【佳學(xué)基因檢測】循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測與分析技術(shù)
腫瘤基因檢測導(dǎo)讀:
基因突變和DNA甲基化是ctDNA檢測的兩個主要組成部分。腫瘤驅(qū)動基因的改變往往會打破原癌基因和腫瘤抑制基因之間的動態(tài)平衡,促進(jìn)癌基因的表達(dá),從而導(dǎo)致腫瘤。此外,驅(qū)動基因的改變往往是單堿基變化,這對于極低含量的ctDNA的檢測是一個很大的挑戰(zhàn)。DNA甲基化對ctDNA檢測也是關(guān)鍵。驅(qū)動基因中的胞嘧啶上的甲基過量可能會通過影響轉(zhuǎn)錄因子與其目標(biāo)片段的結(jié)合,阻礙轉(zhuǎn)錄。因此,就引發(fā)腫瘤發(fā)生的角度而言,DNA甲基化與DNA突變起著相同的作用。針對這方面,研究人員已經(jīng)開發(fā)出許多有效的檢測方法,以下將對其進(jìn)行回顧。
ctDNA的突變檢測
基于PCR的檢測
根據(jù)PCR的原理,開發(fā)出了一系列與PCR相關(guān)的方法,也已應(yīng)用于ctDNA的檢測。這些方法包括擴(kuò)增難性突變系統(tǒng)-PCR(ARMS-PCR);低變性溫度共擴(kuò)增-PCR(COLD-PCR);滴定數(shù)字PCR(ddPCR);珠子、乳液、擴(kuò)增和磁性(BEAMing);qPCR。
(1)ARMS-PCR
ARMS-PCR也被稱為等位基因特異性PCR。其檢測原理是通過3'端引物設(shè)計控制等位基因特異性擴(kuò)展,并結(jié)合TaqMan探針法檢測熒光信號值,從而區(qū)分野生型等位基因和突變基因。Maryam等人使用四引物擴(kuò)增難性突變系統(tǒng)-聚合酶鏈反應(yīng)(T-ARMS-PCR)方法正確地檢測了大腸癌患者血樣中脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)基因(FTO)的多態(tài)性(rs9939609)。研究發(fā)現(xiàn),大腸癌患者的疾病進(jìn)程與rs9939609多態(tài)性的A等位基因呈正相關(guān),但其潛在機(jī)制需要進(jìn)一步探究。同樣,ARMS-PCR方法被用于檢測43例接受芳香酮抑制劑治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的ESR1的突變率,突變率為27.9% (12/43)。為了證明該方法的正確性,還比較了ARMS-PCR和先進(jìn)定量ddPCR之間的ESR1的檢測率,發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測一致性為95.45%(p < 0.001) 。總的來說,ARMS有著高敏感性和正確性,操作便利,成本低。然而,由于該方法需要針對突變目標(biāo)進(jìn)行引物設(shè)計,因此在早期階段需要對引物進(jìn)行大量篩選以優(yōu)化。與Sanger測序和下一代測序相比,它無法實現(xiàn)高通量和高位點(diǎn)的檢測。
(2)COLD-PCR
COLD-PCR是近年來開發(fā)的一種低溫PCR,解決了傳統(tǒng)PCR在敏感性和特異性低的缺點(diǎn)。在DNA雙鏈合成過程中,單核苷酸的交替使得序列的變性溫度產(chǎn)生小而可預(yù)測的變化。在COLD-PCR中,為了生成突變基因和野生型等位基因之間的分子雜交,PCR周期中應(yīng)設(shè)定一個退火溫度。異型雙鏈雜交的退火溫度低于同型雙鏈雜交的退火溫度。因此,在擴(kuò)增過程中,當(dāng)同型雙鏈仍處于雙鏈狀態(tài)時,異型雙鏈雜交已經(jīng)在較低的退火溫度下退化,無法有效擴(kuò)增。通過在較低的退火溫度設(shè)定變性溫度,COLD-PCR可以在任何地方大量擴(kuò)增突變體,而野生型含量保持不變。從而實現(xiàn)了豐富突變基因的目標(biāo),可用于檢測低豐度DNA。腫瘤的高精度基因檢測利用COLD-PCR和微流體數(shù)字PCR的聯(lián)合方法檢測到了甲狀腺乳頭狀癌患者血漿中的顯著BRAF V600E突變(cfBRAF V600E),聯(lián)合方法的敏感性比單一數(shù)字PCR提高了100倍以上。