【佳學(xué)基因檢測】極微量（單細(xì)胞擴(kuò)增）基因檢測程序及步驟

試劑來源：

佳學(xué)基因致力于從多種來源的DNA樣品中正確測定人體的基因序列變化，并對這些變化的生命密碼進(jìn)行解讀和分析。是先進(jìn)基因信息檢測及解碼技術(shù)的供應(yīng)者，提供各種樣本純化和分析的方法和產(chǎn)品。先進(jìn)的、高質(zhì)量的產(chǎn)品和服務(wù)確保了從樣本獲得分析結(jié)果。

技術(shù)優(yōu)勢

對單個(gè)細(xì)胞或有限的樣本進(jìn)行高度均一的全基因組擴(kuò)增（WGA）

采用多重置換擴(kuò)增技術(shù)對基因組位點(diǎn)進(jìn)行無偏差的擴(kuò)增

適用于二代測序等新技術(shù)應(yīng)用

產(chǎn)量穩(wěn)定，可達(dá)40 µg（產(chǎn)物平均長度大于>10 kb）

可用于癌癥、干細(xì)胞或宏觀基因組學(xué)（metagenomics）研究

很多研究人員使用二代測序儀器對生物樣本的DNA序列進(jìn)行分析和基因分型，但經(jīng)常受限于有限的樣本量。佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)可均一的擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞（1至1000個(gè)細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞）或純化的基因組DNA，能夠覆蓋基因組所有位點(diǎn)。另有專用于干血或新鮮或冷凍的組織樣本的實(shí)驗(yàn)方案。所有緩沖液和試劑生產(chǎn)都經(jīng)過嚴(yán)格控制的流程，避免污染DNA，確保每次實(shí)驗(yàn)獲得高效的結(jié)果。該產(chǎn)品采用多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)，對所有基因組位點(diǎn)進(jìn)行無偏差的擴(kuò)增。與基于PCR的全基因組擴(kuò)增技術(shù)相比，該技術(shù)具有更好的擴(kuò)增高保真度，避免出現(xiàn)假陽性或假陰性信號。

Performance

覆蓋基因組所有位點(diǎn)，十分適用于二代測序和其他下游應(yīng)用

佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增的DNA平均長度大于10 kb，并且覆蓋所有基因組位點(diǎn)。該產(chǎn)品已經(jīng)過驗(yàn)證，適用于二代測序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交（aCGH）和real-time PCR應(yīng)用等多種下游分析。使用該產(chǎn)品無需單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，減少了手動(dòng)操作，獲得的產(chǎn)物長度PCR方法更長（參見"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods"）。用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代測序，獲得高品質(zhì)結(jié)果。這表明該試劑盒的位點(diǎn)覆蓋率大，錯(cuò)配率低，其擴(kuò)增的DNA（甚至從單一細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增的DNA）能夠與純化獲得的基因組DNA相媲美（參見"Comparable NGS results"）。另有研究對人類常染色體和X染色體上的多個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行了分析，三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)均顯示：基因組的所有位點(diǎn)被成功擴(kuò)增，沒有遺漏任何一個(gè)位點(diǎn)（參見"Complete genome coverage"）。

佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)的表現(xiàn)優(yōu)于其他供應(yīng)商的試劑盒

其他供應(yīng)商的試劑盒基于PCR技術(shù)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物片段較短，帶有PCR引物序列，可能影響下游應(yīng)用?；赑CR的全基因組擴(kuò)增容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，會(huì)導(dǎo)致堿基對突變、STR的減少或增多，使用低保真Taq DNA聚合酶會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)缺失。相反，REPLI-g Single Cell Kit能夠進(jìn)行高度均一的全基因組擴(kuò)增，位點(diǎn)偏差小。對四個(gè)試劑盒進(jìn)行了檢測，其中兩個(gè)利用多重置換擴(kuò)增技術(shù)（包括REPLI-g Single Cell Kit），另外兩個(gè)利用PCR技術(shù)。采用單一細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方案對所有試劑盒進(jìn)行序列位點(diǎn)檢測。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供應(yīng)商的試劑盒都出現(xiàn)了位點(diǎn)的遺漏（參見"Unbiased DNA amplification from a single cell"）。

