提出會損害CYP2R1的折疊，而佳學(xué)基因?qū)242N突變的計算機(jī)模擬分析預(yù)測，這種氨基酸替換會干擾相互作用表面。已知脯氨酸是一種會破壞螺旋的氨基酸，亮氨酸99被脯氨酸替換會破壞螺旋的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和立體結(jié)構(gòu)。賴氨酸242被天冬酰胺替換則被預(yù)測會破壞Phe240的定位，從而導(dǎo)致CYP2R1與其底物（前體維生素D）的相互作用減弱。

這些多患者病例的統(tǒng)計學(xué)分析表明，基于基因解碼的基因檢測不僅可以迅速鑒定數(shù)據(jù)庫已收錄的基因突變，也可以發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫未收錄的基因突變，從而對受檢者的發(fā)病原因進(jìn)行分析明確。

圖：這是先證者第2外顯子DNA序列色譜圖的一部分。每個色譜圖上方都標(biāo)注了CYP2R1的核苷酸序列。這揭示了在第296位（箭頭所指）發(fā)生了胸腺嘧啶（T）到胞嘧啶（C）的純合子替換，導(dǎo)致第99位密碼子的氨基酸亮氨酸（Leucine）被脯氨酸（Proline）所替代（p.99L>P）