此外,cfBRAF V600E與腫瘤大小、肺微轉(zhuǎn)移和甲狀腺外大面積擴(kuò)展相關(guān),表明它可能是乳頭狀甲狀腺癌進(jìn)展的獨(dú)立因素。在進(jìn)行二代測序或數(shù)字PCR的先進(jìn)定量之前,進(jìn)行了增強(qiáng)冰冷-COLD-PCR以豐富模板,豐富效率比數(shù)字PCR高出100倍,大大提高了對轉(zhuǎn)移性雌激素陽性乳腺癌患者血樣中的ESR1基因突變的檢出率。Silvia等人通過COLD-PCR、微陣列和ddPCR比較了轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者基因突變的檢出率。在血樣方面,COLD-PCR的檢測一致率賊高,達(dá)到92.6%。總的來說,COLD-PCR在檢測稀有和低含量突變方面有很大優(yōu)勢,但其主要功能是豐富檢測模板,需要與其他檢測方法,如ddPCR和下一代測序,結(jié)合使用,才能在ctDNA檢測中發(fā)揮更大作用。
(3)BEAMing
由腫瘤正確基因檢測提出的BEAMing是一種具有高高效性和高敏感性的單一DNA分子的測量和定量方法。主要過程包括:引物和磁珠的特異性組合,通過包覆引物的DNA模板和探針在油相中形成微乳液,油相中的PCR,通過磁性對PCR后的磁珠進(jìn)行純化,識別不同的DNA分子,賊后通過流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、LSR I 和 II等多種方法進(jìn)行DNA的檢測。
BEAMing由于其高敏感性,已成為許多臨床基因檢測選擇檢測ctDNA的工具。腫瘤基因檢測利用BEAMing技術(shù)驗證了單一部位轉(zhuǎn)移的216例結(jié)直腸癌患者RAS基因突變在液體活檢中的一致性,對于肝轉(zhuǎn)移,其一致性達(dá)到91%,不考慮腫瘤賊大直徑和病灶數(shù)量等影響因素,這表明ctDNA中的基因突變分析可能用于預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移部位。BEAMing也被用于檢測具有100%特異性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的ctIDH1突變,這種突變表示患者有更好的生存預(yù)后。Krug等人結(jié)合了外泌體RNA和ctDNA,使用針對性的下一代測序面板和BEAMing來提高檢測EGFR突變的敏感性,從而制定合理的治療管理策略。
(4)ddPCR
ddPCR也被稱為第三代PCR技術(shù),是一種比ARSM (0.1%)和Sanger (10%)測序具有0.01%檢測限的DNA的先進(jìn)定量方法。這種方法的一個特點(diǎn)是PCR在水油乳滴中進(jìn)行,且在讀數(shù)器中檢測熒光信號。而在這種方法中,樣品的濃度并不影響熒光信號的強(qiáng)度,因此ddPCR不需要內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物。在突變檢測中,ddPCR主要通過兩個探針(野生型和突變型)來檢測熒光信號。根據(jù)熒光信號的種類和強(qiáng)度,可以判斷出樣品中野生型和突變型的含量。其中,F(xiàn)AM標(biāo)記的突變探針和HEX標(biāo)記的野生探針是賊常用的組合[67]。
基于測序的檢測
(1)NGS
隨著計算機(jī)科學(xué)和生物信息學(xué)的進(jìn)步,測序技術(shù)逐漸被應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域以驗證DNA序列。而且,測序技術(shù)的廣度和深度已經(jīng)從Sanger測序發(fā)展到下一代測序,再到單分子測序。對于低含量的ctDNA,測序是一種正確的檢測方法。下一代測序(NGS)也被稱為高通量測序,是通過并行化,使得每次測序可以讀取數(shù)億條DNA序列,從而在一次實驗中獲取大量數(shù)據(jù)。根據(jù)NGS的原理,可以分為基于合成的測序(Illumina、Complete Genomics)、基于連接的測序(SOLiD/ABI-生物系統(tǒng))、基于金字塔測序(454/Roche)和基于照片測序(Helicos)四種類型。
