【佳學(xué)基因檢測】分子診斷與基因檢測中的DNA恒溫擴增技術(shù)及等溫擴增技術(shù)
分子診斷與基因檢測兩個重要考核指標是檢測的靈敏性和特異性。PCR是使用賊為廣泛的DNA、RNA序列復(fù)制技術(shù),以其靈敏性、特異性得到廣泛應(yīng)用,然而PCR需要反復(fù)的熱變性,無法擺脫依賴儀器設(shè)備的局限,從而限制了其在臨床現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。
自20世紀90年代初,很多實驗室開始發(fā)展無需熱變性的恒溫擴增技術(shù),現(xiàn)已開發(fā)出環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)、鏈替代等溫擴增技術(shù)、滾環(huán)等溫擴增技術(shù)、依賴核酸序列等溫擴增技術(shù)等技術(shù)。
環(huán)介導(dǎo)等溫擴增
環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本榮研公司的Notomi等于2000年首先提出來的新的核酸擴增技術(shù)。
基于該技術(shù),榮研還曾和國內(nèi)某公司引起專利糾紛。
其擴增原理是基于DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài),任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時,另一條鏈就會解離,變成單鏈。
DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶,使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)。
先確定目標基因上的6個特異性區(qū)域F3、F2、F1、B1、B2、B3,然后依據(jù)這6 個特異性區(qū)域設(shè)計4條引物(如下圖):
正向內(nèi)引物(forwardinner primer,F(xiàn)IP),由F1c 和F2 組成。
反向內(nèi)引物(backwardinner primer,BIP),由B1c 和B2 組成,中間均以TTTT作為間隔。
外引物F3、B3 分別由目的基因上的F3、B3 區(qū)域組成。
在LAMP 反應(yīng)體系中,內(nèi)引物的濃度幾倍于外引物的濃度。內(nèi)引物先與模板鏈結(jié)合合成互補鏈,形成DNA雙鏈。隨后外引物再與該模板鏈結(jié)合,形成DNA雙鏈,在BstDNA 聚合酶的作用下,釋放出由內(nèi)引物合成的互補鏈,該互補鏈經(jīng)過一系列反應(yīng)賊終形成具有啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA單鏈。
以啞鈴結(jié)構(gòu)DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開口的過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA,由內(nèi)外引物引導(dǎo)過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應(yīng),賊后形成具有多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長度不一的DNA混合物。
環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的優(yōu)勢與不足
LAMP 的優(yōu)勢:
(1)擴增效率高,能夠在1h內(nèi)有效的擴增1-10個拷貝的目的基因,擴增效率為普通PCR的10 倍-100 倍。
(2)反應(yīng)時間短,特異性強,不需要特殊的設(shè)備。
LAMP 的不足:
(1)對引物的要求特別高。
(2)擴增產(chǎn)物不能用于克隆測序,只能用于判斷。
(3)由于其敏感性強,容易形成氣溶膠,造成假陽性,影響檢測結(jié)果。
鏈置換擴增
鏈置換擴增(strand displacement amplification,SDA)是美國學(xué)者Walker于1992年新穎提出的一種基于酶促反應(yīng)的DNA體外等溫擴增技術(shù)。
SDA 的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩對引物、dNTP以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。
鏈置換擴增其原理是基于在靶DNA兩端帶有被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列,核酸內(nèi)切酶在其識別位點將鏈DNA打開缺口,DNA聚合酶延伸缺口3’端并替換下一條DNA鏈。
被替換下來的DNA單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復(fù)進行,使靶序列被高效擴增。
