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【佳學(xué)基因檢測】第三代測序是高通量測序嗎?

【佳學(xué)基因】第三代測序是高通量測序嗎? 1.PacBio SMRT單分子測序技術(shù) Pacific Biosciences于2004年成立,2010年納斯達克上市,2011年P(guān)acBioRS發(fā)布。 以PacBio測序為代表的第三代基因測序技術(shù)逐漸應(yīng)用到多個科研領(lǐng)域。該平臺利于單分子實時測序技術(shù),又稱作SMRT(Single Molecule Real-Time)測序,基于納米小孔的單分子讀取技術(shù),無需擴增即可快速完成序列讀取。 建庫 因為測序讀長很長,因此

佳學(xué)基因檢測】第三代測序是高通量測序嗎?

1.PacBio SMRT單分子測序技術(shù)

Pacific Biosciences于2004年成立,2010年納斯達克上市,2011年P(guān)acBioRS發(fā)布。

以PacBio測序為代表的第三代基因測序技術(shù)逐漸應(yīng)用到多個科研領(lǐng)域。該平臺利于單分子實時測序技術(shù),又稱作SMRT(Single Molecule Real-Time)測序,基于納米小孔的單分子讀取技術(shù),無需擴增即可快速完成序列讀取。

建庫

因為測序讀長很長,因此可以制備大片段(3-10kb)文庫;不同于其他二代測序文庫,該文庫兩端分別連接環(huán)狀單鏈,單鏈兩端又與雙鏈正負鏈連接,得到類似啞鈴的結(jié)構(gòu),稱為SMRT Bell。

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測序

SMRT Cell芯片含有數(shù)百萬個納米級的零模波導(dǎo)孔(zero-mode wave guides, ZMWs),ZMW是一個直徑只有10~50nm的孔,引物在模板的單鏈環(huán)部位退火后,這個雙鏈部位就可以結(jié)合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。

每個ZMW都能夠包含一個DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進行單分子測序,4種dNTP帶有不同的熒光標(biāo)記。當(dāng)激光打在ZMW底部時,只能照亮很小的區(qū)域,DNA聚合酶就被固定在這個區(qū)域。

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只有在這個區(qū)域內(nèi),堿基攜帶的熒光基團被激活從而被檢測到。當(dāng)DNA合成進行時,下一個堿基進行延伸,上一個dNTP上的熒光基團就會被切除,高效了檢測的連續(xù)性。

不同的堿基會發(fā)出不同的光,此時根據(jù)光的波長及峰值便可判斷堿基類型。

2.納米孔測序技術(shù)

2005年,牛津納米孔科技有限公司(Oxford Nanopore Technologies)成立,致力于納米孔測序技術(shù)的商業(yè)轉(zhuǎn)化。2014年Nano space單分子測序技術(shù)發(fā)布。

牛津納米孔公司開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同,它是基于電信號而不是光信號。

納米孔測序技術(shù)的核心是一種整合了多個跨膜通道蛋白(即納米孔蛋白)的多聚物膜。通過在膜兩側(cè)施加電壓從而產(chǎn)生穩(wěn)定的穿過納米孔的電流。當(dāng)有其他物體穿過納米孔時,會影響電流的大小,從而產(chǎn)生可識別的電信號的變化。

測序時,DNA雙鏈在馬達蛋白的牽引下解螺旋為單鏈DNA,并穿過納米孔蛋白(也叫Reader蛋白)。由于ATCG四種堿基結(jié)構(gòu)和大小的差異,會使電流產(chǎn)生特征性離子電流變化,通過識別這種電信號的變化,從而達到讀取堿基序列的目的。

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不同型號的納米孔測序儀原理非常一致,其核心均為納米孔測序芯片。常規(guī)的納米孔測序芯片整合512個測序通道,每個測序通道包含四個納米孔,官方數(shù)據(jù)顯示單張芯片不間斷測序48h,可產(chǎn)生20-30G的數(shù)據(jù)量。

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二代測序的出現(xiàn)極大地解決了通量問題,在大幅提高測序速度和正確性的同時大大降低了測序成本,但閱讀長度相對較短。而以單分子測序為主要特征的三代測序,正朝著單分子、長讀長、低成本、小型化的方向發(fā)展,實現(xiàn)了測序領(lǐng)域的又一次變革。

 

 

(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)
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