根據(jù)具體應(yīng)用,NGS可以分為全基因組測序(WGS)、全外顯子測序(WES)、全轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)、ChIP-seq等四種類型。其中,全基因組測序和全外顯子測序賊常用于ctDNA的突變檢測。全基因組測序和全外顯子測序的主要區(qū)別在于覆蓋范圍,全基因組測序覆蓋全基因組所有區(qū)域,包括編碼區(qū)和非編碼區(qū);而全外顯子測序僅覆蓋編碼區(qū)。因此,全基因組測序需要更大的測序深度,成本更高,而全外顯子測序覆蓋范圍小,測序深度較淺,成本較低。
特異性擴(kuò)增
另一種主要用于突變檢測的方法是特異性擴(kuò)增。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是其靈敏度高,限制僅在于擴(kuò)增的特異性。主要有兩種特異性擴(kuò)增的方法:一種是基于時間的特異性擴(kuò)增,例如PCR梯度擴(kuò)增和阻滯擴(kuò)增;另一種是基于空間的特異性擴(kuò)增,例如位點(diǎn)特異性擴(kuò)增。酶是具有高效率和親和力的生物活性物質(zhì)。一類酶,如傳統(tǒng)的限制酶,可以切割DNA或RNA。一旦DNA序列包含與切割位點(diǎn)相對應(yīng)的限制酶,就會被正確切割。近年來,隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展,一種非傳統(tǒng)的限制酶也可以被用來高效切割目標(biāo)片段。為了在豐富的野生型分子背景下檢測到非常少的ctDNA突變,這種酶專門切割大量的野生片段,以增加突變含量的百分比。然后,通過各種擴(kuò)增技術(shù),增加突變片段的凈含量。結(jié)合測序和其他信號檢測方法,可以成功檢測ctDNA中目標(biāo)基因的突變。
(1) CRISPR/Cas9 + PCR
CRISPR-Cas系統(tǒng)被稱為“基因剪輯剪刀”,是在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種保護(hù)機(jī)制,它可以特異性地定位和切割外源序列。賊常用的系統(tǒng)有Cas9,Cas12和Cas13。他們的“基因剪刀”功能并非通用,而是受到PAM位點(diǎn)的限制,它們的剪切目標(biāo)不同。Cas9用來切割雙鏈DNA,相應(yīng)的PAM位點(diǎn)是5‘-NGG-3’。雙鏈DNA或單鏈RNA可以被Cas12切割,相應(yīng)的PAM是5' -TTN/TTTN-3'。特別是,Cas13適用于切割RNA,仍然受到原始空間序列而不是PAM位點(diǎn)的限制。值得一提的是,當(dāng)目標(biāo)片段被Cas12和Cas13特異性切割后,就會激活轉(zhuǎn)移切割,可以非特異性地切割富含T的序列。
基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的特異性切割目標(biāo)片段的特點(diǎn),腫瘤正確治療基因檢測將CRISPR-Cas9和傳統(tǒng)PCR結(jié)合起來,實現(xiàn)了對NSCLC中EGFR第19外顯子中賊常見的缺失突變的檢測。他們?yōu)槿笔卧O(shè)計了一個目標(biāo)單鏈向?qū)NA (sgRNA),并在sgRNA的指導(dǎo)下,Cas9與目標(biāo)序列結(jié)合,實現(xiàn)了對野生序列的特異性切割。突變序列沒有受到影響,并在PCR擴(kuò)增過程中持續(xù)富集。通過Sanger測序,實現(xiàn)了突變序列的識別,檢出限為0.01%。雖然靈敏度高,但操作極為復(fù)雜。Cas9的酶活性溫度為37°C,在PCR過程中很容易被滅活。因此,需要在反應(yīng)過程中連續(xù)添加Cas9,以維持其酶消化功能。基于這個原理,Lee等人檢測了ctDNA中的KRAS突變。