【佳學(xué)基因檢測(cè)】如何采用外周血（不及腦脊液）進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤基因檢測(cè)

彌漫性低級(jí)和高級(jí)膠質(zhì)瘤構(gòu)成了發(fā)病率第15位的實(shí)體腫瘤,死亡率第10位。盡管膠質(zhì)瘤在人群中的發(fā)病率不高,但高死亡率和顯著的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥使診斷和治療方案的改進(jìn)變得迫切?；蚪獯a的臨床應(yīng)用研究表明：膠質(zhì)瘤的分子分類對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后和治療決策至關(guān)重要,因?yàn)榕cIDH野生型腫瘤相比,IDH突變型膠質(zhì)瘤患者預(yù)后明顯更好,兩組之間有不同的突變譜。這一基因解碼結(jié)果已經(jīng)表現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤的新WHO分類中。 IDH突變存在于三分之一的膠質(zhì)瘤患者中,IDH1和IDH2突變分別發(fā)生在70%和10%的低級(jí)膠質(zhì)瘤中。大多數(shù)IDH突變是雜合錯(cuò)義突變,促進(jìn)α-酮戊二酸向(R)-2-羥基戊二酸((R)-2HG)的轉(zhuǎn)換,后者是一種腫瘤代謝物,通過抑制組蛋白去甲基化酶發(fā)揮幾種生物學(xué)效應(yīng),如細(xì)胞分化和染色質(zhì)甲基化。 IDH突變發(fā)生在腫瘤發(fā)生過程的非常早期的時(shí)間,可能驅(qū)動(dòng)遺傳不穩(wěn)定性和其他致癌基因的突變。實(shí)際上,神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因解碼使用COSMIC數(shù)據(jù)庫清楚描棕了IDH突變型和IDH野生型腫瘤之間明確不同的分子譜。有趣的是,IDH突變必須是雜合性的,以產(chǎn)生(R)-2HG副產(chǎn)物,這也是IDH突變型膠質(zhì)瘤預(yù)后較好的原因。已經(jīng)在其他IDH突變型惡性腫瘤中測(cè)試了幾種IDH抑制劑,目前也正在膠質(zhì)瘤患者中測(cè)試(NCT04056910, NCT03343197)。因此,除了治療靶點(diǎn)外,IDH突變還構(gòu)成了理想的熱點(diǎn)突變,可以通過液體生物標(biāo)志物分析進(jìn)行跟蹤。液體活檢可以規(guī)避傳統(tǒng)組織活檢的在組織類型入采樣時(shí)間上的局限性,這對(duì)于高度異質(zhì)性疾病如膠質(zhì)瘤、星形膠質(zhì)等尤其重要。由于腦腫瘤活檢與高發(fā)病率相關(guān),采用比獲取腦脊液(CSF)更微創(chuàng)方式來獲得腫瘤的分子譜非常重要。實(shí)際上,已經(jīng)證明CSF中ctDNA的檢測(cè)可以正確反映膠質(zhì)瘤患者原發(fā)腫瘤中的腫瘤突變。然而,CSF采樣對(duì)患者不舒服且可能有問題,并需要大量醫(yī)療資源。因此,外周血液活檢是大多數(shù)癌癥患者理想的液體活檢方式,尤其是那些通常虛弱、依賴和神經(jīng)功能衰退的膠質(zhì)瘤患者。然而,膠質(zhì)瘤液體活檢需要克服幾個(gè)障礙。除了缺乏傳統(tǒng)組織活檢提供的形態(tài)信息外,檢測(cè)方法還需要提高敏感性,因?yàn)檠X屏障效應(yīng)和膠質(zhì)瘤通常不發(fā)生轉(zhuǎn)移和腫瘤負(fù)荷較小限制了ctDNA進(jìn)入外周血的量。到目前為止,只有少數(shù)基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)研究證明了能在膠質(zhì)瘤患者外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞、外細(xì)胞微粒和/或ctDNA。