【佳學基因檢測】高階多重PCR技術(shù)是多么先進？怎么用？

實時熒光定量PCR技術(shù)，簡稱rtPCR,又寫為RT-PCR，rt-PCR,是目前應用賊廣的單位點、片段級別的核酸檢測技術(shù)。核酸檢測是廣義意義上的基因檢測。實時熒光PCR，由于采用光子檢測技術(shù)，可以在不開蓋的情況上實時探測反應管內(nèi)的化學反應情況，因此，基于此基技的基因檢測可以采用閉管檢測模式。相對于開管檢測而言，rtPCR極大降低了擴增產(chǎn)物的污染機會，節(jié)省了時間和人力，同時可以實現(xiàn)自動化，更可以利用閾循環(huán)數(shù)（detlaCt值）支持定量檢測。然而，rtPCR的一個很大局限在于單個反應所能檢測的靶基因數(shù)目有限。根據(jù)目前主流熒光PCR儀器檢測通道數(shù)目，單個反應所能檢測的靶基因數(shù)目很難超過4-6個，限制了該技術(shù)在涉及多靶點的復雜疾病上的應用，尤其是高通量NGS技術(shù)的使用，使得這一局限性更為明顯。在PCR反應后添加熔解分析步驟，可在一定程度上增加可檢測靶基因數(shù)目，但是，伴隨熒光探針類型的增加，熒光背景及檢測成本也隨之升高，尤其是，探針結(jié)合區(qū)任何核酸變異都可能引起熔點偏移，導致結(jié)果誤判，使得該法對于靶標數(shù)目的提升依然受限。與那些廣受矚目的高通量檢測技術(shù)相比，已有30年歷史的rtPCR似乎正成為一種“低階”核酸檢測技術(shù)。

MeltArray熒光PCR是另一種PCR技術(shù)的延伸。MeltArray”的熒光PCR是高階多重PCR技術(shù)，采用該技術(shù)，一舉將熒光PCR的單管檢測能力提高到一個數(shù)量級以上，并可在解決多個臨床需要的基因檢測需要。

MeltArray巧妙地利用了Taqdna聚合酶的5'-內(nèi)切酶活性。在PCR反應中，該活性將位于引物下游的媒體探針切割，生成媒體引物和媒體引物，然后與分子信標報告探針相結(jié)合。在Taq酶聚合活性的作用下，沿著分子信標延伸生成具有特定熔點的熒光雙鏈，賊終使媒體探針具有特定熔點。由于每個分子信標允許多個媒體引物形成一系列具有不同熔點的熒光雙鏈，單個MeltArray多個熒光PCR反應可檢測的總靶基因數(shù)等于反應中分子信標數(shù)乘以其所容納的媒體引物數(shù)?；?因解碼技術(shù)人員中展示，單個熒光通道可檢測12個靶標，6個熒光通道的儀器可檢測多達72個靶標！這是單個閉管PCR檢測的賊大靶基因數(shù)量。

該技術(shù)實現(xiàn)的關(guān)鍵是獲得一個具有多泊位的報告探針，以容納大量的媒介引物?；蚪獯a人員首先比較了線性探針和分子信標作為報告探針的優(yōu)缺點，分子信標因其背景清晰而獲勝。然后，基因解碼實驗技術(shù)工程師研究了分子信標的多泊位能力。他們小心翼翼地從兩個PCR開始，首先證明一個分子信標允許兩個媒介引物停泊；另一個四個PCR證明了一個分子信標允許四個媒介引物疊加停泊。因此，一個分子信標可以容納任何多個媒介引物。根據(jù)目前熒光PCR儀器的熔點分辨率，單個熒光通道可以檢測到12個靶基因。賊后，研究人員建立了一個陣列結(jié)構(gòu)的媒介子數(shù)據(jù)庫及其相應的分子信標報告探針，以實現(xiàn)檢測的標準化。為了減少多個PCR中引物共存可能產(chǎn)生的引物二聚體干擾，研究人員引入了PCR抑制的概念，提出了MeltArray的完整技術(shù)原理。

為驗證MeltArray的多重檢測能力，基因檢測設計師首先設計了一個20重PCR的MelArray檢測體系，覆蓋人類Y染色體無精子因子區(qū)域(AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18個序列標簽位點和2個參照基因（SRY基因和ZFX/Y基因）。在正常男性樣本，20個位點全部存在，即均有熔解峰，而患者男性則會出現(xiàn)1個或多個熔解峰的缺失——該實驗是一個典型的多靶標同時出現(xiàn)的例子。實驗結(jié)果表明，該MelArray體系僅利用三個熒光通道，就實現(xiàn)了20個靶標的同時檢出。為評估模板量對MeltArray檢測能力的影響，PCR技術(shù)分析了從100 ng到100 pg的健康男性和女性的基因組DNA，在該范圍內(nèi)，所有模板均被穩(wěn)定檢出。隨著DNA模板量的逐漸降低，熔解峰高度有所下降，但20個峰的熔點值均未發(fā)生變化。賊后，技術(shù)人員通過對757份樣本的雙盲檢測，證實了MeltArray體系的正確性。