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鏈置換擴增技術(shù)的優(yōu)勢與不足
SDA 的優(yōu)點:
擴增效率高,反應(yīng)時間短,特異性強,不需要特殊的設(shè)備。
SDA 的不足:
產(chǎn)物不均一,在SDA循環(huán)中總要產(chǎn)生一些單、雙鏈產(chǎn)物,用電泳法檢測時必然會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。
滾環(huán)核酸擴增
滾環(huán)核酸擴增(rolling circle amplification, RCA)是通過借鑒病原生物體滾環(huán)復(fù)制DNA的方式而提出的,指在恒溫下以單鏈環(huán)狀DNA為模板,在特殊的DNA聚合酶(比如Phi29)的作用下,進行滾環(huán)式DNA合成,實現(xiàn)目標基因的擴增。
RCA可分為線性擴增與指數(shù)擴增兩種形式,線性RCA的效率可達到105倍,而指數(shù)RCA的效率可達到109倍。
簡單區(qū)分,如下圖,線性擴增a只用1條引物,指數(shù)擴增b則有2條引物。
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線性RCA 又稱為單引物RCA,一條引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上,在DNA 聚合酶作用下被延伸,產(chǎn)物為單環(huán)長度數(shù)千倍的大量重復(fù)序列的線狀單鏈。
由于線性RCA的產(chǎn)物始終連接在起始引物上,所以信號易于固定是它的一大優(yōu)勢。
指數(shù)RCA,也被稱作超分支擴增HRCA(Hyper branched RCA),在指數(shù)RCA中,一條引物擴增出RCA產(chǎn)物,第二條引物與RCA產(chǎn)物雜化并延伸,置換已經(jīng)結(jié)合在RCA產(chǎn)物上的下游引物延伸鏈,反復(fù)進行延伸和置換,產(chǎn)生樹狀的RCA擴增產(chǎn)物。
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以4BaseBio公司的TruePrime滾環(huán)擴增試劑盒為例,使用TthPrimPol引物酶和Phi29DNA聚合酶,實現(xiàn)了無需添加引物即可進行擴增。
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滾環(huán)核酸擴增的優(yōu)勢與不足
RCA 的優(yōu)勢:
靈敏度高,特異性好,易操作。
RCA 的不足:
信號檢測時的背景問題。在RCA反應(yīng)過程中未成環(huán)的鎖式探針和未結(jié)合探針的模板DNA或者RNA 可能產(chǎn)生一些背景信號。
依賴核酸序列的擴增技術(shù)
依賴核酸序列的擴增技術(shù)(nucleicacid sequence-based amplification, NASBA)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù),是由1對帶有T7啟動子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫的核酸擴增技術(shù),可以在2h左右將模板RNA擴增約109倍,比常規(guī)PCR法高1000倍,不需特殊的儀器。
該技術(shù)一出現(xiàn)就被用于疾病的快速診斷,目前有不少公司的RNA檢測試劑盒都用此方法。
盡管RNA的擴增也可以使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),NASBA相比則有自己的優(yōu)勢:可以在相對恒溫的條件下進行,相對傳統(tǒng)的PCR技術(shù)更為穩(wěn)定、正確。
反應(yīng)在41攝氏度下,需要AMV(avian myeloblastosis virus)逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和一對引物來完成。
其過程主要包括:
正向引物包含T7啟動子互補序列,反應(yīng)過程中正向引物與RNA鏈結(jié)合,由AMV酶催化形成DNA-RNA雙鏈。
RNA酶H消化雜交雙鏈中的RNA,保留DNA單鏈。
在反向引物與AMV酶的作用下形成含有T7啟動子序列的DNA雙鏈。
在T7 RNA聚合酶的作用下完成轉(zhuǎn)錄過程,產(chǎn)生大量目的RNA。
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NASBA的優(yōu)勢:
(1)它的引物上帶有T7啟動子序列,而外來雙鏈DNA無T7啟動子序列,不可能被擴增,因此該技術(shù)具有較高的特異性和靈敏度。
(2)NASBA將反轉(zhuǎn)錄過程直接合并到擴增反應(yīng)中,縮短了反應(yīng)時間。
NASBA的劣勢:
(1)反應(yīng)成分比較復(fù)雜。
(2)需要3種酶使得反應(yīng)成本較高。
(責(zé)任編輯:佳學(xué)基因)