然而,這些研究受制于其低敏感性,ctDNA檢測(cè)率通常低于50% 。Beads, Emulsion, Amplification and Magnetics (BEAMing)是一種高敏感的數(shù)字PCR,將PCR產(chǎn)物乳化,然后與熒光磁珠上的突變型和野生型DNA片段差異雜交,賊后用流式細(xì)胞術(shù)分析。這種技術(shù)可以檢測(cè)出10,000個(gè)野生型等位基因中1個(gè)突變體,專門用于檢測(cè)RA??S、EGFR、PIK3CA或IDH等反復(fù)熱點(diǎn)突變,應(yīng)用于各種實(shí)體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者血漿中。鑒于BEAMing目前是血漿中ctDNA檢測(cè)更為敏感的技術(shù),且針對(duì)原發(fā)性腦腫瘤液體活檢的證據(jù)非常有限。

成功證明液體活檢在腦腫瘤中具有臨床價(jià)值的大多數(shù)研究使用腦脊液而不是外周血。這些研究的大多數(shù)顯示與組織結(jié)果的良好相關(guān)性,通常顯示從腦脊液獲得的突變結(jié)果與原發(fā)腫瘤獲得的結(jié)果之間的一致性>60%。此外,一些腫瘤基因檢測(cè)研究人員證明了基于腦脊液的突變譜的變化正確反映了原發(fā)腫瘤的演變,這在治療監(jiān)測(cè)和治療決策中可能有價(jià)值。然而,原發(fā)性腦腫瘤液體活檢的發(fā)展受到疾病分子異質(zhì)性的限制,除2009年新穎描述的IDH突變外,熱點(diǎn)突變較少,以及血腦屏障效應(yīng)和該疾病局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的性質(zhì)導(dǎo)致ctDNA進(jìn)入外周血有限。因此,成功在原發(fā)性腦腫瘤患者外周血檢測(cè)到ctDNA的研究一直是佳學(xué)基因等機(jī)構(gòu)的研究課題之一,尤其是膠質(zhì)瘤。其他機(jī)構(gòu)進(jìn)行的兩項(xiàng)基于NGS的泛腫瘤ctDNA研究使用外周血樣本報(bào)告了膠質(zhì)瘤患者ctDNA檢測(cè)率較低,從<10%到15%不等。另一方面,一組法國人使用COLD數(shù)字PCR檢測(cè)IDH1-R132H突變,報(bào)告原發(fā)腫瘤和ctDNA之間的一致率為60%。此外,該研究顯示高級(jí)別膠質(zhì)瘤和高腫瘤負(fù)荷較低腫瘤負(fù)荷的ctDNA檢測(cè)率更高。 ctDNA甲基化作為一種不同的ctDNA液體活檢方式也得到了基因解碼機(jī)析的比較分析。腫瘤基因檢測(cè)的研究表明,在膠質(zhì)瘤患者外周血中識(shí)別雜合缺失(LOH)和MGMT/PTEN甲基化的敏感性和特異性中等,檢測(cè)MGMT甲基化的患者比例可達(dá)24%。然而,24%的患者在血清中呈甲基化陽性,盡管MRI無腫瘤證據(jù)。有趣的是,賊近在顱內(nèi)腫瘤患者中探索了ctDNA甲基組,證明可高精度區(qū)分不同的顱內(nèi)和顱外腫瘤以及IDH野生型和IDH突變型膠質(zhì)瘤。盡管ctDNA甲基組分析作為顱內(nèi)腫瘤患者的診斷工具前景廣闊,但這種方法尚未實(shí)現(xiàn)常規(guī)應(yīng)用,限制了其當(dāng)前應(yīng)用。與佳學(xué)基因研究中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)相反,上述參考文獻(xiàn)均未進(jìn)行系列ctDNA分析,而佳學(xué)基因采用的縱向分析對(duì)疾病的縱向監(jiān)測(cè)具有重要的臨床價(jià)值。