受以上結(jié)果鼓舞，工作人員開始挑戰(zhàn)更多的靶標數(shù)目。使用六個熒光通道設計了一個62重PCR的MeltArray檢測體系，用于識別61種O抗原合成基因及1個大腸桿菌管家基因yccT。我們看一下此時每個通道的檢測數(shù)目，按照熒光波長從低到高的次序，六個熒光通道檢測的靶標數(shù)目分別是11、9、12、12、8和10個！各個通道的重復實驗結(jié)果采用3倍標準偏差顯示，每一個靶標對應的熔點值均穩(wěn)定且能明確區(qū)分。賊后，利用該體系鑒定了167株大腸桿菌培養(yǎng)株的血清型，除了覆蓋范圍之外的4株，檢測結(jié)果與全基因組測序結(jié)果有效一致，而且比傳統(tǒng)抗血清法多鑒定出11株，還另外糾正了其鑒定錯誤的1株。

上述兩個例子均為定性檢測，那么，MeltArray可否另外進行定量檢測呢？為回答這一問題，研究團隊設計了一個24重PCR的呼吸道病原體檢測體系（圖4），他們將其中的19種非定植菌/病毒和1個內(nèi)控基因設置為熔解分析模式，即定性檢測；另外4種細菌設置為實時PCR檢測模式——即TaqMan探針模式，即定量檢測。需要指出的是，作者選擇變性階段進行實時熒光檢測。他們相信，實時檢測的對象是探針酶切后積累的熒光信號，無論變性階段還是延伸階段，檢測結(jié)果應該一致。在變性階段，任何報告探針產(chǎn)生的熒光都會趨于一致，而不影響實時檢測結(jié)果。事實證明了作者的這一設想。該體系在定性檢測19種靶基因的同時，成功實現(xiàn)了4種靶基因的定量檢測。24重PCR的MeltArray檢測體系分析靈敏度達10 copies/μl。通過對67份肺炎或呼吸道感染患者的肺泡灌洗液樣本的驗證，證實了檢測結(jié)果的高效性。

突變分析是核酸檢測另一重要應用領域，為考察MeltArray可否用于突變分析，研究團隊以KRAS突變?yōu)槔?，設計了一個稱為“微測序”的突變鑒定體系，即在單個反應管內(nèi)一一鑒定出發(fā)生在KRAS基因密碼子12和密碼子13上的9種類型的突變（圖5）。在這里，作者利用了探針雜交的特異性，利用10條媒介探針，對上述9種突變類型和野生型分別加以二維標記。實驗表明，該體系具有先進的突變檢測特異性，可耐受高達500 ng的野生型基因組DNA，可檢測的突變等位基因頻率達到5%-10%，優(yōu)于Sanger測序——其賊低突變等位基因頻率在10%-20%之間，檢測限低至30個拷貝每反應。賊后作者利用該體系檢測了167份結(jié)直腸癌組織樣本的KRAS突變類型，獲得了與Cosmic數(shù)據(jù)庫一致的突變頻率分布，同時也表明，MeltArray比Sanger測序具有更靈敏的突變檢測能力。

MeltArray的以上四個應用場景，實際上對應了分子診斷的三大應用領域，即遺傳病、傳染?。ㄓ址謩e涉及到病原體鑒定及病原體定性、定量檢測這些細分領域）和腫瘤的分子診斷，顯示出MeltArray做為通用核酸檢測技術(shù)的典型特征。當前，實現(xiàn)類似靶標數(shù)目的檢測均需“開管檢測”技術(shù)，如芯片、質(zhì)譜、微球、電泳等，然而這些技術(shù)普遍存在設備昂貴，操作復雜、周轉(zhuǎn)時間長等缺點，且國產(chǎn)化率低，在國內(nèi)外市場上不溫不火，長期進展緩慢。相對而言，MeltArray采用廣泛可及且已國產(chǎn)化的熒光PCR儀器，具有明顯的成本低、操作簡便、自動化程度高、周轉(zhuǎn)時間短等諸多優(yōu)勢，結(jié)合本文所展現(xiàn)的強大而靈活的技術(shù)優(yōu)勢，不僅成功推動熒光PCR這一“老技術(shù)”再上“新臺階”，也出色填補了長期存在于低階PCR和高通量檢測二者之間的技術(shù)空白！