【佳學基因檢測】分子診斷與基因檢測中的DNA恒溫擴增技術及等溫擴增技術

分子診斷與基因檢測兩個重要考核指標是檢測的靈敏性和特異性。PCR是使用賊為廣泛的DNA、RNA序列復制技術，以其靈敏性、特異性得到廣泛應用，然而PCR需要反復的熱變性，無法擺脫依賴儀器設備的局限，從而限制了其在臨床現(xiàn)場檢測中的應用。

自20世紀90年代初，很多實驗室開始發(fā)展無需熱變性的恒溫擴增技術，現(xiàn)已開發(fā)出環(huán)介導等溫擴增技術、鏈替代等溫擴增技術、滾環(huán)等溫擴增技術、依賴核酸序列等溫擴增技術等技術。

環(huán)介導等溫擴增

環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本榮研公司的Notomi等于2000年首先提出來的新的核酸擴增技術。

基于該技術，榮研還曾和國內某公司引起專利糾紛。

其擴增原理是基于DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。

DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)。

先確定目標基因上的6個特異性區(qū)域F3、F2、F1、B1、B2、B3，然后依據(jù)這6 個特異性區(qū)域設計4條引物（如下圖）：

正向內引物(forwardinner primer，F(xiàn)IP)，由F1c 和F2 組成。

反向內引物(backwardinner primer，BIP)，由B1c 和B2 組成，中間均以TTTT作為間隔。

外引物F3、B3 分別由目的基因上的F3、B3 區(qū)域組成。

在LAMP 反應體系中，內引物的濃度幾倍于外引物的濃度。內引物先與模板鏈結合合成互補鏈，形成DNA雙鏈。隨后外引物再與該模板鏈結合，形成DNA雙鏈，在BstDNA 聚合酶的作用下，釋放出由內引物合成的互補鏈，該互補鏈經過一系列反應賊終形成具有啞鈴結構的DNA單鏈。

以啞鈴結構DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開口的過渡性莖環(huán)結構DNA，由內外引物引導過渡性莖環(huán)結構DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應，賊后形成具有多個莖環(huán)結構的長度不一的DNA混合物。

環(huán)介導等溫擴增的優(yōu)勢與不足

LAMP 的優(yōu)勢：

（1）擴增效率高，能夠在1h內有效的擴增1-10個拷貝的目的基因，擴增效率為普通PCR的10 倍-100 倍。

（2）反應時間短，特異性強，不需要特殊的設備。

LAMP 的不足：

（1）對引物的要求特別高。

（2）擴增產物不能用于克隆測序，只能用于判斷。

（3）由于其敏感性強，容易形成氣溶膠，造成假陽性，影響檢測結果。

鏈置換擴增

鏈置換擴增（strand displacement amplification,SDA）是美國學者Walker于1992年新穎提出的一種基于酶促反應的DNA體外等溫擴增技術。

SDA 的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩對引物、dNTP以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。

鏈置換擴增其原理是基于在靶DNA兩端帶有被化學修飾的限制性核酸內切酶識別序列，核酸內切酶在其識別位點將鏈DNA打開缺口，DNA聚合酶延伸缺口3’端并替換下一條DNA鏈。

被替換下來的DNA單鏈可與引物結合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復進行，使靶序列被高效擴增。

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鏈置換擴增技術的優(yōu)勢與不足

SDA 的優(yōu)點：

擴增效率高，反應時間短，特異性強，不需要特殊的設備。

SDA 的不足：

產物不均一，在SDA循環(huán)中總要產生一些單、雙鏈產物，用電泳法檢測時必然會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

滾環(huán)核酸擴增

滾環(huán)核酸擴增（rolling circle amplification, RCA）是通過借鑒病原生物體滾環(huán)復制DNA的方式而提出的，指在恒溫下以單鏈環(huán)狀DNA為模板，在特殊的DNA聚合酶（比如Phi29）的作用下，進行滾環(huán)式DNA合成，實現(xiàn)目標基因的擴增。

RCA可分為線性擴增與指數(shù)擴增兩種形式，線性RCA的效率可達到105倍，而指數(shù)RCA的效率可達到109倍。

簡單區(qū)分，如下圖，線性擴增a只用1條引物，指數(shù)擴增b則有2條引物。

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線性RCA 又稱為單引物RCA，一條引物結合到環(huán)狀DNA上，在DNA 聚合酶作用下被延伸，產物為單環(huán)長度數(shù)千倍的大量重復序列的線狀單鏈。

由于線性RCA的產物始終連接在起始引物上，所以信號易于固定是它的一大優(yōu)勢。

指數(shù)RCA，也被稱作超分支擴增HRCA(Hyper branched RCA)，在指數(shù)RCA中，一條引物擴增出RCA產物，第二條引物與RCA產物雜化并延伸，置換已經結合在RCA產物上的下游引物延伸鏈，反復進行延伸和置換，產生樹狀的RCA擴增產物。

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以4BaseBio公司的TruePrime滾環(huán)擴增試劑盒為例，使用TthPrimPol引物酶和Phi29DNA聚合酶，實現(xiàn)了無需添加引物即可進行擴增。

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滾環(huán)核酸擴增的優(yōu)勢與不足

RCA 的優(yōu)勢：

靈敏度高，特異性好，易操作。

RCA 的不足：

信號檢測時的背景問題。在RCA反應過程中未成環(huán)的鎖式探針和未結合探針的模板DNA或者RNA 可能產生一些背景信號。

依賴核酸序列的擴增技術

依賴核酸序列的擴增技術（nucleicacid sequence-based amplification, NASBA）是在PCR基礎上發(fā)展起來的一種新技術，是由1對帶有T7啟動子序列的引物引導的連續(xù)、等溫的核酸擴增技術，可以在2h左右將模板RNA擴增約109倍，比常規(guī)PCR法高1000倍，不需特殊的儀器。

該技術一出現(xiàn)就被用于疾病的快速診斷，目前有不少公司的RNA檢測試劑盒都用此方法。

盡管RNA的擴增也可以使用反轉錄PCR技術，NASBA相比則有自己的優(yōu)勢：可以在相對恒溫的條件下進行，相對傳統(tǒng)的PCR技術更為穩(wěn)定、正確。

反應在41攝氏度下，需要AMV（avian myeloblastosis virus）逆轉錄酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一對引物來完成。

其過程主要包括：

正向引物包含T7啟動子互補序列，反應過程中正向引物與RNA鏈結合，由AMV酶催化形成DNA-RNA雙鏈。

RNA酶H消化雜交雙鏈中的RNA,保留DNA單鏈。

在反向引物與AMV酶的作用下形成含有T7啟動子序列的DNA雙鏈。

在T7 RNA聚合酶的作用下完成轉錄過程，產生大量目的RNA。

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NASBA的優(yōu)勢：

（1）它的引物上帶有T7啟動子序列，而外來雙鏈DNA無T7啟動子序列，不可能被擴增，因此該技術具有較高的特異性和靈敏度。

（2）NASBA將反轉錄過程直接合并到擴增反應中，縮短了反應時間。

NASBA的劣勢：

（1）反應成分比較復雜。

（2）需要3種酶使得反應成本較高。