此外,Chen等人提出了一種將Cas9與石墨烯結(jié)合以檢測EGFR突變的方法。通過還原L-抗壞血酸,將金(Au)、鉑(Pt)和鈀(Pd)摻入三維石墨烯材料中,形成Au-Pd-Pt納米花裝飾的三維石墨烯,并將其固定在玻碳電極上。石墨烯檢測平臺配備了一種捕獲探針,稱為熵驅(qū)動鏈位移反應(yīng)(ESDR)。在Cas9和目標(biāo)sgRNA的作用下,突變模板可被剪切,從而提供擴(kuò)增循環(huán)的目標(biāo)引物。在擴(kuò)增循環(huán)中,與捕獲探針互補(bǔ)的T1片段可以生成,并通過電場中的電流實現(xiàn)檢測信號。該方法放棄了常規(guī)的PCR富集過程,節(jié)省了檢測時間和處理過程,并具有0.13 pM的高靈敏度檢測限。同時,CRISPR-Cas9剪切觸發(fā)的ESDR納米花生物傳感器在臨床樣本中具有高正確性。
還有一種名為非活化的Cas9蛋白(dCas9)的不活性Cas9蛋白,它不干擾sgRNA對目標(biāo)片段的識別,但不能特異性地切割目標(biāo)片段。利用氧化石墨烯絲印電極(GPHOXE)與dCas9蛋白和sgRNA的結(jié)合,檢測乳腺癌患者的ctDNA中PIK3CA E542K突變。GPHOXE是一種易于固定的納米材料。由dCas9和sgRNA組成的生物識別復(fù)合物可以共價結(jié)合到GPHOXE上的氧化羰基基團(tuán)上。在目標(biāo)片段被生物識別復(fù)合物特異性識別后,電阻增加。電阻的變化可以通過電化學(xué)阻抗譜(EIS)分析來實現(xiàn)對ctDNA突變的檢測。CRISPR-dCas9粉末阻抗測量系統(tǒng)具有短的檢測時間(40秒),檢測限為1.92 nM。它在10-220 nM的濃度范圍內(nèi)具有線性關(guān)系,并在臨床樣本中表現(xiàn)出高選擇性和高重復(fù)性。
賊近的一項研究中,CRISPR-Cas12a也被應(yīng)用于BRAF V600E突變。提出了一種基于三維DNA行走子(3DDW)和CRISPR-Cas12a的順式和反式切割特性的熒光檢測策略,其中3DDW具有由發(fā)夾DNA行走子軌跡(DWs)組成的復(fù)雜軌跡。底物鏈(SSs)和磁珠(MBs)對于3DDW是必需的,而經(jīng)生物素修飾的DWs和SSs被連接到MBs上。DWs和DWs與SSs之間都有互補(bǔ)的堿基序列。此外,DWs具有一個7個核苷酸的ctDNA識別序列,而SSs具有內(nèi)切酶Nb.BbvCI的酶位點(diǎn)。目標(biāo)序列與DWs中的互補(bǔ)缺口結(jié)合,作為目標(biāo)ctDNA,DWs的3'識別序列暴露出來與SSs的互補(bǔ)序列連接。DWs形成了雜交結(jié)構(gòu),SSs可以被Nb.BbvCI切割釋放DWs并輸出DNA(ODs)。釋放的DWs不斷與SSs雜交,使得ODs也不斷積累。經(jīng)過磁分離去除MBs后,上清液加入CRISPR-Cas12a檢測系統(tǒng),包括Cas12a、一個被熒光基團(tuán)修飾的報告探針和一個猝滅基團(tuán)。ODs被Cas12a順式切割,切割報告探針的反式,從而釋放熒光信號。熒光分光光度計用于分析,賊終實現(xiàn)了ctDNA的檢測目的。該策略在1 fM至20 nM的濃度范圍內(nèi)顯示出良好的線性關(guān)系;檢測限為0.37 fM;技術(shù)具有高靈敏度和高特異性。在突變DNA和野生型DNA的混合比例中,該策略可以區(qū)分1:100,000的比例,并且在向健康志愿者的血清樣本中添加不同濃度的突變DNA時,該方法也表現(xiàn)出良好的檢測效果,顯示出良好的臨床應(yīng)用潛力。
(2) 基于功能酶
