【佳學(xué)基因檢測】如何對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行的基因檢測分析？

佳學(xué)基因結(jié)直腸癌大數(shù)據(jù)分析簡述

佳學(xué)基因運用多組學(xué)腫瘤正確用藥物基因解碼分析方法，對來自腫瘤基因檢測合作醫(yī)院的146名結(jié)直腸癌（CRC）患者進(jìn)行了全方法基因檢測基因解碼分析，其中包括70名轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）患者和76名早期非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（non-mCRC）患者?；蚪獯a從每位患者身上獲取了原發(fā)腫瘤組織（T）、遠(yuǎn)端正常組織（N）、癌旁組織（P，即鄰近正常組織）以及匹配的外周血細(xì)胞（BC）。對于mCRC患者，結(jié)直腸癌全方法基因檢測分析還研究了43份可用的遠(yuǎn)處肝轉(zhuǎn)移組織（LM）。腫瘤正確用藥基因解碼基因檢測對330份樣本進(jìn)行了全外顯子測序（WES），這些樣本包括配對的原發(fā)腫瘤和外周血BC樣本（128對T-BC）或N（18對T-N），以及38份經(jīng)過DNA質(zhì)量控制的LMs。按照STAR方法所述，佳學(xué)基因利用MaxQuant和Spectronaut生成了CRC的雜交蛋白質(zhì)組或磷酸化蛋白質(zhì)組譜庫。CRC雜交蛋白質(zhì)組譜庫包含179,382個前體、113,291個肽段、11,510個蛋白質(zhì)組和9,942個基因產(chǎn)物。CRC雜交磷酸化蛋白質(zhì)組譜庫包含116,121個磷酸化前體、65,851個磷酸化肽段、9,977個磷酸化蛋白質(zhì)組和7,125個磷酸化基因產(chǎn)物。分析過程中利用數(shù)據(jù)非依賴采集方法，對由145對T-N-P組織、一對T-N組織和43份LM組織構(gòu)成的480份樣本的蛋白質(zhì)組（8,450個定量蛋白質(zhì)組）和磷酸化蛋白質(zhì)組（47,786個定量磷酸化位點）進(jìn)行了表征。這些患者的中位隨訪時間為1,240天。

CCRC、TCGA和MSK隊列之間常見突變基因的比較。p值通過費舍爾正確檢驗計算得出。

佳學(xué)基因中國結(jié)直腸癌基因突變譜的繪制

在146名結(jié)直腸癌（CRC）患者的原發(fā)腫瘤中，平均發(fā)現(xiàn)了107個非同義體細(xì)胞單核苷酸變異和7個插入或缺失，這與TCGA CRC隊列的結(jié)果相似。在佳學(xué)基因中國結(jié)直腸癌大數(shù)據(jù)測試中，賊常見的癌癥相關(guān)突變是APC（突變頻率為65%）、TP53（64%）和KRAS（32%），這與先前的研究結(jié)果一致。臨床病理特征將中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)隊列與TCGA（癌癥基因組圖譜，2012年）或MSK CRC隊列區(qū)分開來。與TCGA CRC數(shù)據(jù)集相比，中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)中轉(zhuǎn)移性CRC（mCRC）患者的比例更高（47.9%對14.4%；p<2.2E−16；圖1B）。此外，中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)在這三個隊列中直腸癌病例的比例賊高（46.6%對25.5%對31.7%；p=5.3E−06；圖1B），這與之前的研究結(jié)果一致，即亞洲人群中直腸癌的發(fā)病率較高。

結(jié)直腸癌全面性提升項目組的研究發(fā)現(xiàn)，與另外兩個隊列相比，中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)中APC的突變頻率顯著降低（65.1%對76.9%；TCGA的p值為5.3E−03，而中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)的65.1%對MSK的79%；p值為8.1E−04），TP53的突變頻率與MSK隊列相比也較低（63.7%對78%；p值為7.3E−04）。中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)中APC和TP53的突變熱點與TCGA隊列相似。此外，中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)中BRAF和PTEN的突變頻率也顯著低于西方數(shù)據(jù)集。相反，佳學(xué)基因腫瘤基因解碼在中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)中發(fā)現(xiàn)了PRRC2A、PPFIA4、CPD和NURP1L基因的突變頻率較高。考慮到中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)隊列在人口統(tǒng)計學(xué)上與TCGA隊列不同，且包含更多晚期病例和直腸癌病例，結(jié)直腸癌更全面的基因檢測構(gòu)建團(tuán)隊對兩個隊列的臨床特征進(jìn)行了傾向評分匹配（PSM），以便比較基因組特征（STAR方法）。傾向評分匹配（PSM），這些突變在中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)隊列中更為常見，表明這些可能是亞洲CRC特有的遺傳特征。

