【佳學(xué)基因檢測(cè)】scRNAseq在基因解碼、基因檢測(cè)中的作用

scRNAseq導(dǎo)讀

scRNAseq是一種基因解碼技術(shù)，其主要作用在于可以揭示過(guò)去被認(rèn)為是單一生理過(guò)程、單一組織的異質(zhì)性。佳學(xué)基因等基因信息分析機(jī)構(gòu)利用單細(xì)胞測(cè)序可以將人體基因序列的變化與人體的發(fā)育過(guò)程、生理過(guò)程和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)方式和調(diào)節(jié)途徑的揭示。是否采用了單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果用于指導(dǎo)致病基因的鑒定是基因解碼與基因檢測(cè)的又一個(gè)本質(zhì)區(qū)別。 

單細(xì)胞測(cè)序可以揭示哪些基因檢測(cè)不能提供的結(jié)果？

人類各種組織之間細(xì)胞的類型，狀態(tài)和相互作用差異巨大。而單細(xì)胞RNA測(cè)序（snRNA-seq）技術(shù)提供了在單細(xì)胞水平觀測(cè)基因表達(dá)的方法，可以更好地研究這些組織及其中存在的不同類型的細(xì)胞。

這一先進(jìn)且激動(dòng)人心的技術(shù)可被用于：

研究一個(gè)組織中到底存在哪些種類的細(xì)胞

識(shí)別未知或少見的細(xì)胞類型或狀態(tài)

闡明在分化過(guò)程或時(shí)間及狀態(tài)變化中基因表達(dá)的改變

找出在不同條件下（如加藥組和疾病組）在某一特定類型的細(xì)胞中差異表達(dá)的基因

探究一種細(xì)胞類型之間基因表達(dá)的變化，同時(shí)納入空間，調(diào)控和/或蛋白質(zhì)信息

單細(xì)胞測(cè)序中解決一些較常見問(wèn)題的方法包括：

單細(xì)胞RNA測(cè)序分析中面臨的挑戰(zhàn)

在單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）出現(xiàn)之前，轉(zhuǎn)錄組分析是使用批量RNA測(cè)序（bulk RNA-seq）進(jìn)行的，這是一種比較細(xì)胞基因表達(dá)平均值 (averages of cellular expression)的直接方法。如果要尋找疾病的生物學(xué)標(biāo)志物 (disease biomarkers)，或者不關(guān)心樣本中的細(xì)胞異質(zhì)性，這可能是賊好的方法。

雖然批量RNA測(cè)序可以探索不同條件（如加藥或疾?。┲g基因表達(dá)的差異，但在細(xì)胞水平上的差異并沒有被充分挖掘。例如，在下圖的展示中，如果進(jìn)行批量（bulk）分析（左），我們將無(wú)法檢測(cè)到基因A和基因B表達(dá)之間的正確關(guān)系。但是，如果我們按照細(xì)胞類型或細(xì)胞狀態(tài)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)分群，我們可以看到基因之間的正確關(guān)系。

探究異質(zhì)性 (Studying heterogeneity)

譜系路徑分析 (Lineage tracing study)

隨機(jī)基因表達(dá)研究 (Stochastic gene expression study)

盡管單細(xì)胞RNA測(cè)序能夠獲得在細(xì)胞水平上的基因表達(dá)，但樣本制備和建庫(kù)成本更高，分析也更復(fù)雜，更難解讀。單細(xì)胞RNA測(cè)序分析的復(fù)雜性包括：

數(shù)據(jù)量巨大

每個(gè)細(xì)胞測(cè)序深度低

跨細(xì)胞/樣本的生物學(xué)誤差

跨細(xì)胞/樣本的技術(shù)性誤差

數(shù)據(jù)量巨大

單細(xì)胞RNA測(cè)序項(xiàng)目的表達(dá)量數(shù)據(jù)代表了成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中上萬(wàn)或數(shù)十萬(wàn)條讀取 (reads)，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)要大得多，需要更多的內(nèi)存來(lái)分析，更大的硬盤來(lái)存儲(chǔ)，以及更多的時(shí)間來(lái)運(yùn)行分析。

每個(gè)細(xì)胞測(cè)序深度低

對(duì)于基于油滴（droplet）的單細(xì)胞RNA測(cè)序方法，測(cè)序的深度較淺，通常每個(gè)細(xì)胞只能檢測(cè)到10-50%的轉(zhuǎn)錄組。這導(dǎo)致細(xì)胞中許多基因顯示為零計(jì)數(shù)。然而，在一個(gè)特定的細(xì)胞中，一個(gè)基因的零計(jì)數(shù)可能意味著該基因沒有被表達(dá)，或者只是沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本。在細(xì)胞中，表達(dá)水平較高的基因往往具有較少的零計(jì)數(shù)。由于這一特性，許多基因在任何細(xì)胞中都不會(huì)被檢測(cè)到，細(xì)胞間的基因表達(dá)也會(huì)有很大的差異。