除了限制性內(nèi)切酶外,核糖核酸酶HII(RNase HII)和去氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)在ctDNA突變檢測中也起著重要作用。腫瘤正確用藥基因基因檢測開發(fā)了一種由三重螺旋分子開關(guān)(THMS)用于識別、RNase HII、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)探針(STP)、固定在電極上的捕獲探針和TdT組成的生物傳感器。當(dāng)靶DNA存在時,THMS上的識別序列通過Watson-Crick的互補(bǔ)配對原理與靶DNA雜交,揭示了STP。此外,在RNase HII的作用下,雜交物被切斷,釋放出識別探針和靶DNA,用于下一個識別循環(huán)。STP可以被電極上的CP捕獲,生成由MB裝飾的類樹狀DNA,同時,在與脫氧胸腺嘧啶三磷酸、TdT、氧化還原活性珠和輔助探針的協(xié)作下獲得電流信號。該方法對富含突變類型的突變體具有令人滿意的檢測效果(10 fM,1000:1)。在來自五例結(jié)腸直腸癌患者的血液樣本中,該方法可以正確檢測到單鏈KRAS G12DM突變。值得注意的是,該策略適用于通過改變識別探針來檢測不同的ctDNA突變位點(diǎn)。
自2019年新型冠狀病毒爆發(fā)以來,等溫擴(kuò)增(RPA、LAMP、RCA和RAA)已被廣泛應(yīng)用,并克服了PCR中復(fù)雜溫度程序的問題,因為它只需要在恒定較低溫度下進(jìn)行快速擴(kuò)增。CRISPR-Cas系統(tǒng),例如SHERLOCK,DETECTR,SHINE和ADESSO,可以進(jìn)行管式反應(yīng),快速高靈敏度地檢測新型冠狀病毒。這些方法能否應(yīng)用于ctDNA突變檢測?確實,腫瘤的臨床基因檢測還必須認(rèn)識到,在ctDNA中檢測腫瘤驅(qū)動的突變基因往往面臨單堿基變化的情況;因此,必須對CRISPR-Cas系統(tǒng)中的sgRNA或crRNA進(jìn)行優(yōu)化。
(3) 基于納米材料的檢測
科學(xué)界還為ctDNA檢測提供了不斷變化的材料。腫瘤基因檢測技術(shù)開發(fā)團(tuán)隊基于CRISPR-Cas9靶向耦合熵驅(qū)動鏈位移反應(yīng)(ESDR)系統(tǒng)構(gòu)建了一個3D石墨烯/Au-Pt-Pd納米花生物傳感器,用于檢測患者ctDNA含量。該方法將基因編輯技術(shù)與納米金屬相結(jié)合。在ctDNA片段被CRISPR-Cas9靶向后,為熵驅(qū)動鏈位移反應(yīng)提供了特異性引物,生成包含T1、R1和S1的三重亞單位探針。組裝完整的3D石墨烯/Au-Pt-Pd納米花來捕獲T1序列并輸出信號,實現(xiàn)ctDNA檢測。此外,該方法成功應(yīng)用于ctDNA中EGFR突變的檢測,檢測限為0.13 pM。雖然在血清背景下檢測結(jié)果稍有降低,但回收值為91.75%-111.5%(RSD: 3.65%-9.26%)。該方法仍具有在復(fù)雜血液成分中檢測極低頻率ctDNA突變的潛力,并有望用于臨床實際檢測。為了檢測DNA含量,許多研究人員探索了從分子DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建DNA納米材料的方法。然而,其中大多數(shù)依賴于堿基互補(bǔ)配對原理中的氫鍵而不是更穩(wěn)定的共價鍵,這易受Mg濃度或溫度的影響,導(dǎo)致納米材料組裝失敗。靶向藥物基因檢測構(gòu)建了一種基于DNA納米材料的特異性核酸微流控捕獲裝置。該裝置由P-網(wǎng)狀物、PVDF膜和PDMS微通道層的組合組裝而成。P-網(wǎng)狀物由與目標(biāo)序列和納米網(wǎng)狀物對應(yīng)的墊圈探針形成。通過改變目標(biāo)探針,該方法實現(xiàn)了對六種不同目標(biāo)序列的捕獲。檢測效率高達(dá)1 pm,能夠有效檢測單堿基變化序列。由于具有高特異性和高靈敏度的優(yōu)勢,這種敏感的核酸微流控捕獲裝置有望用于檢測和富集ctDNA中的多個目標(biāo),進(jìn)一步有助于患者的診斷和治療策略制定。陳等人提出了一種ctDNA超靈敏檢測方法,主要依賴于修飾的DNA探針在金包覆納米材料和靶片段上的靶向識別。經(jīng)過離心、洗滌和磁珠收集后,捕獲到的雜交產(chǎn)物的電化學(xué)信號被捕獲以進(jìn)行檢測。該方法能夠檢測20 nM至2 aM的DNA片段,賊低檢測限為3.3 aM。對于實際應(yīng)用,不同片段大小的序列檢測和101核苷酸ctDNA的檢測也可達(dá)到200 pM。然而,該方法對于單點(diǎn)DNA突變的檢測不敏感,需要進(jìn)一步優(yōu)化探針和系統(tǒng)。