在過(guò)去幾年中，第二代測(cè)序（NGS）的巨大進(jìn)步使DNA測(cè)序的成本大大降低，盡管如此，人類(lèi)全基因組測(cè)序和生物信息的解讀成本依舊很大。第二代測(cè)序?qū)θ蚪M測(cè)序和整個(gè)外顯子測(cè)序非常有效，這就需要基于靶向測(cè)序方法，也就是說(shuō)需要在測(cè)序前的樣本制備過(guò)程中，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲技術(shù)，雜交和多重PCR是賊常用的方法。

Yan Gao等發(fā)表在《自然》雜志上的研究非常更多的介紹了單分子靶向測(cè)序（SMTS），其原理是將靶向捕獲和測(cè)序結(jié)合在一個(gè)步驟中，使用高分辨率顯微鏡，在單分子水平上檢測(cè)標(biāo)記在核苷酸上的熒光探針。將目的基因的特異性引物附著在流動(dòng)池的表面上，通過(guò)與流式細(xì)胞中的引物雜交進(jìn)行測(cè)序，而不需要利用PCR富集，與第二代利用靶向測(cè)序方法相比，單分子靶向測(cè)序簡(jiǎn)化了樣品制備的復(fù)雜過(guò)程，避免了PCR擴(kuò)增引起的偏差或誤差。單分子測(cè)序技術(shù)提供了一個(gè)非常適合癌癥基因突變檢測(cè)、傳染病檢測(cè)、遺傳病癥篩查和產(chǎn)前診斷的新平臺(tái)。
 

熒光染料標(biāo)記核苷酸的選擇對(duì)于單分子檢測(cè)也是至關(guān)重要的，選擇ATTO 647N染料標(biāo)記核苷酸，對(duì)EGFR，KRAS和BRAF基因進(jìn)行測(cè)序，并合成了野生型序列和含有突變與短缺失的兩套用于測(cè)序的靶向DNA模板，并且在3'末端含有Cy3熒光染料。用532nm綠色激光激發(fā)標(biāo)記Cy3熒光染料，并收集圖像以定位靶DNA模板的位置。然后，把利用ATTO647N和DNA聚合酶修飾過(guò)的可逆終止子加入到流動(dòng)池中，重復(fù)測(cè)序循環(huán)，直到達(dá)到所需的讀取長(zhǎng)度。在四次運(yùn)行中，每個(gè)基座的平均替代誤差率為0.52％。

單分子靶向測(cè)序相對(duì)于一代、二代測(cè)序優(yōu)勢(shì)如下：
 

1、樣品制備程序簡(jiǎn)單快捷；

     2、單分子靶向測(cè)序技術(shù)成本低；

     3、周轉(zhuǎn)時(shí)間和樣品處理錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)低；  

     4、可直接對(duì)原始樣品分子序列，而不是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

賊近，牛津Nanopore公司發(fā)布了他們的測(cè)試版本的測(cè)序儀，其可能達(dá)到超過(guò)100,000個(gè)堿基對(duì)的序列長(zhǎng)度。與其他單分子測(cè)序技術(shù)相比，單分子靶向測(cè)序在一個(gè)流動(dòng)池中直接捕獲和測(cè)序目的基因是有優(yōu)勢(shì)的。