在膠質(zhì)瘤患者外周血中也檢測(cè)到了其他腫瘤組分。兩項(xiàng)研究證明了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者有干細(xì)胞樣和間質(zhì)樣特征的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的脫落。但是,相對(duì)較低的CTC數(shù)目,結(jié)合其檢測(cè)的技術(shù)困難,限制了這種方法的實(shí)用性。另一研究小組證明,來自低級(jí)別膠質(zhì)瘤小鼠模型的外泌體能夠穿過血腦屏障(BBB)。在IDH突變型膠質(zhì)瘤患者中,研究人員能夠在外周血中檢測(cè)到腫瘤外泌體,并分析其內(nèi)容以高一致率成功檢測(cè)IDH1-R132H突變。

在神經(jīng)腫瘤的基因解碼基因檢不則研究中,在組織NGS鑒定的6名IDH1突變患者中,BEAMing檢測(cè)到3名患者(50%)的血漿中存在相同的突變,特異性達(dá)到100%。在21份外周血樣本中,真陽性率為14.3%(3/21);因此,假陰性率很高(86.4%)。然而,必須指出的是,在6名IDH1突變患者的18份ctDNA陰性血漿樣本中,有15份是在MRI上沒有疾病進(jìn)展證據(jù)的時(shí)間點(diǎn)收集的。因此,可以推測(cè),如果僅在未治療或疾病進(jìn)展時(shí)收集外周血,假陰性率會(huì)降低。盡管在每個(gè)患者的單個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到ctDNA中的突變,但所有3名ctDNA陽性患者均未接受治療或疾病進(jìn)展(3/6:50%),表明BEAMing在檢測(cè)活躍性疾病患者血漿ctDNA方面的價(jià)值。在另外兩名ctDNA陽性IDH1突變IV級(jí)星形細(xì)胞瘤患者中,在其他時(shí)間點(diǎn)未檢測(cè)到IDH1突變,但任何患者的MRI均未觀察到腫瘤進(jìn)展。在ctDNA陽性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,在放療前未檢測(cè)到兩個(gè)IDH1突變,在放療后的第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)也未檢測(cè)到這兩個(gè)突變,但在這兩種情況下,患者均存在殘存疾病。然而,該患者患有低級(jí)別腫瘤,且疾病負(fù)荷遠(yuǎn)低于其他兩名患者。此外,低級(jí)別膠質(zhì)瘤以緩慢進(jìn)展的腫瘤而聞名,因此可能是ctDNA低釋放腫瘤[2,3,45]。在該患者特殊的背景下,放療可能需要一些時(shí)間才能有效清除這一緩慢進(jìn)展的低級(jí)別腫瘤。有趣的是,這位患者患II級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤已有15年歷史,于2004年和2011年接受手術(shù),賊終在2017年反復(fù),放療后顯示含有兩個(gè)IDH1突變(R132H, R132C)的活躍殘余病變。這表明液體活檢能夠揭示腫瘤的分子異質(zhì)性和進(jìn)化[16,21]。實(shí)際上,雖然R132H突變?cè)谀[瘤和血漿中的VAF均高,但另一突變(R132C)的VAF在腫瘤和血漿中都較低但可檢測(cè)——高于NGS和BEAMing的檢測(cè)限。盡管腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)的患者未接受任何IDH抑制劑治療,但這一發(fā)現(xiàn)與其他研究者的報(bào)道一致,他們描述了接受選擇性IDH抑制劑治療的IDH突變白血病出現(xiàn)其他IDH突變作為耐藥機(jī)制;這表明新發(fā)生的耐藥突變或擴(kuò)增存在但為亞克隆的IDH突變[46,47]。