跨細(xì)胞/樣本的生物學(xué)誤差

我們不感興趣的生物學(xué)變異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間的基因表達(dá)跟實(shí)際的生物細(xì)胞類型或狀態(tài)更為相似或不同，從而影響細(xì)胞類型的識(shí)別。這些生物學(xué)變異（除非是實(shí)驗(yàn)研究的一部分）包括：

轉(zhuǎn)錄脈沖 (Transcriptional Bursting)：并非所有基因的基因轉(zhuǎn)錄都處于開啟狀態(tài)。捕獲時(shí)間點(diǎn)將決定每個(gè)細(xì)胞中的基因是打開還是關(guān)閉狀態(tài)。

RNA加工的不同速度 (Varying rates of RNA processing)：不同的RNA以不同的速率進(jìn)行加工。

連續(xù)或離散的細(xì)胞特征 (Continuous or discrete cell identities)：例如單個(gè)T細(xì)胞的促炎癥潛能。連續(xù)的表型通過(guò)基因表達(dá)上的變化來(lái)定義，有時(shí)很難區(qū)分表型是連續(xù)的，還是離散的。

環(huán)境刺激 (Environmental stimuli)：細(xì)胞的周邊環(huán)境可以通過(guò)空間位置、信號(hào)分子等方式影響基因的表達(dá)。

時(shí)序改變 (Temporal changes)：基本的細(xì)胞時(shí)序變化過(guò)程，例如細(xì)胞周期，可以影響單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜。

跨細(xì)胞/樣本的技術(shù)性誤差

技術(shù)來(lái)源的變異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間的基因表達(dá)因技術(shù)來(lái)源而變得更相似/不同，而不是細(xì)胞類型/狀態(tài)，這會(huì)影響細(xì)胞類型的識(shí)別。技術(shù)來(lái)源的變異包括：

不同細(xì)胞的捕獲效率 (Cell-specific capture efficiency)：不同細(xì)胞捕獲的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量不同，導(dǎo)致測(cè)序深度不同（例如，轉(zhuǎn)錄組的10-50%）。

文庫(kù)質(zhì)量 (Library quality)：降解的RNA、低活性/瀕死的細(xì)胞、大量游離的RNA、分離不好的細(xì)胞以及細(xì)胞定量不正確都會(huì)導(dǎo)致測(cè)序質(zhì)量過(guò)低。

擴(kuò)增偏差 (Amplification bias)：在建庫(kù)（library preparation）的擴(kuò)增步驟中，并非所有的轉(zhuǎn)錄本都被擴(kuò)增到相同的水平。

批次差異 (Batch effects)：批次問(wèn)題是單細(xì)胞RNA分析中的一個(gè)重要問(wèn)題，因此你可以看到由于批次問(wèn)題而導(dǎo)致的基因表達(dá)上的顯著差異。

如何知道你是否有批次問(wèn)題？

所有的RNA提取都是在同一天進(jìn)行的嗎？

所有的建庫(kù)工作都是在同一天進(jìn)行的嗎？

所有樣品的RNA提取或建庫(kù)是否由同一個(gè)人完成？

你是否對(duì)所有樣品都使用了相同的試劑？

你是否在同一地點(diǎn)進(jìn)行了RNA的提取或建庫(kù)？

如果這些答案中有一個(gè)是“不”，那么你就有批次問(wèn)題。

有關(guān)批次問(wèn)題的賊佳實(shí)踐

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中盡可能地避免產(chǎn)生批次

如果無(wú)法避免批次：

不要混淆不同批次的實(shí)驗(yàn)

請(qǐng)?jiān)诓煌沃凶霾煌悇e樣品的重復(fù)（replicates）。如果是想找出不同處理?xiàng)l件下的差異基因或者在群體水平上下結(jié)論，重復(fù)自然越多越好（當(dāng)然要大于2）。如果使用一次實(shí)驗(yàn)只建庫(kù)一次的inDrops方法，則應(yīng)替換樣本組（例如，不要先建所有疾病組的文庫(kù)，然后再建所有治療組的文庫(kù)）。

總結(jié)

雖然單細(xì)胞RNA測(cè)序是一種強(qiáng)大而深刻的從單細(xì)胞水平分析基因表達(dá)的方法，但由于存在許多挑戰(zhàn)和變異因素，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析顯得復(fù)雜且受限。

綜上所述，我們提出以下建議：

除非對(duì)解決我們感興趣的科學(xué)問(wèn)題有必要，否則不要進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序。你是否能夠使用更簡(jiǎn)單，更廉價(jià)的批量RNA測(cè)序解決你的科學(xué)問(wèn)題？也許可以使用流式細(xì)胞儀（FACS）對(duì)樣本進(jìn)行分選，以便進(jìn)行批量分析？

了解你想解決的科學(xué)問(wèn)題的各種細(xì)節(jié)。推薦的建庫(kù)方法和分析流程可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)而有所不同。

盡可能地避免技術(shù)來(lái)源的差異：

實(shí)驗(yàn)開始前與專家討論實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

同時(shí)從樣品中提取RNA

同時(shí)建庫(kù)或替換樣本組以避免批次混淆

不要混淆不同性別、年齡和批次的樣本組