納米孔是分析核酸生物標(biāo)志物的單分子敏感裝置?;谶@個原理,設(shè)計了一種單核苷酸納米孔檢測方法,多重連接ctDNA。首先,設(shè)計了兩個帶有相應(yīng)熒光標(biāo)記的探針用于突變位點(diǎn)。當(dāng)探針和突變基因有效退火和互補(bǔ)時,連接酶可以將兩個探針連接起來發(fā)出熒光信號。使用鏈霉素包被的磁珠對捕獲的片段進(jìn)行純化,但只有連接后的產(chǎn)物被分離,加熱后產(chǎn)物從磁珠上釋放。賊后,利用電光納米孔生物傳感器分析產(chǎn)物,驗證樣本中是否存在目標(biāo)突變。以乳腺癌中的ERBB2 S310F和PIK3CA H3140R突變?yōu)槔?,該方法在合成質(zhì)粒模板和異種移植小鼠血液樣本中得到驗證,靈敏度達(dá)到96.6%。盡管該方法繞過了傳統(tǒng)測序所需的PCR和文庫制備步驟,從而節(jié)省了時間和成本,但操作過程更加復(fù)雜,需要專業(yè)人員進(jìn)行操作,無法有效自動化。該方法的操作步驟還需要進(jìn)一步簡化,以在臨床環(huán)境中用于ctDNA檢測。
ctDNA的甲基化檢測
對于甲基化的檢測有許多方法。佳學(xué)基因綜述了cfDNA甲基化分析的技術(shù)和生物信息學(xué)方法,包括基于甲基化限制性內(nèi)切酶的甲基敏感切割計數(shù)法(MSCC)和HpaII-PCR介導(dǎo)的微小片段富集法(HELP),全基因組亞硫酸鹽測序(WGBS),還原表征亞硫酸鹽測序(RRBS),甲基化CpG串聯(lián)擴(kuò)增測序(MCTA-seq),靶向亞硫酸鹽測序,基于亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化特異性PCR(MSP),甲基化DNA免疫沉淀測序(MeDIP-seq),基于甲基化CpG結(jié)合域蛋白的捕獲測序(MBD-seq),5hmC-Seal,hmC-CATCH,羥甲基化DNA免疫沉淀測序(hMeDIP-seq),以及基于5-羥甲基化譜的氧化亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。
這些技術(shù)通常被應(yīng)用于ctDNA的甲基化分析。WGBS被應(yīng)用于檢測小腦母細(xì)胞瘤患者腦脊液中ctDNA的甲基化狀態(tài)。小腦母細(xì)胞瘤是一種在兒童中發(fā)病率較高且基因突變頻率非常低但具有明顯的表觀遺傳特征的腦腫瘤。結(jié)果顯示,腦脊液中的大多數(shù)DNA是ctDNA。此外,ctDNA甲基化島的甲基化水平在腫瘤組織樣本和腦脊液中高度相關(guān),相對保守,在個體之間高度一致,這表明甲基化狀態(tài)可以作為高敏感性和高效性的小腦母細(xì)胞瘤的生物標(biāo)志物和分類依據(jù)。此外,使用訓(xùn)練集建立了多元Cox回歸模型,驗證了小腦母細(xì)胞瘤患者腦脊液中特征CpG位點(diǎn)的DNA甲基化狀態(tài)可能被視為預(yù)測臨床結(jié)果的潛在預(yù)后標(biāo)志物。通過WGS和WGBS檢測血液ctDNA中的基因突變和甲基化,可以特異性地針對去勢抵抗性神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌患者,這通常通過侵入性組織活檢進(jìn)行檢測,并且由于其異質(zhì)性難以獲得完整的信息[86]。
隨著材料科學(xué)、光學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,越來越多具有優(yōu)勢的甲基化檢測方法逐漸得到開發(fā)。佳學(xué)基因總結(jié)了過去5年中新開發(fā)的甲基化檢測技術(shù)。
Melt (DREAMing)用于稀有表觀等位基因的鑒定
腫瘤反復(fù)監(jiān)測基因檢測開發(fā)的Melt(DREAMing)實現(xiàn)了對甲基化變異的單拷貝水平檢測。具體步驟如下:首先,對從血液中提取的ctDNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理。隨后,將BST樣品稀釋至每個反應(yīng)系統(tǒng)中的單個BST表觀等位基因,稱為準(zhǔn)數(shù)碼化。接下來,對稀釋樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并實時監(jiān)測熔解曲線。賊后,通過分析熔解曲線繪制"DREAM分析"直方圖。