Principle

佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)含有REPLI-g sc Polymerase，這是一種優(yōu)化的新型高保真Phi 29聚合酶。該試劑盒采用多重置換擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA，溫和的堿孵育能夠避免DNA片段化，促進(jìn)對所有位點(diǎn)的無偏差擴(kuò)增。該試劑盒十分適用于分離的腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞等單一細(xì)胞，能夠擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA（參見表1）。此外，該試劑盒還配有專用于鮮血或干血、新鮮或冷凍組織的實(shí)驗(yàn)方案，可用于多種研究樣本。常規(guī)DNA產(chǎn)量可達(dá)40 µg，對模板的起始量要求低，因此進(jìn)行后續(xù)遺傳分析時(shí)無需檢測DNA濃度。REPLI-g Single Cell Kit的擴(kuò)增產(chǎn)物平均長度超過10 kb，且覆蓋所有位點(diǎn)，適合于多種應(yīng)用，包括二代測序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交、焦磷酸測序和real-time PCR分析（參見表2）。

擴(kuò)增原理

佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)采用等溫基因組擴(kuò)增技術(shù)，即多重置換擴(kuò)增（MDA）。六聚體與變性DNA隨機(jī)結(jié)合，然后在等溫條件下，在優(yōu)化的Phi 29聚合酶作用下，發(fā)生鏈置換合成反應(yīng)。每個(gè)置換后的單鏈作為模板，與引物結(jié)合，可擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA（參見"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology"）。Phi 29聚合酶為噬菌體衍生酶，具有3'→5'引物外切酶活性（校正活性），其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在優(yōu)化的REPLI-g Single Cell緩沖液體系中，能夠輕松的打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)，因此可促進(jìn)擴(kuò)增時(shí)聚合酶正常工作?？蓴U(kuò)增獲得長達(dá)100 kb的DNA片段（參見"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase"）。

細(xì)胞裂解和DNA的堿變性 

基因組DNA在用于酶促擴(kuò)增反應(yīng)前必須經(jīng)過變性，而這一變性過程通常使用高溫或高pH值（強(qiáng)堿）孵育。佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)采用溫和的堿孵育，在細(xì)胞裂解、DNA變性的同時(shí)，確保DNA片段化程度小，不產(chǎn)生堿基突變。因此擴(kuò)增獲得的DNA完整度高，產(chǎn)物長度長，覆蓋位點(diǎn)多（參見"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation"）。

高效去除可檢測到的DNA污染

佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)中的所有組分都經(jīng)過了獨(dú)特的去污染流程，避免擴(kuò)增產(chǎn)物被污染。在標(biāo)準(zhǔn)化流程中，對緩沖液和試劑進(jìn)行紫外線照射，確保其不會(huì)污染DNA（參見"Innovative decontamination procedure"）。紫外線照射后，對試劑盒的所有組分進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保其性能。

Procedure

簡單的單管操作

佳學(xué)基因極微量DNA全基因組擴(kuò)增技術(shù)t可對單一細(xì)胞或有限的樣本進(jìn)行簡便、高效、正確的全基因組擴(kuò)增。反應(yīng)體系構(gòu)建十分便利、高效，僅需15分鐘左右的手動(dòng)操作（參見"REPLI-g Single Cell Kit procedure"）。專用的緩沖液和試劑可對單一細(xì)胞、有限的組織材料、或純化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)量高、位點(diǎn)覆蓋率大（參見表3）。REPLI-g技術(shù)擴(kuò)增獲得的DNA可在–20°C長期儲存（參見"Consistent long-term stability"）。

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