【佳學基因檢測】極微量(單細胞擴增)基因檢測程序及步驟
試劑來源:
佳學基因致力于從多種來源的DNA樣品中正確測定人體的基因序列變化,并對這些變化的生命密碼進行解讀和分析。是先進基因信息檢測及解碼技術的供應者,提供各種樣本純化和分析的方法和產品。先進的、高質量的產品和服務確保了從樣本獲得分析結果。
技術優(yōu)勢
對單個細胞或有限的樣本進行高度均一的全基因組擴增(WGA)
采用多重置換擴增技術對基因組位點進行無偏差的擴增
適用于二代測序等新技術應用
產量穩(wěn)定,可達40 µg(產物平均長度大于>10 kb)
可用于癌癥、干細胞或宏觀基因組學(metagenomics)研究
很多研究人員使用二代測序儀器對生物樣本的DNA序列進行分析和基因分型,但經常受限于有限的樣本量。佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術可均一的擴增單個細胞(1至1000個細菌或腫瘤細胞)或純化的基因組DNA,能夠覆蓋基因組所有位點。另有專用于干血或新鮮或冷凍的組織樣本的實驗方案。所有緩沖液和試劑生產都經過嚴格控制的流程,避免污染DNA,確保每次實驗獲得高效的結果。該產品采用多重置換擴增(MDA)技術,對所有基因組位點進行無偏差的擴增。與基于PCR的全基因組擴增技術相比,該技術具有更好的擴增高保真度,避免出現(xiàn)假陽性或假陰性信號。
Performance
覆蓋基因組所有位點,十分適用于二代測序和其他下游應用
佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術擴增的DNA平均長度大于10 kb,并且覆蓋所有基因組位點。該產品已經過驗證,適用于二代測序、基于芯片技術的比較基因組雜交(aCGH)和real-time PCR應用等多種下游分析。使用該產品無需單獨進行PCR擴增,減少了手動操作,獲得的產物長度PCR方法更長(參見"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods")。用擴增產物進行二代測序,獲得高品質結果。這表明該試劑盒的位點覆蓋率大,錯配率低,其擴增的DNA(甚至從單一細菌細胞中擴增的DNA)能夠與純化獲得的基因組DNA相媲美(參見"Comparable NGS results")。另有研究對人類常染色體和X染色體上的多個標記物進行了分析,三個獨立的實驗均顯示:基因組的所有位點被成功擴增,沒有遺漏任何一個位點(參見"Complete genome coverage")。
佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術的表現(xiàn)優(yōu)于其他供應商的試劑盒
其他供應商的試劑盒基于PCR技術進行全基因組擴增,獲得的產物片段較短,帶有PCR引物序列,可能影響下游應用?;赑CR的全基因組擴增容易出現(xiàn)錯誤,會導致堿基對突變、STR的減少或增多,使用低保真Taq DNA聚合酶會導致位點缺失。相反,REPLI-g Single Cell Kit能夠進行高度均一的全基因組擴增,位點偏差小。對四個試劑盒進行了檢測,其中兩個利用多重置換擴增技術(包括REPLI-g Single Cell Kit),另外兩個利用PCR技術。采用單一細胞擴增實驗方案對所有試劑盒進行序列位點檢測。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供應商的試劑盒都出現(xiàn)了位點的遺漏(參見"Unbiased DNA amplification from a single cell")。
Principle
佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術含有REPLI-g sc Polymerase,這是一種優(yōu)化的新型高保真Phi 29聚合酶。該試劑盒采用多重置換擴增技術擴增復雜的基因組DNA,溫和的堿孵育能夠避免DNA片段化,促進對所有位點的無偏差擴增。該試劑盒十分適用于分離的腫瘤細胞或細菌細胞等單一細胞,能夠擴增獲得高產量DNA(參見表1)。此外,該試劑盒還配有專用于鮮血或干血、新鮮或冷凍組織的實驗方案,可用于多種研究樣本。常規(guī)DNA產量可達40 µg,對模板的起始量要求低,因此進行后續(xù)遺傳分析時無需檢測DNA濃度。REPLI-g Single Cell Kit的擴增產物平均長度超過10 kb,且覆蓋所有位點,適合于多種應用,包括二代測序、基于芯片技術的比較基因組雜交、焦磷酸測序和real-time PCR分析(參見表2)。
擴增原理
佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術采用等溫基因組擴增技術,即多重置換擴增(MDA)。六聚體與變性DNA隨機結合,然后在等溫條件下,在優(yōu)化的Phi 29聚合酶作用下,發(fā)生鏈置換合成反應。每個置換后的單鏈作為模板,與引物結合,可擴增獲得高產量DNA(參見"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology")。Phi 29聚合酶為噬菌體衍生酶,具有3'→5'引物外切酶活性(校正活性),其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在優(yōu)化的REPLI-g Single Cell緩沖液體系中,能夠輕松的打開發(fā)卡結構等二級結構,因此可促進擴增時聚合酶正常工作??蓴U增獲得長達100 kb的DNA片段(參見"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase")。
細胞裂解和DNA的堿變性
基因組DNA在用于酶促擴增反應前必須經過變性,而這一變性過程通常使用高溫或高pH值(強堿)孵育。佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術采用溫和的堿孵育,在細胞裂解、DNA變性的同時,確保DNA片段化程度小,不產生堿基突變。因此擴增獲得的DNA完整度高,產物長度長,覆蓋位點多(參見"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation")。
高效去除可檢測到的DNA污染
佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術中的所有組分都經過了獨特的去污染流程,避免擴增產物被污染。在標準化流程中,對緩沖液和試劑進行紫外線照射,確保其不會污染DNA(參見"Innovative decontamination procedure")。紫外線照射后,對試劑盒的所有組分進行嚴格的質量控制,確保其性能。
Procedure
簡單的單管操作
佳學基因極微量DNA全基因組擴增技術t可對單一細胞或有限的樣本進行簡便、高效、正確的全基因組擴增。反應體系構建十分便利、高效,僅需15分鐘左右的手動操作(參見"REPLI-g Single Cell Kit procedure")。專用的緩沖液和試劑可對單一細胞、有限的組織材料、或純化的DNA進行擴增,產量高、位點覆蓋率大(參見表3)。REPLI-g技術擴增獲得的DNA可在–20°C長期儲存(參見"Consistent long-term stability")。
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