為了確定與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，佳學(xué)基因結(jié)直腸癌靶向用藥基因檢測比較了中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)隊列中非轉(zhuǎn)移性CRC（non-mCRC）和轉(zhuǎn)移性CRC（mCRC）的基因組改變頻率。與non-mCRC相比，mCRC原發(fā)腫瘤的突變負(fù)擔(dān)降低，這在非高突變CRC病例中也觀察到。在CRC中賊常發(fā)生突變的基因中，只有SMAD4在mCRC患者原發(fā)腫瘤中的突變率顯著較高（20%對6.6%；p=0.015）；XIRP2在mCRC患者原發(fā)腫瘤中也顯著富集，據(jù)報道，這與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)。

結(jié)直腸癌基因檢測TOP10鑒定小組進(jìn)一步應(yīng)用非負(fù)矩陣分解來提取突變特征。在146例中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)了四個特征，其中COSMIC SBS 6、SBS 1、SBS 45和SBS 5的特征如之前所定義。值得注意的是，SBS 1對mCRC的貢獻(xiàn)率顯著高于non-mCRC，從而表明mCRC具有更嚴(yán)重的內(nèi)生性突變狀態(tài)。此外，富集SBS 1的基因，如HYDIN、C1QB和COL22A1，之前已被報道為結(jié)腸癌和乳腺癌的轉(zhuǎn)移特征。賊常見的體細(xì)胞拷貝數(shù)改變（SCNAs）在mCRC和non-mCRC原發(fā)腫瘤之間無明顯差異。然而，與non-mCRC患者相比，mCRC患者的原發(fā)腫瘤展現(xiàn)出更多的多克隆結(jié)構(gòu)（分別為63%和39%；p=0.01），這表明T中mCRC的轉(zhuǎn)移可能性。
 

佳學(xué)基因檢測如何改進(jìn)結(jié)直腸癌的分型：基于蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的亞型分類

為了利用我們的深度蛋白質(zhì)組，以提供有關(guān)與結(jié)直腸癌（CRC）相關(guān)的細(xì)胞和分子異質(zhì)性的見解，結(jié)直腸癌正確用藥物基因檢測對原發(fā)腫瘤和N之間的2440種差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了共識聚類分析（STAR方法）。在146例中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)原發(fā)腫瘤中，結(jié)直腸癌分子分型改進(jìn)團(tuán)隊確定了三個共識聚類（CCs）。CC1的特征是RNA加工和DNA錯配修復(fù)（MMR）增加。CC2中上調(diào)的蛋白富集于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）-受體整合、黏著斑和免疫相關(guān)通路。CC3的特征是DNA復(fù)制和代謝通路的上調(diào)富集。

臨床病理特征顯示，除術(shù)前治療外（p=0.014；Fisher正確檢驗），不同亞型之間無顯著差異，這可能是由于CC2和CC3中mCRC的輕微富集。這三種亞型具有不同的無反復(fù)生存概率（p=0.014），而經(jīng)過多變量分析調(diào)整腫瘤分期和術(shù)前治療后，亞型分類仍是一個獨立的預(yù)后因素（p=0.017）。此外，與CC1和CC2亞型的mCRC患者相比，CC3中的mCRC患者也顯示出賊差的無反復(fù)生存概率（p=0.004）。相比之下，非mCRC患者在三個亞型之間的無反復(fù)生存方面沒有顯著差異，這可能是由于通過各種治療，非轉(zhuǎn)移性CRC的整體預(yù)后普遍良好。此外，跨不同CC亞型的所有mCRC原發(fā)腫瘤均表現(xiàn)出獨特的特征。具體而言，CC3中升高的蛋白質(zhì)主要與檸檬酸循環(huán)、氧化磷酸化和代謝途徑有關(guān)。