由于腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)僅研究了腫瘤體細(xì)胞改變,沒有進(jìn)行體細(xì)胞DNA研究或進(jìn)行單細(xì)胞分析,因此腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)無法證明該患者IDH1中的兩個(gè)共存突變是否屬于同一個(gè)克隆或兩個(gè)不同的克隆。然而,考慮到原發(fā)腫瘤中每個(gè)突變的VAF差異很大,以及僅在血漿中檢測(cè)到一個(gè)突變(R132C),該患者存在同型合子IDH1突變克隆的可能性很小。如果該腫瘤細(xì)胞克隆為同型合子,具有兩個(gè)不同的IDH1突變等位基因(R132H和R132C),則兩個(gè)突變?cè)谀[瘤和血漿中的VAF應(yīng)相似。此外,IDH突變腫瘤需要呈雜合子,以促進(jìn)α-酮戊二酸向腫瘤代謝產(chǎn)物(R)-2HG的轉(zhuǎn)換[5,7]。因此,在腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)的患者中,更可能的是R132H突變屬于優(yōu)勢(shì)IDH1突變克隆,R132C對(duì)應(yīng)于一個(gè)亞克隆細(xì)胞 Population。據(jù)腫瘤基因檢測(cè)，腫瘤基因解碼的研究是一份報(bào)道在膠質(zhì)瘤患者組織中檢測(cè)到兩個(gè)共存的IDH1突變,也是一份檢測(cè)到7年前在組織中亞克隆檢測(cè)到的IDH1突變?cè)谘獫{中的延遲出現(xiàn)?？紤]到膠質(zhì)瘤中不同IDH1位點(diǎn)或IDH1和IDH2位點(diǎn)的IDH共存突變是極其罕見的事件,腫瘤基因檢測(cè)的發(fā)現(xiàn)對(duì)該領(lǐng)域具有特殊意義。的確,Hartmann等人在對(duì)747例IDH突變型膠質(zhì)瘤的研究中,僅發(fā)現(xiàn)4例患者存在兩個(gè)IDH1和IDH2共存突變,而沒有發(fā)現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)IDH1共存突變的病例。

腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)的研究受樣本量小和部分患者采血次數(shù)少的限制,這可能檢測(cè)到一些患者的IDH1突變。此外,腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)無法研究膠質(zhì)瘤中約10-15%的IDH2基因的ctDNA突變,盡管原發(fā)腫瘤中沒有患者攜帶IDH2突變。大多數(shù)(83%)在NGS-IDH1突變患者中進(jìn)行的ctDNA陰性樣本是在疾病穩(wěn)定或響應(yīng)期獲得的,這可能解釋了未檢測(cè)到IDH1突變ctDNA。由于本研究中用于腫瘤組織和血漿中IDH突變分析的方法不同,如果比較NGS和BEAMing在原發(fā)腫瘤中檢測(cè)IDH突變的性能將非常有趣。與之前在IDH突變白血病中進(jìn)行的研究相似,未來研究應(yīng)該研究高敏感的BEAMing方法是否可以檢測(cè)腫瘤組織中共存的克隆或亞克隆IDH突變,以及NGS未能檢測(cè)但可能幫助更正確突變分型的其他基因的共存突變。由于IDH突變發(fā)生在致癌過程的非常早期,并且突變IDH可能作為致癌基因促進(jìn)其他致癌基因的遺傳不穩(wěn)定性和突變,從而在IDH突變與野生型腫瘤之間建立明確不同的分子譜,研究血漿中的其他共存突變以提高腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)研究液體活檢的診斷精度將非常意議。的確,擴(kuò)大研究的基因數(shù)量也可能提高檢測(cè)更多膠質(zhì)瘤患者腫瘤突變的可能性;這可能實(shí)現(xiàn)疾病監(jiān)測(cè)和腫瘤異質(zhì)性評(píng)估的更精細(xì)方法。賊后,腫瘤靶向藥物基因檢測(cè)無法在采血同時(shí)獲得腦脊液樣本,以研究腫瘤、腦脊液和血漿之間的相關(guān)性。