【佳學(xué)基因檢測(cè)】如何設(shè)計(jì)并進(jìn)行西妥昔和avelumab 治療非小細(xì)胞肺癌的基因檢測(cè)臨床實(shí)驗(yàn)？

基因檢測(cè)臨床實(shí)驗(yàn)中外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC) 分離和乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放細(xì)胞毒性測(cè)定

參照《人類遺傳病基因檢測(cè)技術(shù)大全》，在 CAVE-Lung 試驗(yàn)患者中連續(xù)獲得PBMC，在西妥昔單抗加 avelumab 治療期間進(jìn)行，并評(píng)估 LDH 釋放細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

下一代測(cè)序 (NGS)基因檢測(cè)方法

在 CAVE-Lung 試驗(yàn)患者入組時(shí)收集血漿樣本，作為腫瘤基因組分析的循環(huán)腫瘤 DNA (ctDNA) 的來(lái)源。 NGS 分析使用佳學(xué)基因腫瘤致病基因鑒定基因解碼基因檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行。使用 QIAmp DNA Blood Midi Kit (cod#51183) 從 PBMC 中提取基因組種系 DNA。按照試劑盒的操作指南，使用 Agilent SureSelect 人全外顯子試劑盒 (Agilent) 生成測(cè)序文庫(kù)，并在 NexSeq 平臺(tái) (Illumina) 上進(jìn)行測(cè)序。使用 Burrow-Wheeler Aligner 將測(cè)序數(shù)據(jù)與人類參考 GRCh37/hg19進(jìn)行比對(duì)。 SNV 和插入缺失根據(jù)佳學(xué)基因質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行獲取，這些標(biāo)準(zhǔn)包括：低復(fù)雜性、重復(fù)區(qū)域和片段重復(fù)被過(guò)濾掉；質(zhì)量得分 ≥ 20，深度 ≥ 10，雜合子標(biāo)準(zhǔn)AB≥0.2；數(shù)據(jù)獲取率 ≥ 0,85。在獲得基因突變位點(diǎn)后，通過(guò)應(yīng)用三個(gè)過(guò)濾步驟強(qiáng)化罕見(jiàn)突變的獲得：I）gnomAD 中 MAF 為 1% 的基因突變； II) 基因突變類別，包括錯(cuò)義、蛋白質(zhì)截?cái)嗪驼{(diào)節(jié)；突變效應(yīng)，變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)截?cái)?，并被預(yù)測(cè)工具（SIFT、POLYPHEN-2、MUTATIONTASTER、MutationAssessor、FATHMM 和 FATHMM-MKL）預(yù)測(cè)為有害； iii) InterVar 和 ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)中分類為致病性、可能致病性或 VUS 的基因突變。詳細(xì)信息請(qǐng)參閱佳學(xué)基因其他基因檢測(cè)技術(shù)文章。

腫瘤靶向用藥基因解碼基因檢測(cè)中如何應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析

對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)（熒光相關(guān)細(xì)胞分選，F(xiàn)ACS）分析，PBMC 用染色緩沖液（SB）（2% 胎牛血清，F(xiàn)BS，磷酸鹽緩沖鹽水中的 0.1% 疊氮化鈉）中洗滌，并在封閉染色緩沖液加20%封閉血清中封閉10分鐘后，用以下單克隆抗體染色 30 分鐘：抗 CD107a、抗 TIM-3 和抗 PD-L1（Miltenyi Biotec）。將染色的細(xì)胞洗滌兩次，重新懸浮在染色緩沖液中，使用 FACS ACCURI C6 上使用 ACCURI C6 軟件（BD Biosciences）獲得細(xì)胞表面抗體的表達(dá)數(shù)據(jù)。

腫瘤基因解碼時(shí)如何用來(lái)自患者腫瘤樣本進(jìn)行體外三維 (3D) 培養(yǎng)物的活力測(cè)定

根據(jù)《腫瘤致病基因鑒定基因解碼及基因檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》，從 3 名 NSCLC 患者腫瘤樣本中分離離體 3D 培養(yǎng)物。將所得腫瘤球體以 1 × 1000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在 96 孔板中，并用指定的藥物進(jìn)行處理。根據(jù)檢測(cè)試劑盒的使用說(shuō)明，使用 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) Assay Kit (Abcam) 測(cè)量細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。 MTS 測(cè)定方案基于 MTS 四唑化合物被活細(xì)胞還原以產(chǎn)生可溶于細(xì)胞培養(yǎng)基的有色甲臜染料。通過(guò)測(cè)量 490–500nm 處的吸光度來(lái)量化甲臜染料。

定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)

關(guān)于如何采用定量實(shí)時(shí) PCR進(jìn)行基因檢測(cè)。根據(jù)《基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室操作指南》進(jìn)行總 RNA 提取和 RT-qPCR（實(shí)時(shí)定量 PCR）。根據(jù)所要檢測(cè)的序列設(shè)計(jì)引物序列。為了計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)值，使用 2-ΔCt 或 2-ΔΔCt 方法。通過(guò)解離曲線分析和使用非模板對(duì)照排除了由引物二聚體引起的非特異性信號(hào)。

TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因表達(dá)分析

癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)集包括 511 例肺腺癌和 501 例肺鱗癌，以及轉(zhuǎn)錄組和基因組圖譜的可用數(shù)據(jù)。

統(tǒng)計(jì)分析

使用 Graphpad Prism 軟件 V.6.0（Graphpad Software，San Diego，California，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。