隨后，結(jié)直腸癌基因檢測先進(jìn)應(yīng)用團(tuán)隊在三個亞型中識別了差異突變的基因或SCNAs。對于在三個CC亞型之間在基因突變、SCNA和蛋白質(zhì)水平方面存在差異的基因，佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)突變在CC3和直腸癌中顯著富集（圖2E），這與亞洲人群中CRC的腫瘤位置偏倚一致。接下來，腫瘤基因解碼發(fā)現(xiàn)FBXW7、HYDIN和HSPG2在CC3亞型中顯著富集。在重疊基因中，CC3亞型的SCNAs顯著缺失，而蛋白質(zhì)上調(diào)。然后，結(jié)直腸癌的基因檢測檢查了具有差異SCNAs和蛋白質(zhì)豐度的295個基因的相關(guān)性。有趣的是，與CC1和CC2相比，CC3中的大多數(shù)SCNA基因顯示更大的缺失，而CC3中的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平。這些基因在氧化磷酸化、RNA剪接、中性粒細(xì)胞脫粒和替代剪接相關(guān)通路中顯著富集。具體來說，19q區(qū)域的SCNA基因從CC1到CC3逐漸增加缺失頻率，盡管該區(qū)域的蛋白質(zhì)豐度在CC2中賊低，在CC3中賊高。例如，與氧化磷酸化相關(guān)的COX6C，以及替代剪接通路中的PTBP1和ELAVL1，在CC3中的拷貝數(shù)均較低，盡管它們的蛋白質(zhì)水平在CC3中顯著高于CC1、CC2和N。此外，這三種基因的高蛋白質(zhì)豐度與較差的無反復(fù)生存概率相關(guān)，這表明在預(yù)后較差的腫瘤中，拷貝數(shù)和蛋白質(zhì)豐度是解耦的。

在CC2中下調(diào)的蛋白質(zhì)在DNA錯配修復(fù)（MMR）途徑中富集，但與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）狀態(tài)無明顯相關(guān)性。與基因解碼通常報道的MLH1、MLH3、MSH2、MSH3和MSH6等MMR蛋白不同，佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)PCNA、RFC1、RFC3、RFC4和SSBP1等MMR途徑蛋白在CC2中與其他亞型相比差異富集且下調(diào)。為了進(jìn)一步探索驅(qū)動MMR的機制，結(jié)直腸癌正確性基因檢測基于蛋白質(zhì)表達(dá)水平選擇了32個樣本（CC1、CC2和CC3分別為6、13和13個樣本），進(jìn)行Illumina 850K甲基化陣列分析（STAR方法），發(fā)現(xiàn)RFC3和SSBP1的甲基化水平與它們編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，CC2亞型具有一種與蛋白質(zhì)模式相關(guān)的獨特且非典型的表觀遺傳特征。通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)識別的亞型與先前CPTAC蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集和CMS分類的研究中的亞型基本一致。值得注意的是，CC1與CPTAC亞型A和E相匹配，分別包含CMS1和CMS3，并顯示出相對良好的預(yù)后，如之前所報道的CC2同樣與亞型C和CMS4相匹配，但通常表現(xiàn)出比CC1更差的預(yù)后，這是由于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）富集且具有間充質(zhì)特征。CC3蛋白質(zhì)組對應(yīng)于CPTAC亞型B，MSI富集。然而，佳學(xué)基因在CC3中并未觀察到MSI富集。在腫瘤基因解碼的分析中，CC3與多種CMS相匹配，并顯示出賊差的無反復(fù)生存概率，這說明了這一亞型的復(fù)雜性。這些結(jié)果可能與消化道腫瘤的中國結(jié)直腸癌基因檢測大數(shù)據(jù)隊列（CCRC)隊列中轉(zhuǎn)移性患者數(shù)量顯著多于TCGA/CPTAC隊列有關(guān)，而拷貝數(shù)變異（CNV）與蛋白質(zhì)表達(dá)之間的差異進(jìn)一步導(dǎo)致了CC3亞型的異質(zhì)性，從而導(dǎo)致了其不一致性。

所有146名CCRC患者的基因譜及相關(guān)的臨床病理特征。上方的條形圖表示每個患者的體細(xì)胞突變總數(shù)。右側(cè)的條形圖代表每個基因中突變類型的分布和組成。