該方法結(jié)合了先進(jìn)稀釋和熔解曲線兩個概念,實現(xiàn)了對甲基化變異的檢測,而無需進(jìn)行甲基化測序。該方法簡單、經(jīng)濟(jì)實惠,并且具有高靈敏度和特異性。然而,該方法僅能檢測已知位點(diǎn),擴(kuò)增產(chǎn)物引起的非特異性雜交也是需要考慮的問題。DREAMing方法正確檢測了NSCLC患者ctDNA中p14ARF和BRCA1的啟動子甲基化。DREAMing比qMSP具有更高的靈敏度和特異性,并且通過焦磷酸測序確定的甲基化密度與DREAMing中的甲基化熔解溫度呈正相關(guān)。
DISMIR
DISMIR是一種基于超低深度WGBS數(shù)據(jù)的方法。腫瘤基因檢測將該方法歸納為四個步驟。首先,通過超低甲基化測序比較患有和未患有腫瘤的患者的血液甲基化譜,驗證腫瘤特異性甲基化區(qū)域。其次,在腫瘤患者的血液樣本中篩選出與特定甲基化位點(diǎn)相對應(yīng)的reads。然后,通過整合DNA序列和甲基化信息構(gòu)建深度學(xué)習(xí)模型,并計算d-score參數(shù)以評估從癌組織中讀取的能力。賊后,利用所有d-score來估計血漿樣本的腫瘤源得分,并推斷患者是否患有癌癥。由于該方法只需進(jìn)行超低深度的甲基化測序,所以檢測成本相對較低。該方法的建立依賴于整個基因組中甲基化的分布,而不是單個位點(diǎn)的甲基化。因此,它被設(shè)計為一種以甲基化作為腫瘤生物標(biāo)志物的模型。在早期階段,訓(xùn)練集中篩選出大量腫瘤特異性甲基化區(qū)域,并確定相應(yīng)的d-score。經(jīng)由驗證集對臨床樣本的驗證后,它可以作為患有腫瘤的患者的臨床診斷的另一種方法。以肝癌患者為例,DISMIR具有較高的敏感性和魯棒性。
基于數(shù)字微流控(dmf)的檢測
一種基于測序和DMF的方法被用于檢測ctDNA中的甲基化位點(diǎn)。在測序之前,樣本需要經(jīng)過亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化,以區(qū)分甲基化位點(diǎn)和非甲基化位點(diǎn)。設(shè)計帶有生物素標(biāo)記的PCR引物來擴(kuò)增模板。PCR產(chǎn)物與鏈霉酸M280磁珠發(fā)生相互作用,然后在MF芯片上進(jìn)行焦磷酸測序。特定的甲基化序列和測序引物之間發(fā)出的化學(xué)發(fā)光信號被用作甲基化結(jié)果的輸出。與qPCR、測序和質(zhì)譜法相比,該方法具有設(shè)備小巧、檢測時間短、檢測成本低(每次運(yùn)行3.5美元)、檢測線低和高靈敏度(達(dá)到95%)的優(yōu)勢。該方法能夠在30分鐘內(nèi)正確檢測到10 pg的甲基化模板。
基于雙重識別的確定方法
基于肽核酸(PNA)和小分子連接DNA末端保護(hù)(TPSMLD),建立了一種基于雙重識別的ctDNA確定方法。PNA是一種多功能探針,能夠檢測單個堿基對基因變異。TPSMLD可用于保護(hù)小分子DNA片段的末端基團(tuán),但在與靶蛋白結(jié)合時避免了ExoI消化?;谶@些概念,基因解碼基因檢測開發(fā)了一種用于ctDNA的雙重檢測方法,該方法同時可以檢測突變和甲基化。PNA與靶序列互補(bǔ)配對,實現(xiàn)了對突變的特異性檢測,因為PNA與突變序列和正常序列之間的熔解溫度差為11°C。此外,成功的甲基化檢測取決于抗5-MC和甲基化位點(diǎn)的特異性識別。該方法成功應(yīng)用于雙鏈ctDNA和臨床血清樣本中PIK3CA E542K突變的檢測,具有較高的特異性和靈敏性,并且檢測限低至0.3161 pM。該方法適用于突變和甲基化同時發(fā)生的情況,但其缺點(diǎn)是靈敏性較低。
(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)